基于高通量測(cè)序的鹿角杯形珊瑚微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)

羅燕秋，黃雯，余克服*，李明，武茜，王英輝，李揚(yáng)，陶永健，陳胤民

(1.廣西大學(xué)珊瑚礁研究中心, 廣西南寧530004;2.廣西南海珊瑚礁研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530004;3.廣西大學(xué)海洋學(xué)院, 廣西南寧530004; 4.廣西大學(xué)林學(xué)院，廣西南寧530004)

0 引言

造礁石珊瑚是低等無脊椎動(dòng)物，生活于熱帶淺海底，在動(dòng)物學(xué)上屬于刺胞動(dòng)物門珊瑚蟲綱六放珊瑚亞綱石珊瑚目，種類繁多[1]。造礁珊瑚與蟲黃藻共生是珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)中最基本的生態(tài)特征，蟲黃藻生活在宿主珊瑚蟲內(nèi)胚層細(xì)胞的液泡中。蟲黃藻隨著環(huán)境的變化而呈現(xiàn)出不同的顏色變化，因此使其宿主珊瑚呈現(xiàn)出不同的色彩[2]。珊瑚—蟲黃藻共生系統(tǒng)是珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，而珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)是地球上重要的生態(tài)景觀和人類最重要的資源之一，具有極高的初級(jí)生產(chǎn)力和豐富的生物多樣性，因此也被形象地稱為“熱帶海洋沙漠中的綠洲”[3]。它不但為海洋生物提供充足的食物和棲息地，而且具有極其重要的防浪護(hù)岸效應(yīng)，保護(hù)海岸線免受潮汐風(fēng)暴的侵蝕，為人類提供安全的生態(tài)環(huán)境[4-5]。但近年來，由于人類活動(dòng)的破壞和環(huán)境的惡化，全球范圍的珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)嚴(yán)重退化，因此，對(duì)珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)工作迫在眉睫。

為了更好地保護(hù)珊瑚礁，對(duì)其遺傳多樣性的研究極其必要，而分子標(biāo)記技術(shù)因其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)，逐漸被應(yīng)用于遺傳多樣性的研究。微衛(wèi)星DNA (microsatellite)作為廣泛分布在真核生物基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)的一種分子標(biāo)記，又稱為簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)[6]，是真核生物基因組重復(fù)序列的主要組成部分。由1～6個(gè)堿基作為重復(fù)單位構(gòu)成，一個(gè)簡單重復(fù)序列的總長度可達(dá)幾十到幾百個(gè)堿基；其分布具隨機(jī)性，每隔一定距離就會(huì)有一個(gè)微衛(wèi)星DNA[7]。因?yàn)槲⑿l(wèi)星標(biāo)記具有豐度高、重復(fù)性好、可靠性高、對(duì)DNA質(zhì)量和數(shù)量要求不高、分布均勻、多態(tài)性高、共顯性表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，符合孟德爾遺傳模式，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于貝類等海洋生物的遺傳多樣性分析和遺傳圖譜的構(gòu)建等方面的工作[8]。關(guān)于珊瑚微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)，只有少量的學(xué)者做了相關(guān)報(bào)道：POLATO等[9]通過開發(fā)9對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記并應(yīng)用于夏威夷群島和鄰島Johnston Atoll之間的基因流模型和種群結(jié)構(gòu)研究，發(fā)現(xiàn)遺傳距離和地理隔離呈正相關(guān)的關(guān)系，符合距離模型。但基因流主要發(fā)生在鄰近夏威夷的環(huán)礁島嶼之間，使整個(gè)群島之間不足以產(chǎn)生固定的種群結(jié)構(gòu)[9]。BAUMS等[10]開發(fā)并應(yīng)用12對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)太平洋中部和東部濱珊瑚的基因流進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)地理環(huán)境已導(dǎo)致了較大程度的海洋生物地理隔離，對(duì)基因流起到阻礙作用[10]。TAY等[11]開發(fā)并應(yīng)用了7對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記，以新加坡附近島嶼和印度尼西亞民丹島嶼的中華扁腦珊瑚為研究對(duì)象探究新加坡海峽對(duì)珊瑚基因流的影響[11]。STARGER等[12]開發(fā)了10對(duì)鹿角杯形珊瑚的微衛(wèi)星引物以解決珊瑚種群遺傳學(xué)問題和探索其生殖方式。我國楊新龍[13]采用磁珠富集法分離尖邊扁腦珊瑚微衛(wèi)星序列合成引物對(duì)4種造礁石珊瑚群體進(jìn)行分析。蘇定佳[14]通過磁珠富集法開發(fā)了7對(duì)叢生盔形珊瑚微衛(wèi)星引物并對(duì)海南和西沙的叢生盔形珊瑚進(jìn)行了遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究。但這些標(biāo)記不足以滿足南海珊瑚群體遺傳學(xué)的研究，我國珊瑚群體間的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性信息依然匱乏，遺傳關(guān)聯(lián)性和進(jìn)化關(guān)系未知，這在很大程度上阻礙了珊瑚礁的科學(xué)保護(hù)和生態(tài)修復(fù)，亟待進(jìn)行更深入的研究。

用傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法如磁珠富集法等開發(fā)珊瑚微衛(wèi)星標(biāo)記，一般會(huì)涉及到多次的引物設(shè)計(jì)，PCR擴(kuò)增以及基因克隆，并且每次的實(shí)驗(yàn)過程中只能針對(duì)一個(gè)標(biāo)記，不但非常繁瑣和耗時(shí)，而且價(jià)格昂貴。另外，由于珊瑚共生蟲黃藻的存在，通過傳統(tǒng)的微衛(wèi)星開發(fā)的方法難以得到較為準(zhǔn)確的珊瑚微衛(wèi)星標(biāo)記。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，簡化基因組測(cè)序技術(shù)得到迅猛的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用。

該技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

①通量高，通過該技術(shù)開發(fā)的標(biāo)記數(shù)量是傳統(tǒng)開發(fā)技術(shù)的10倍；②數(shù)據(jù)利用率高，性價(jià)比高，測(cè)序成本低；③準(zhǔn)確性高，數(shù)字化信號(hào)和高覆蓋度提高其準(zhǔn)確性；④實(shí)驗(yàn)周期性短；⑤不受基因組序列的限制，對(duì)沒有參考基因組的物種也可以進(jìn)行大規(guī)模篩查微衛(wèi)星位點(diǎn)[15]。

因此，它不僅能在一次性實(shí)驗(yàn)過程中獲得數(shù)以萬計(jì)的標(biāo)記，還能普遍應(yīng)用于非模式生物的研究。本研究運(yùn)用簡化基因組測(cè)序技術(shù)(RAD-seq)，利用限制性內(nèi)切酶對(duì)基因組進(jìn)行酶切，產(chǎn)生一定大小的片段，構(gòu)建測(cè)序文庫，對(duì)酶切后產(chǎn)生的RAD標(biāo)記進(jìn)行高通量測(cè)序[16-17]。基于以上測(cè)序結(jié)果，對(duì)鹿角杯形珊瑚進(jìn)行了微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)，了解了鹿角杯形珊瑚微衛(wèi)星分布頻率和數(shù)量，從基因組水平闡明鹿角杯形珊瑚微衛(wèi)星的特征和組成，為更深入的應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對(duì)珊瑚群體遺傳學(xué)進(jìn)行研究，進(jìn)而為更加科學(xué)的保護(hù)和修復(fù)珊瑚礁提供了新的參考和思路。

1 材料與方法

1.1 鹿角杯形珊瑚樣本的獲取

研究所需的鹿角杯形珊瑚樣品來自三亞鹿回頭(18.2176°N，109.4855°E)。采樣點(diǎn)深度4～10 m，用剪刀進(jìn)行取樣，在采樣的同時(shí)把對(duì)珊瑚的傷害降到最小。所采集珊瑚樣品之間的距離大于5 m，盡可能避免在同一珊瑚株系上采集[18]。剪取1～2 cm樣品組織保存在5 mL的離心管，用95 %的酒精固定，置于-20 ℃的冰箱保存。取兩塊約25 cm2的活珊瑚帶水運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，在室內(nèi)模擬系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng)，待其狀態(tài)恢復(fù)。設(shè)置對(duì)照組實(shí)驗(yàn)，一塊珊瑚置于室溫中(水溫26 ℃)繼續(xù)培養(yǎng)[圖1(a)];另一塊珊瑚放在另一個(gè)珊瑚培養(yǎng)缸中，對(duì)其進(jìn)行升溫處理(將加熱棒設(shè)置為32 ℃),觀測(cè)珊瑚顏色變化至顯著變白[圖1(b)],待其變白后，剪取1～2 cm樣品組織并用95 %的酒精固定和保存于2 mL的離心管，利用TIANGEN(天根生化科技有限公司)試劑盒提取樣本組織基因組。

(a) 置于室溫培養(yǎng)的鹿角杯形珊瑚

1.2 Illumina MiSeq PE300 高通量測(cè)序

DNA樣本送往北京諾禾致源生物信息科技有限公司檢測(cè)，檢測(cè)合格的DNA樣品通過酶切、隨機(jī)打斷，經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟完成整個(gè)文庫制備。構(gòu)建好的文庫通過Illumina(測(cè)序儀)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序后先用ClusterW軟件比對(duì)2個(gè)蟲黃藻(Acroporadigitifera和Stylophorapistillata)和一個(gè)細(xì)菌(Symbiodiniumkawagutii) 的基因組[19-21]，比對(duì)基因組序列，確定其污染很少后，利用該公司自主研發(fā)的SOAPdenovo，SOAPdenovo II等組裝軟件對(duì)樣品進(jìn)行分子標(biāo)記開發(fā)。

1.3 微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)及引物驗(yàn)證

應(yīng)用SSR search 軟件檢測(cè)DNA序列中簡單重復(fù)序列。首先用該檢測(cè)軟件檢測(cè)DNA序列中所有簡單重復(fù)序列，然后對(duì)第一個(gè)模塊的結(jié)果進(jìn)行過濾去掉距離過近的簡單重復(fù)序列，最后運(yùn)用Primer 5[15]進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。微衛(wèi)星檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有以下幾點(diǎn)：①SSR重復(fù)單元的最小長度為2；②SSR重復(fù)單元的最大長度為6；③SSR序列的最小長度為12；④SSR上下游序列長度為100 bp以上；⑤兩個(gè)SSR的最小距離為12 bp。從設(shè)計(jì)的引物中挑選部分引物并在上游引物添加熒光標(biāo)記(FAM)后，送往生工生物(上海)有限公司進(jìn)行合成。

參照合成引物的退火溫度，使用5個(gè)鹿角杯形珊瑚DNA樣品對(duì)合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL：模板DNA 0.3 μL，正反引物0.4 μL，10 μL MIX，8.9 μL dd H2O。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性，3 min；94 ℃變性，45 s；退火反應(yīng)45 s,72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)數(shù)，72 ℃ 終延伸 5 min。通過瓊脂糖凝膠電泳，篩選出能獲得清晰條帶的引物，并確定每對(duì)引物的最佳退火溫度。隨后使用三亞的32個(gè)鹿角杯形珊瑚DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后將PCR產(chǎn)物送往生工生物(上海)有限公司進(jìn)行毛細(xì)血管電泳檢測(cè)。應(yīng)用軟件MICROSATELLITE ANALYSER (MSA)[22]統(tǒng)計(jì)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)和期望雜合度(He)；應(yīng)用 GENEPOP v.4.1.4[23]對(duì)每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的哈迪—溫伯格平衡指數(shù)進(jìn)行計(jì)算和位點(diǎn)間連鎖不平衡的分析；應(yīng)用軟件PIC-CALC分析各微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)信息含量值 (polymorphic information content, PIC)。

2 結(jié)果

測(cè)序結(jié)果共有原始數(shù)據(jù)4.064 G，經(jīng)過過濾后共獲得有效數(shù)據(jù)3.945 G。 Qphred=-10log10(e)(e為測(cè)序錯(cuò)誤率，Qphred為Illunima HiSeqTM2000/MiseqTM的堿基質(zhì)量值)，Phred值為20和30，堿基正確識(shí)別率分別為99 %和99.9 %。本次測(cè)序中的Phred值大于20和30的堿基占所有堿基的百分比分別為96.79 %和92.22 %，RAD-Tag的捕獲率為96.11 %，以上的所有樣本的數(shù)據(jù)量充足，測(cè)序質(zhì)量合格，GC分布正常，因此,建庫、測(cè)序成功(表1)。

根據(jù)聚類組裝結(jié)果可知，組裝獲得序列總長度為105 464 766 bp，對(duì)100 bp 以下的conting進(jìn)行過濾后獲得302 970個(gè)conting，其中N50 length(序列從大到小排列，當(dāng)長度達(dá)到組裝總長度一半時(shí)，conting的長度)的長度為348 bp，組裝基因組的平均覆蓋深度為23.16 X，其中4 X覆蓋度在85.20 %以上，GC含量為37.70 %，拼接結(jié)果正常，拼接序列質(zhì)量較高。測(cè)序完畢，選取5 000對(duì)pair-end數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有19對(duì)pair-end 是屬于Selenastrumminutum、Symbiodiniummicroadriaticum、Grosmanniaclavigera的，即序列中摻加非鹿角杯形珊瑚的比例約為0.38 %，結(jié)果表明本研究采用的人工白化的方法可較好排除共生蟲黃藻和細(xì)菌等基因的影響。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量情況匯總Tab.1 Summary of sequencing data

2.1 基因組微衛(wèi)星的數(shù)量和分布密度

對(duì)鹿角杯形珊瑚基因組的序列進(jìn)行微衛(wèi)星查找，在鹿角杯形的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步搜索含有2～6重復(fù)單元的微衛(wèi)星標(biāo)記，從總長為105 464 766 bp的302 970個(gè)conting中篩選出 2 901個(gè)潛在的微衛(wèi)星位點(diǎn)，通過引物設(shè)計(jì)獲得 2 786對(duì)微衛(wèi)星引物，片段引物設(shè)計(jì)率為96.04 %。鹿角杯形珊瑚微衛(wèi)星各重復(fù)類型之間的微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)量相差較明顯，各類型SSR分布密度差異明顯(表2)。在所得到的2 786對(duì)微衛(wèi)星引物序列中，分布最多的重復(fù)類型為三核苷酸重復(fù)(57.93 %)；其次是四核苷酸重復(fù)(20.67 %)、二核苷酸重復(fù)(14.54 %)、五核苷酸重復(fù)(5.28 %)；分布最少的是六核苷酸重復(fù)(1.58 %)。

2.2 微衛(wèi)星標(biāo)記的不同重復(fù)類型中各重復(fù)單元數(shù)量與頻率

在五種堿基重復(fù)類型中，二核苷酸一共有12種重復(fù)單元，三核苷酸一共有57種重復(fù)單元，四核苷酸一共有110種重復(fù)單元，五核苷酸一共有60種重復(fù)單元，六核苷酸一共有38種重復(fù)單元。其中，二核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星一共有405個(gè)，AT重復(fù)單元所占的比例最高為107個(gè)(26.42 %)，其次是92個(gè)TA重復(fù)單元(22.72 %)。三核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星一共有1 614個(gè)，TTG一共有126個(gè)(7.80 %)，AAT、ATT、TTA、AAC這四個(gè)重復(fù)單元緊隨其后，分別有122個(gè)(7.56 %)、107個(gè)(6.62 %)、101個(gè)(6.26 %)和100個(gè)(6.20 %)。四核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星一共有576個(gè)，分布種類較多，但是數(shù)量較少，AAAC重復(fù)單元所占比例較高。五核苷酸重復(fù)單元一共有147個(gè)，數(shù)量最多的重復(fù)單元是AAAAC，一共18個(gè)。六核苷酸重復(fù)單元一共44個(gè)，重復(fù)單元數(shù)目都在1到2之間(表2)。

表2 不同重復(fù)單元核心序列微衛(wèi)星所占的比例Tab.2 Proportion of microsatellites with different repetitive unit core sequences

2.3 多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選結(jié)果

篩選出6對(duì)鹿角杯形珊瑚微衛(wèi)星引物(表3)，對(duì)32個(gè)鹿角杯形珊瑚樣品進(jìn)行擴(kuò)增，然后把PCR產(chǎn)物送往生工生物(上海)有限公司進(jìn)行毛細(xì)血管電泳檢測(cè)，引物L(fēng)B1、LB11在三亞鹿回頭鹿角杯形珊瑚群體擴(kuò)增的毛細(xì)血管圖見圖2。

表3 鹿角杯形珊瑚微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性信息Tab.3 Polymorphism information of Pocillopora damicornis microsatellite markers

判讀結(jié)果(圖2)后經(jīng)過數(shù)據(jù)處理發(fā)現(xiàn)：有效等位基因數(shù)(Ne)為2.198～5.000；觀測(cè)雜合度(Ho)為0.531～0.875；期望雜合度(He)為0.512～0.816之間；Shannon多樣性指數(shù)為0.856～1.829；多態(tài)信息含量(PIC)為0.441～0.777(表3)；在6對(duì)微衛(wèi)星引物中，有4個(gè)位點(diǎn)屬于高度多態(tài)性位點(diǎn)(PIC >0.5)，LB2、LB11屬于中度多態(tài)性位點(diǎn)；經(jīng)Bonferroni 校正后，只有位點(diǎn)LB11偏離哈迪—溫伯格平衡；連鎖不平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，位點(diǎn)之間不存在連鎖不平衡現(xiàn)象。

(a) 引物L(fēng)B1在三亞鹿回頭鹿角杯形珊瑚群體擴(kuò)增的部分毛細(xì)血管圖

(b) 引物L(fēng)B11在三亞鹿回頭鹿角杯形珊瑚群體擴(kuò)增的部分毛細(xì)血管圖

3 討論

微衛(wèi)星標(biāo)記是分子遺傳學(xué)研究中的一種重要工具，篩選微衛(wèi)星序列的傳統(tǒng)方法有磁珠富集法、數(shù)據(jù)庫查找法、基因組文庫法和近緣物種篩選法等[24]。而珊瑚群體遺傳學(xué)的研究目前還處于探索的階段，現(xiàn)有的珊瑚基因組數(shù)據(jù)庫不足以滿足我們對(duì)珊瑚遺傳學(xué)的深入研究，同時(shí)由于珊瑚共生蟲黃藻的存在，難以獲得純的珊瑚DNA，因此傳統(tǒng)的微衛(wèi)星開發(fā)方法難以得到較為準(zhǔn)確的珊瑚微衛(wèi)星標(biāo)記，而基于高通量測(cè)序技術(shù)的簡化基因組測(cè)序方法開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的最大優(yōu)點(diǎn)就是開發(fā)的周期短、效率高、靈活性高、成本低。應(yīng)用簡化基因組測(cè)序能獲得大量的標(biāo)記，通過異常值檢驗(yàn)(outlier test)可以檢測(cè)出大量受到正向選擇的位點(diǎn)，因此能較好地應(yīng)用于珊瑚遺傳學(xué)研究[25]。故本研究應(yīng)用簡化基因組測(cè)序方法從鹿角杯形珊瑚中開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記。本研究首先控制溫度條件，對(duì)珊瑚進(jìn)行高溫脅迫排出蟲黃藻[14, 26]，其次提取珊瑚DNA，然后應(yīng)用簡化基因組測(cè)序方法獲得較精準(zhǔn)的鹿角杯形珊瑚基因組序列，再比對(duì)蟲黃藻，微生物等基因組數(shù)據(jù)庫，排除蟲黃藻及其他微生物的干擾，最后開發(fā)出較為準(zhǔn)確的微衛(wèi)星標(biāo)記。

本研究一共設(shè)計(jì)了2 786對(duì)微衛(wèi)星引物，從中挑選了6對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)32個(gè)鹿角杯形珊瑚個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)其具有高度多態(tài)性，表明這種方法可用于鹿角杯形珊瑚微衛(wèi)星標(biāo)記的大規(guī)模開發(fā)。研究報(bào)道，微衛(wèi)星的多態(tài)性和核心序列的重復(fù)數(shù)呈正相關(guān)的關(guān)系，重復(fù)單元越多的位點(diǎn)，其多態(tài)性越高。WEBER[27]的研究表明微衛(wèi)星核酸序列的重復(fù)單元只有達(dá)到一定程度時(shí)，才表現(xiàn)出多態(tài)性，例如，只有在 2 堿基重復(fù)序列次數(shù)達(dá)到 12次時(shí)，微衛(wèi)星標(biāo)記才能表現(xiàn)出較高的多態(tài)性；而重復(fù)單元次數(shù)低于5的微衛(wèi)星位點(diǎn)一般無法檢測(cè)出多態(tài)性[28]。多態(tài)性信息含量是指一個(gè)后代所獲得的某個(gè)等位基因標(biāo)記來源于其親本的同一個(gè)等位標(biāo)記的可能性大小[29-30]。FERESU-SHONHIWA等[31]認(rèn)為當(dāng)PIC>0.70時(shí)，該微衛(wèi)星標(biāo)記是最理想的標(biāo)記。在本研究選取的6對(duì)引物中，有4對(duì)表現(xiàn)為高度多態(tài)性(PIC>0.5)，LB2、LB11表現(xiàn)為中度多態(tài)性，其中LB1，LB12的多態(tài)性信息值大于0.7。32個(gè)鹿角杯形珊瑚樣品的DNA通過PCR擴(kuò)增后所得到的有效等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度、Shannon指數(shù)和多態(tài)信息位點(diǎn)均表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。因此，本研究得到的微衛(wèi)星標(biāo)記較理想。

本研究開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性高，且可以排除共生蟲黃藻DNA的影響，特異性地檢測(cè)到珊瑚蟲的遺傳信息，可以廣泛地應(yīng)用于珊瑚群體遺傳學(xué)和分類學(xué)研究，如構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、進(jìn)化生物學(xué)、種質(zhì)鑒定及遺傳育種等，并為珊瑚種質(zhì)資源的評(píng)估、珊瑚礁的科學(xué)保護(hù)做出積極的貢獻(xiàn)。