峨眉山野生金蟬花孢梗束培養(yǎng)試驗(yàn)

李燕秋， 賀小麗， 莊在非， 賀新生

(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 生物工程系，四川 綿陽(yáng) 621010)

金蟬花Cordycepscicadae(Hill ex Watson) G.H. Sung, J.M. Sung, Hywel-Jones & Spatafora, in Sung, Hywel-Jones, Sung, Luangsa-ard, Shrestha & Spatafora,Stud.Mycol.57: 46 (2007)。分類(lèi)學(xué)地位屬于真菌界，子囊菌門(mén)，盤(pán)菌亞門(mén)，糞殼菌綱，肉座菌亞綱，肉座菌目Hypocreales，線(xiàn)蟲(chóng)草科，線(xiàn)蟲(chóng)草屬。金蟬花在藥用和食療等方面具有顯著成效，是我國(guó)三大蟲(chóng)生真菌之一。最新研究表明，金蟬花具有提高免疫力、解熱鎮(zhèn)痛、改善睡眠以及抗腫瘤、抗輻射、降血糖等重要作用[1-3]，適宜免疫力低下和身體亞健康等人群。隨著野生金蟬花資源的日趨減少，人工培育金蟬花顯得尤為重要。人工培育的金蟬花中人體必需氨基酸、蛋白質(zhì)等有效成分含量超過(guò)野生金蟬花[3-5]，人工培育的金蟬花所具有的保健效果比野生金蟬花更好，且人工培育的金蟬花所受限制少許多，能大規(guī)模的產(chǎn)出[3]，可以作為新的保健品進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 金蟬花(Cordycepscicadae)XKD-1，原始標(biāo)本采自四川省峨眉山后山竹林，通過(guò)分生孢子分離、純化得到純菌種，菌株保存在西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試材料 馬鈴薯、麩皮、大米、小米、玉米、小麥、黃豆、綠豆、紅豆。

1.1.3 培養(yǎng)基 查閱文獻(xiàn)選用蛋白胨-葡萄糖-酵母膏培養(yǎng)基、可溶性淀粉-酵母膏培養(yǎng)基、玉米粉-酵母膏培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、 Richard培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基[6]6種瓊脂培養(yǎng)基配方。其中非常規(guī)培養(yǎng)基配方：①蛋白胨-葡萄糖-酵母膏培養(yǎng)基：蛋白胨5 g,葡萄糖10 g,酵母膏1 g；②可溶性淀粉-酵母膏培養(yǎng)基：可溶性淀粉15 g,酵母膏4 g,KH2PO41 g,MgSO4·7H2O 0.5 g； ③玉米粉-酵母膏培養(yǎng)基：玉米粉10 g,酵母膏1 g,蔗糖5 g。

1.1.4 試劑及儀器設(shè)備 蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、酵母膏、可溶性淀粉、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、KCl、FeSO4，本研究所用試劑均為化學(xué)純；高壓滅菌鍋(DT-8L，山東德天環(huán)保設(shè)備有限公司)，大容量電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-1000，一恒儀器)，超凈工作臺(tái)(DL-CJ-1NDII，北京東聯(lián)哈爾儀器)。

1.2 方法

1.2.1 瓊脂培養(yǎng)基配方的篩選 取各配方培養(yǎng)基25 mL于100 mL三角瓶中，用封口膜密封，121 ℃滅菌30 min。待培養(yǎng)基表面冷凝水較少后將金蟬花分生孢子在培養(yǎng)基表面接種。25 ℃恒溫培養(yǎng)，菌絲完全覆蓋培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)為室溫培養(yǎng)，重復(fù)5次。觀察記錄孢梗束的發(fā)育時(shí)間以及生長(zhǎng)狀況。

1.2.2 天然原料單因素試驗(yàn) 用天然原料大米、小米、玉米、黃豆、綠豆、紅豆各20 g裝入450 mL聚丙烯盒中，各加水20 mL，封口滅菌接種培養(yǎng)，各重復(fù)6次。

1.2.3 天然原料均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化配方試驗(yàn) 對(duì)大米、小米、玉米等6種原材料采用均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)的方式進(jìn)行配方設(shè)計(jì)(見(jiàn)表1)。按配方配制各參數(shù)質(zhì)量減半的培養(yǎng)料，用300 mL的聚丙烯盒裝料，每盒裝30 g干料，料水比為1∶ 1，封口膜封口后滅菌，待培養(yǎng)基冷卻到室溫后接種培養(yǎng)。每組培養(yǎng)基重復(fù)6次。當(dāng)培養(yǎng)料表面被菌絲覆蓋滿(mǎn)3～5 d后，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至室溫培養(yǎng)，足夠的晝夜溫差刺激孢梗束發(fā)育。觀察記錄菌絲的生長(zhǎng)速度、金蟬花孢梗束發(fā)育的時(shí)間和孢梗束的生長(zhǎng)狀況。

表樣品均勻設(shè)計(jì)表

1.2.4 成分含量測(cè)定 委托上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部食用菌質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心對(duì)孢梗束中蛋白質(zhì)、氨基酸、粗多糖、腺苷、蟲(chóng)草酸等成分進(jìn)行測(cè)試。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂培養(yǎng)基中金蟬花菌絲體和孢梗束生長(zhǎng)的情況

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，培養(yǎng)基組分不同對(duì)金蟬花的菌絲長(zhǎng)速以及孢梗束的生長(zhǎng)存在明顯差異，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的不同直接影響金蟬花孢梗束的產(chǎn)生和生長(zhǎng)。以天然原料作為主要營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，菌絲覆蓋率較高，但均無(wú)金蟬花孢梗束產(chǎn)生。無(wú)機(jī)鹽作為主要營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度較快，菌絲覆蓋率均較低，菌絲后期顏色為黃色，比天然原料作為主要營(yíng)養(yǎng)成分時(shí)較深，但均有孢梗束的產(chǎn)生。在實(shí)際工廠生產(chǎn)應(yīng)用中，采用無(wú)機(jī)鹽配方成本較高，操作繁瑣。因而考慮對(duì)其他有機(jī)物進(jìn)行試驗(yàn)，探究其能否培育出金蟬花孢梗束。

2.2 天然原料單因素試驗(yàn)

由表3可以看出，當(dāng)以大米為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，金蟬花孢梗束出芽時(shí)間最快，10 d就可以長(zhǎng)出金蟬花孢梗束，孢梗束生長(zhǎng)速度最快，為1.0 mm/d，培育出的金蟬花孢梗束高度最高，為12 cm，品相最好，呈針狀，培育出的金蟬花孢梗束數(shù)量最多，適合工業(yè)化培養(yǎng)。以豆類(lèi)為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的金蟬花培養(yǎng)基培育出的金蟬花出芽時(shí)間都較長(zhǎng)，金蟬花孢梗束成團(tuán)簇狀或樹(shù)杈狀生長(zhǎng)，并且孢梗束較少，高度較低，不適于工業(yè)化培養(yǎng)。

表2 常用金蟬花培養(yǎng)基對(duì)金蟬花菌絲體和孢梗束生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of commonly used culture medium of Cordyceps cicadaeon the growth of mycelium and fasciculus of Cordyceps cicadae

表3 單因素金蟬花生長(zhǎng)情況

2.3 均勻設(shè)計(jì)配方的優(yōu)化試驗(yàn)

均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，由優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出10號(hào)培養(yǎng)基試驗(yàn)為最好。不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組合的培養(yǎng)基對(duì)金蟬花產(chǎn)孢梗束時(shí)間以及孢梗束形狀等影響較大。根據(jù)表4可得到以下結(jié)論：①除11號(hào)配方和6號(hào)配方以外，金蟬花孢梗束產(chǎn)生時(shí)間基本在20 d左右；②孢梗束產(chǎn)生后20 d左右開(kāi)始產(chǎn)孢子，菌體生長(zhǎng)狀況穩(wěn)定；③菌體培養(yǎng)過(guò)程中，約50%的金蟬花出現(xiàn)菌絲貼壁狀況，且6號(hào)配方、12號(hào)配方金蟬花菌絲貼壁嚴(yán)重；④天然原料混合的培養(yǎng)基培養(yǎng)的金蟬花孢梗束相較于單一原料的培養(yǎng)基培養(yǎng)出的金蟬花孢梗束更矮，并且混合培養(yǎng)基培養(yǎng)的金蟬花孢梗束更寬；⑤混合培養(yǎng)基培養(yǎng)的金蟬花孢梗束形狀主要以珊瑚狀和團(tuán)簇狀為主，針狀孢梗束少；去掉整齊可比性，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表5。

回歸方程：y=-0.013+0.007×玉米-0.020×小米+0.050×紅豆-0.034×綠豆+0.038×大米+0.047×黃豆。其中紅豆和黃豆比較P<0.05，有顯著性差異，表示自變量紅豆和黃豆對(duì)因變量收率的解釋力或預(yù)測(cè)力正相關(guān)。

分析標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)Beta值可得，紅豆對(duì)收率影響最大，玉米對(duì)收率影響最小。

2.4 混合配方中金蟬花孢梗束形態(tài)的多樣性

由于培養(yǎng)基中物質(zhì)組成不同，金蟬花呈現(xiàn)不同的孢梗束形態(tài)，主要孢梗束形態(tài)為珊瑚狀，即孢梗束成簇生長(zhǎng)，該形態(tài)的孢梗束產(chǎn)量較高，采收方便。珊瑚狀的孢梗束比其他形態(tài)的金蟬花孢梗束更易產(chǎn)生孢子，并且珊瑚狀的孢梗束形態(tài)多變。

表4 優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

表5 變異數(shù)分析

表6 回歸系數(shù)結(jié)果

以大米為主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的配方中金蟬花孢梗束呈現(xiàn)針尖狀，菌體形態(tài)較好。在后續(xù)的培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)該種形態(tài)的孢梗束產(chǎn)生的孢子主要集中在針尖，并且較其他形態(tài)的孢梗束而言，針尖狀孢梗束產(chǎn)孢子較晚，孢子少。

部分培養(yǎng)基上會(huì)長(zhǎng)出團(tuán)狀和花菜狀兩種形態(tài)的孢梗束。團(tuán)狀孢梗束在生長(zhǎng)前期是白色的菌絲團(tuán)；生長(zhǎng)中期會(huì)長(zhǎng)出較短、較小的金蟬花孢梗束；隨著后續(xù)的培養(yǎng)，菌絲團(tuán)上面的孢梗束并不會(huì)長(zhǎng)大，但是會(huì)增多。一般來(lái)說(shuō)，一種培養(yǎng)基里可能出現(xiàn)3～4個(gè)團(tuán)狀的孢梗束。在最后的孢梗束采收時(shí)發(fā)現(xiàn)團(tuán)狀的孢梗束內(nèi)部幾乎全是孢子。

花菜狀孢梗束形態(tài)和團(tuán)狀孢梗束類(lèi)似，區(qū)別在于花菜狀孢梗束在生長(zhǎng)過(guò)程中一直處于菌絲團(tuán)的形態(tài)，并不會(huì)產(chǎn)生明顯的孢梗束，在生長(zhǎng)后期，菌絲團(tuán)的頂部會(huì)冒出類(lèi)似于孢梗束的芽狀物質(zhì)?；ú藸铈吖Ｊ^大。

樹(shù)枝狀孢梗束在培養(yǎng)過(guò)程中比較少見(jiàn)，樹(shù)枝狀孢梗束在培養(yǎng)前期呈厚片狀生長(zhǎng)，中期逐漸呈樹(shù)枝狀分叉生長(zhǎng)，后期孢子布滿(mǎn)整株孢梗束。

在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，除孢梗束形態(tài)不同以外，金蟬花孢梗束的產(chǎn)生和生長(zhǎng)情況隨培養(yǎng)環(huán)境變化而變化，在轉(zhuǎn)入罐頭瓶培養(yǎng)后，金蟬花孢梗束貼壁生長(zhǎng)情況比在錐形瓶培養(yǎng)更嚴(yán)重，可能原因是罐頭瓶中的空間更大。孢梗束貼壁生長(zhǎng)分為兩種情況：一種是金蟬花培養(yǎng)前期菌絲貼壁生長(zhǎng)，之后轉(zhuǎn)為片狀孢梗束貼壁生長(zhǎng)；另一種是金蟬花菌絲貼壁后轉(zhuǎn)為片狀孢梗束，其頂部長(zhǎng)出針狀孢梗束。

除此之外，金蟬花孢梗束在不同的培養(yǎng)基中往往呈現(xiàn)孢梗束混雜生長(zhǎng)的情況，在混合培養(yǎng)基中，金蟬花通常呈現(xiàn)兩種或者三種孢梗束形態(tài)。

圖1 孢梗束形態(tài)多樣性Fig.1 Morphological Diversity of pedicel bundlesA：珊瑚狀孢梗束；B：珊瑚狀孢梗束產(chǎn)孢；C：針狀孢梗束；D：針狀孢梗束產(chǎn)孢；E：團(tuán)狀孢梗束；F：花菜狀孢梗束；G：樹(shù)枝狀孢梗束；H：樹(shù)枝狀孢梗束產(chǎn)孢；I：菌絲貼壁后轉(zhuǎn)為片狀孢梗束貼壁；J：菌絲貼壁后長(zhǎng)針狀孢梗束；K：孢梗束形態(tài)混雜；L：孢梗束形態(tài)混雜A： coralliform fasciculus; B： coralliform fasciculus sporulation; C： acicular fasciculus; D： acicular fasciculus sporulation; E： agglomerate fasciculus; F： cauliflower fasciculus; G： dendrimer fasciculus; H： dendrimer fasciculus sporulation; I： the hypha adheres to the wall and then turns to the lamellar fasciculus; J： the hypha adheres to the wall and then the long acicular fasciculus; K： The fasciculus morphology is mixed; L： the fasciculus morphology is mixed

2.5 孢梗束成分分析

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)后得到的孢梗束形態(tài)和數(shù)量來(lái)看，大米培養(yǎng)的孢梗束形態(tài)最好，10號(hào)樣品培養(yǎng)出來(lái)的孢梗束干重最重，小麥培養(yǎng)的孢梗束形態(tài)均為珊瑚狀且數(shù)量較多。將這3份孢梗束送往上海農(nóng)科院對(duì)蟲(chóng)草酸、粗多糖、粗蛋白、氨基酸、腺苷等物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)分析。大米培養(yǎng)的金蟬花孢梗束為1號(hào)樣本，10號(hào)樣品培養(yǎng)的金蟬花孢梗束為2號(hào)樣本，小麥培養(yǎng)的金蟬花孢梗束為3號(hào)樣本。

由表7可以看出，實(shí)驗(yàn)室培育出的金蟬花孢梗束中蛋白質(zhì)含量均比野生金蟬花孢梗束中蛋白質(zhì)含量高，其中2號(hào)、3號(hào)樣品中蛋白質(zhì)含量分別高出22.9%、23.9%；3個(gè)樣品中氨基酸含量都明顯高于野生金蟬花中氨基酸含量，其中3號(hào)孢梗束中氨基酸含量高達(dá)35.2%，比野生金蟬花中氨基酸含量高出近1倍。1號(hào)金蟬花粗多糖與野生金蟬花粗多糖含量相近，2號(hào)及3號(hào)金蟬花中粗多糖含量明顯低于野生金蟬花中粗多糖的含量。1號(hào)、3號(hào)金蟬花中腺苷的含量與野生金蟬花中腺苷含量相近，2號(hào)金蟬花中腺苷含量則明顯低于野生金蟬花中腺苷含量。

表7 實(shí)驗(yàn)室金蟬花與天然金蟬花成分分析

由圖2可以看出，發(fā)酵金蟬花中氨基酸種類(lèi)與野生金蟬花中氨基酸種類(lèi)相同，并無(wú)缺失的氨基酸。發(fā)酵金蟬花中人體必需的氨基酸比例遠(yuǎn)高于野生金蟬花，其中2號(hào)孢梗束中人體必需氨基酸含量最高，可達(dá)12.31%，比野生金蟬花高出6.66%。發(fā)酵金蟬花中，天冬氨酸、酪氨酸和脯氨酸這3種對(duì)人體生理有積極影響的氨基酸含量遠(yuǎn)高于野生金蟬花中該類(lèi)氨基酸的含量。

圖2 金蟬花孢梗束中氨基酸種類(lèi)及含量對(duì)比圖Fig.2 Comparison of amino acid types and contents in pedicel of Chrysosporium

3 討 論

金蟬花瓊脂培養(yǎng)基單一培養(yǎng)物最適合用大米。選用大米作為單一營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源時(shí)最先長(zhǎng)出金蟬花孢梗束，金蟬花孢梗束數(shù)量最多，菌體形態(tài)最好，整體呈針尖狀直立生長(zhǎng)，孢梗束生長(zhǎng)速度最快，適合進(jìn)行規(guī)?；囵B(yǎng)。

金蟬花瓊脂培養(yǎng)基混合培養(yǎng)物以大米與玉米為主。在混合培養(yǎng)基配方中，出現(xiàn)原基最快的有1號(hào)、2號(hào)、5號(hào)和12號(hào)，其中 10號(hào)孢梗束長(zhǎng)速較快，產(chǎn)孢子時(shí)期較晚。從菌體形態(tài)上分析，10號(hào)混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)的金蟬花孢梗束數(shù)量較多，孢梗束呈珊瑚狀生長(zhǎng)，菌體形態(tài)較好，孢梗束成熟快，方便收集和利用，更適合工業(yè)生產(chǎn)與采收。

金蟬花孢梗束形態(tài)多變性與培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，由于培養(yǎng)基的組成以及培養(yǎng)環(huán)境條件的不同，金蟬花孢梗束表現(xiàn)出不同形態(tài)，相同形態(tài)的孢梗束在不同的培養(yǎng)批次中也會(huì)表現(xiàn)出不同的形態(tài)。綜合實(shí)驗(yàn)操作以及培養(yǎng)條件分析，影響金蟬花孢梗束形態(tài)的因素包括溫度、培養(yǎng)基種類(lèi)、培養(yǎng)時(shí)的光照等，希望通過(guò)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)總結(jié)得出金蟬花孢梗束形態(tài)多變的影響因素。

金蟬花中有效成分含量與其原料種類(lèi)和數(shù)量有關(guān)。發(fā)酵金蟬花孢梗束中蟲(chóng)草酸含量較野生低，蛋白質(zhì)、氨基酸等活性物質(zhì)的含量遠(yuǎn)高于野生金蟬花。1號(hào)金蟬花子實(shí)中氨基酸略高于野生金蟬花中氨基酸的含量，蛋白質(zhì)也相較于野生的金蟬花低，粗多糖以及腺苷的含量與野生金蟬花相近，蟲(chóng)草酸的含量低于野生金蟬花。2號(hào)混合培養(yǎng)基培養(yǎng)的金蟬花孢梗束中氨基酸和蛋白質(zhì)遠(yuǎn)高于野生金蟬花，但蟲(chóng)草酸、粗多糖和腺苷的含量遠(yuǎn)低于野生金蟬花。3號(hào)金蟬花孢梗束中氨基酸和蛋白質(zhì)遠(yuǎn)高于野生金蟬花，蟲(chóng)草酸和腺苷的含量與野生金蟬花相持平，粗多糖的含量遠(yuǎn)低于野生金蟬花。

在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，金蟬花在6～35 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，10～20 ℃溫度范圍內(nèi)孢梗束生長(zhǎng)情況最好，濕度要求并不高，在進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)對(duì)濕度的調(diào)整與控制要求不高，由于在錐形瓶中接近于密封培養(yǎng)，因而對(duì)通氣量要求低，在空氣不流通的情況下也能很好生長(zhǎng)。

由于金蟬花孢梗束形態(tài)的多變性，即使是同種培養(yǎng)基也可能產(chǎn)生不同形態(tài)的孢梗束，并且同種形態(tài)的孢梗束隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化也有可能發(fā)生變異等情況。由于金蟬花產(chǎn)率和收率與孢梗束形態(tài)有著密不可分的關(guān)系，因而希望通過(guò)控制孢梗束的形態(tài)來(lái)提高金蟬花的產(chǎn)率和收率。

近年來(lái)，金蟬花的工藝化培養(yǎng)受到人們的廣泛關(guān)注，市場(chǎng)上雖然存在金蟬花規(guī)?；囵B(yǎng)，但對(duì)金蟬花的應(yīng)用更缺乏深入的研究。目前為止，國(guó)內(nèi)對(duì)金蟬花的研究?jī)H限于對(duì)金蟬花中提取的多糖等成分進(jìn)行藥理作用的分析和金蟬花對(duì)人體的相關(guān)影響，以及在中藥配方的應(yīng)用[6，9]。而人工栽培金蟬花主要是依靠液體發(fā)酵蟬擬青霉菌絲體[10]和人工培養(yǎng)固體金蟬花孢梗束兩種技術(shù)，以水稻、小麥等為發(fā)酵基質(zhì)基本實(shí)現(xiàn)金蟬花的栽培[11]。

今后應(yīng)在實(shí)現(xiàn)固體小規(guī)模培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，在大容器里培養(yǎng)金蟬花，使金蟬花孢梗束大量繁殖，易于控制，利用液體菌種培養(yǎng)金蟬花，因?yàn)橐后w菌種培養(yǎng)更易于完成，染菌機(jī)率也大大降低，在菌種收集上有更大的優(yōu)勢(shì)，易形成流水線(xiàn)工廠化生產(chǎn)。