對(duì)KOA模型大鼠血清、 膝關(guān)節(jié)肌肉和滑膜組織的SERS分析

王璐璐， 劉 磊， 李 盼， 王 潔， 何 璐， 吳子建， 楊良保， 胡 玲

1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院， 安徽 合肥 230012 2. 中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院， 安徽 合肥 230031 3. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院， 安徽 合肥 230012 4. 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院針灸經(jīng)絡(luò)研究所， 安徽 合肥 230038

引 言

膝骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis, KOA)是一種主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛和活動(dòng)障礙的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病， 也是全球公認(rèn)的主要致殘?jiān)蛑唬?也與精神心理疾病、 心血管疾病等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)， 近年來更有年輕化的趨勢[1-3]。 在我國， 由于KOA發(fā)病過程不可逆且隨人口老齡化對(duì)人口結(jié)構(gòu)特征的改變， KOA發(fā)病數(shù)呈遞增趨勢， 這種發(fā)病趨勢將給社會(huì)帶來巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。 當(dāng)前的KOA診斷主要依靠癥狀和影像學(xué)方法， 雖然有代謝組學(xué)研究表明KOA患者滑膜組織液的支鏈氨基酸和精氨酸表達(dá)增多[4-5]， 但仍缺乏特異性的生物標(biāo)記物檢測方法， 尤其是對(duì)早期的病程診斷存在局限性， 因此臨床也在積極尋求更加簡便快捷的診斷方法[6-7]。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscope， SERS)技術(shù)是一種可以快速分析檢測的方法， 能夠提供豐富的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)信息， 具有高靈敏度、 高選擇性、 攜帶方便、 受水和熒光信號(hào)干擾小等優(yōu)點(diǎn)， 而廣泛應(yīng)用于生化、 物理等領(lǐng)域[8-10]， 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也處于發(fā)展應(yīng)用的階段[11]， 例如SERS探針的不斷發(fā)展與優(yōu)化， 增強(qiáng)了多元化檢測的能力， 實(shí)現(xiàn)了DNA分子檢測、 細(xì)胞內(nèi)特定生物分子定位檢測、 細(xì)胞和組織的雙重成像等生物標(biāo)記檢測， 用于識(shí)別單個(gè)癌細(xì)胞， 確定體內(nèi)的腫瘤定位及檢測[12]。 目前， 通過對(duì)人體唾液進(jìn)行SERS分析， 有助于對(duì)常見的鼻咽癌、 胃癌、 肝癌、 乳腺癌、 宮頸癌等多種癌癥進(jìn)行早期簡便快速診斷[13]。 在KOA的應(yīng)用中仍較少， 一項(xiàng)關(guān)于KOA患者關(guān)節(jié)滑膜積液的初步研究表明， SERS具有輔助關(guān)節(jié)炎的分級(jí)診斷應(yīng)用潛力[14]。

本工作前期觀察了KOA模型大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨超微結(jié)構(gòu)變化[15]， 并分析了膝關(guān)節(jié)組織液、 滑膜的炎性因子表達(dá), 但對(duì)血清、 滑膜組織和膝關(guān)節(jié)局部肌肉組織的生物化學(xué)物質(zhì)的變化研究相對(duì)不足， 通過比較分析正常大鼠與KOA模型大鼠血清、 膝關(guān)節(jié)肌肉和滑膜組織的SERS變化， 以期為KOA生物學(xué)改變和臨床診斷治療應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

同條件普食喂養(yǎng)普通級(jí)健康雄性SD大鼠20只[購自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 許可證號(hào)： scxk(皖)2011-002]， 體質(zhì)量為(250±20) g， 隨機(jī)分為正常組、 模型組， 每組10只。 實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵循中華人民共和國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 儀器與試劑

拉曼光譜儀(美國奧林巴斯公司， 型號(hào)： BX41)； -80 ℃冰箱(大連三洋冷鏈有限公司， 型號(hào)： MDF-382E(CN) )； 低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司， 型號(hào)： SC-3610)； 電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司， 型號(hào)： BSA124S)； 微量移液器(德國Eppendorf公司， 型號(hào)： 0.5-10ul)； 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司， 型號(hào)： JY92)。

0.9%氯化鈉注射液(安徽雙鶴藥業(yè)有限公司， 批號(hào)： H34023609)； 75%消毒酒精(合肥市盛杰生物制品有限公司， 批號(hào)： 20140107)； 碘伏(山東華魯制藥有限公司， 批號(hào)： 151002)； 水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司， 批號(hào)： 20180305)； L-半胱氨酸(上海源葉生物科技有限公司， 批號(hào)： H23O8H46139)； 木瓜蛋白酶(上海源葉生物科技有限公司， 批號(hào)： P08A9B67156)。

1.3 模型復(fù)制及評(píng)價(jià)

1.3.1 模型復(fù)制

實(shí)驗(yàn)采用10%水合氯醛麻醉大鼠， 用量為0.3 mL/100 g。 參考文獻(xiàn)[8]方法將配置好的0.03 mol·L-1的L-半胱氨酸與4%木瓜蛋白酶以1∶2比例混合， 置常溫下30 min后對(duì)大鼠進(jìn)行膝關(guān)節(jié)腔注射。 在實(shí)驗(yàn)第1， 4和7 d分別麻醉固定大鼠， 剃左膝關(guān)節(jié)周邊1 cm區(qū)域的毛， 消毒脫碘， 屈曲45°后從髕骨下髕腱外緣為進(jìn)針點(diǎn)向髁間窩方向進(jìn)針， 至股骨髁后回撤2 mm后注射0.15 mL混合溶液誘導(dǎo)左膝骨關(guān)節(jié)炎模型， 右膝不注射。

1.3.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①造模4周后大鼠出現(xiàn)左膝關(guān)節(jié)腫脹； ②造模4周后大鼠左后肢關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)受損； ③造模4周后大鼠步態(tài)改變。 符合以上標(biāo)準(zhǔn)大鼠納入研究范圍。

1.3.3 剔除標(biāo)準(zhǔn)

①模型復(fù)制中死亡者剔除； ②模型復(fù)制后未出現(xiàn)關(guān)節(jié)局部腫脹、 活動(dòng)障礙或步態(tài)改變等任何KOA癥狀者剔除。

1.4 取材與檢測

1.4.1 樣本留取

正常組與KOA模型組大鼠于KOA 模型復(fù)制4周后一同取材。

血清： 大鼠麻醉后用無抗凝劑真空采血管采集大鼠腹腔動(dòng)脈血5 mL。

膝關(guān)節(jié)肌肉與滑膜組織： 碘伏消毒大鼠膝骨關(guān)節(jié)處再用酒精脫碘， 剪開皮膚， 暴露大鼠左膝骨關(guān)節(jié)處肌肉以手術(shù)刀切取膝關(guān)節(jié)外側(cè)肌肉1 cm3大小， 沿髕骨上沿約0.3～0.4 cm處向下切割并沿著兩側(cè)分離至脛骨取下滑膜組織， 生理鹽水沖洗、 液氮研磨、 超聲碎解、 勻漿。

血液樣本及肌肉和滑膜組織勻漿后均以4 ℃， 3 000 r·min-1離心20 min， 提取上清液后液氮速凍， 置于-80 ℃低溫冰箱待測。

1.4.2 SERS檢測

取銀納米基底液1 mL， 3 000 r·min-1離心15 min， 提取離心后的納米銀基底液底物至特制硅片格板上制備SERS基底片。 梯度復(fù)溫待測樣本各取20 μL移至制備后的基底片上， 采用 BX41拉曼光譜儀對(duì)各樣本進(jìn)行檢測分析， 參數(shù)設(shè)置為激發(fā)功率2.5 mW、 50倍長焦的633和785 nm激光， 光圈為100 μm， SERS光譜范圍為400～2 000 cm-1。 對(duì)各組樣本采用隨機(jī)選擇激光照射點(diǎn)多次檢測， 將得到的各組拉曼光譜圖匯總， 因隨機(jī)選擇激光照射點(diǎn)， 故在對(duì)各組拉曼光譜進(jìn)行進(jìn)一步對(duì)比分析前， 需先排除因物質(zhì)濃度差異而導(dǎo)致的異常光譜， 選擇具有穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)進(jìn)行糾偏和基線歸一等處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有光譜數(shù)據(jù)均以NGLab Spec分析軟件進(jìn)行分析得出數(shù)據(jù)(SERS數(shù)據(jù)對(duì)比數(shù)據(jù)庫， 統(tǒng)計(jì)分析)， Origin Pro 8.5軟件分析及繪制拉曼光譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 透射電鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨超微結(jié)構(gòu)

在透射電鏡(×20 000)下示， 正常組大鼠關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞為卵圓形， 細(xì)胞膜和細(xì)胞顯示完整， 細(xì)胞表面有較多突起微絨毛， 細(xì)胞核完整且核膜清晰， 染色質(zhì)均勻， 胞質(zhì)內(nèi)線粒體、 高爾基復(fù)合體和豐富且排列整齊的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)， 圖1(a)； 模型組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則， 胞質(zhì)內(nèi)見數(shù)個(gè)大體積脂滴， 細(xì)胞核裂解， 線粒體、 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器消失、 溶解， 游離核糖體顯著減少， 圖1(b)。

圖1 大鼠模型復(fù)制成功關(guān)節(jié)軟骨對(duì)比圖

2.2 正常組與模型組比較

2.2.1 兩組大鼠血清SERS分析

正常組大鼠血清的表面增強(qiáng)拉曼光譜圖中， 拉曼頻移400～2 000 cm-1區(qū)間出現(xiàn)特征峰的峰位為495， 635， 725， 810， 883， 1 010， 1 130， 1 200， 1 375， 1 447， 1 560和1 670 cm-1等12個(gè)。

模型組大鼠血清的表面增強(qiáng)拉曼光譜圖中， 拉曼頻移400～2 000 cm-1區(qū)間出現(xiàn)的特征峰主要為635， 783， 810， 883， 1 000， 1 052， 1 130， 1 200， 1 230， 1 310， 1 375， 1 447， 1 530和1 600 cm-1等14個(gè)。

圖2 正常組(a)， 模型組(b)大鼠血清SERS光譜圖， 正常與模型組疊加圖(c)

正常組在495， 725和883 cm-1等處出現(xiàn)較為尖銳且模型組表現(xiàn)不明顯的特征峰， 表明在KOA模型大鼠血清中以上物質(zhì)出現(xiàn)特異性變化； 其中495和883 cm-1兩處的特征峰差異明顯， 此類物質(zhì)在KOA模型大鼠血清中的含量顯著降低, 或可作為KOA血清診斷標(biāo)志物之一。 模型組在783 cm-1處出現(xiàn)正常組沒有的尖銳譜峰， 故認(rèn)為該處對(duì)應(yīng)物質(zhì)可作為KOA的血清生物標(biāo)志之一。 兩組同質(zhì)性的特征峰的強(qiáng)度差異亦顯而易見， 主要體現(xiàn)在635， 810， 883， 1 130， 1 200～1 210， 1 375和1 447 cm-1等峰位。

圖3 兩組大鼠膝關(guān)節(jié)肌肉組織SERS光譜圖

2.2.2 兩組大鼠膝關(guān)節(jié)肌肉組織SERS分析

正常組膝關(guān)節(jié)肌肉組織SERS譜見圖3(a,b,c)， 主要特征峰在656， 720， 790， 950， 1 025， 1 090， 1 237， 1 330， 1 365， 1 447， 1 580和1 690 cm-1等12個(gè)。

模型組肌肉組織的拉曼頻移為560， 656， 720， 950， 1 025， 1 090， 1 125， 1 237， 1 330， 1 365， 1 447， 1 580和1 690 cm-1等13個(gè)出現(xiàn)較為明顯的特征峰。

圖4 正常組與模型組膝關(guān)節(jié)滑膜組織SERS光譜圖

正常組在620， 790和1 025 cm-1等三處特征峰的峰強(qiáng)明顯高于模型組， 顯示此三類物質(zhì)在模型組中含量降低。 與正常組比較， 模型組在656， 720， 950， 1 125， 1 237， 1 330， 1 447， 1 580和1 690 cm-1等為代表的多處同質(zhì)性特征峰表現(xiàn)相對(duì)含量顯著升高， 故推測這些物質(zhì)是由于關(guān)節(jié)炎引起的局部肌肉中代謝產(chǎn)物和炎性產(chǎn)物的積累， 可能是造成局部紅腫疼痛的原因之一。

2.2.3 兩組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織SERS分析

正常大鼠左膝關(guān)節(jié)滑膜組織的拉曼光譜特征峰主要位于655， 720， 820， 950， 1 100， 1 240， 1 335， 1 447， 1 580和1 680 cm-1等10個(gè)位置。

模型組大鼠左膝關(guān)節(jié)滑膜組織的拉曼光譜特征峰主要位于445， 570， 655， 780， 820， 920， 950， 1 020， 1 100， 1 150， 1 270， 1 335， 1 447， 1 610和1 660 cm-1等15個(gè)位置。

與正常組比較， 模型組滑膜組織中在656， 720， 920， 950， 1 240， 1 335和1 447 cm-1等處表現(xiàn)出峰強(qiáng)的明顯差異， 提示KOA模型大鼠滑膜組織的物質(zhì)種類有明顯變化。 且在656和950 cm-1處為模型組的相對(duì)含量顯著升高， 可能是造成局部紅腫疼痛的原因之一； 720 cm-1(應(yīng)為多糖)、 1 335和1 447 cm-1處的相對(duì)強(qiáng)度為KOA模型組模型組顯著降低， 推測是關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致軟骨能量代謝失衡， 可能是造成關(guān)節(jié)軟骨組織損傷的原因之一。 正常組與模型組在780， 1 240和1 447 cm-1等處表現(xiàn)為差異性特征峰。

3 結(jié) 論

通過檢測分析正常大鼠與KOA模型大鼠的血清、 膝關(guān)節(jié)肌肉組織和滑膜組織的SERS特征峰， 發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正常組大鼠， 模型組三種樣本的物質(zhì)成分和含量均發(fā)生了明顯的改變， 血清的峰強(qiáng)出現(xiàn)下降， 而滑膜組織和膝關(guān)節(jié)肌肉組織峰強(qiáng)上升， 同時(shí)三者的同質(zhì)性特征峰數(shù)量顯著減少， 差異性物質(zhì)增多， 表明KOA模型大鼠的膝關(guān)節(jié)滑膜、 肌肉和血清之間的物質(zhì)代謝平衡被嚴(yán)重打破。

通過本實(shí)驗(yàn)分析認(rèn)為， 在KOA模型大鼠血清、 膝關(guān)節(jié)肌肉組織和滑膜組織中發(fā)現(xiàn)了與正常大鼠不同的特征峰， 明確了KOA中存在的代謝物質(zhì)紊亂， 發(fā)現(xiàn)了潛在的血清生物學(xué)標(biāo)志物。 與其他檢測分析方法相比， SERS光譜學(xué)分析能夠有效地攻克傳統(tǒng)微弱拉曼光譜信號(hào)的問題， 極大地提高了拉曼散射強(qiáng)度和檢測的靈敏度； 隨著設(shè)備技術(shù)的發(fā)展， 拉曼光譜儀已經(jīng)可以便攜使用， 操作簡單快捷， 能夠?yàn)榕R床快速診斷提供幫助， 也為下一步開展干預(yù)KOA效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究提供了參考。