元素分析-同位素比值質(zhì)譜法測量海洋沉積物中有機碳和氮穩(wěn)定同位素組成的實驗室間比對研究

常文博， 李鳳， 張媛媛， 賀行良

(青島海洋地質(zhì)研究所， 山東 青島 266071)

海洋沉積物處于水圈、生物圈和巖石圈的交匯地帶，是有機質(zhì)沉積和埋藏保存的重要儲庫，作為生源要素碳、氮的重要源與匯，在其生物地球化學(xué)循環(huán)中起著至關(guān)重要的作用[1]。海洋沉積物等地質(zhì)樣品因具有較復(fù)雜的成分，又與淡水沉積物、土壤等大陸情況不同，且獨立于海水的水體環(huán)境而具有極高的科學(xué)研究價值。

有機碳、氮穩(wěn)定同位素作為一種有效的指標(biāo)[2-4]，其研究成果已廣泛應(yīng)用于全球碳循環(huán)[5-8]、氣候變化、生物演化、有機質(zhì)來源[9-11]與遷移轉(zhuǎn)化、地層對比[12]等海洋生態(tài)環(huán)境、生物地球化學(xué)研究領(lǐng)域。通過測定海洋沉積物中的有機碳、氮穩(wěn)定同位素值及計算其比值，可以重建來源地的地球環(huán)境變化等信息，推測沉積物演變過程[13]。沉積物中有機碳同位素δ13C能夠確定有機質(zhì)的來源，典型海洋浮游植物的δ13C值為-22‰～-19‰，湖相藻類的δ13C值為-30‰～-25‰；陸生C3植物(三碳植物)的δ13C值約為-28‰～-26‰，C4植物的δ13C值約為-16‰～-10‰[14-15]。穩(wěn)定氮同位素δ15N則被廣泛地用來示蹤食物鏈的攝食路徑，有機質(zhì)的源匯，水中脫氮、硝化過程、氮的固定化和富營養(yǎng)化等方面。典型海洋浮游生物的δ15N值范圍為4‰～10‰，平均值為6‰，陸源有機質(zhì)的δ15N值范圍為-10‰～10‰，平均值為2‰。

穩(wěn)定同位素分析技術(shù)的運用，首先依賴于同位素組成的高精度與高準(zhǔn)確度測定，而同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)則是同位素組成高準(zhǔn)確度測定的根本保證[16]。近年來，在穩(wěn)定同位素測試分析方面，隨著高精度、連續(xù)流同位素儀器的引進，我國同位素實驗室測試儀器和測試手段得到了迅速普及和發(fā)展。目前δ13C和δ15N分析主要采用EA-IRMS 在線技術(shù)[17]，具體是把元素分析儀(EA)與穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀(IRMS)通過一個ConFlo接口連接起來，將樣品包裹于錫杯中，放入EA自動進樣器，由EA燃燒轉(zhuǎn)化為CO2和N2，通過載氣將待測氣體帶入IRMS進行穩(wěn)定同位素比值測定，可以實現(xiàn)一步操作即可完成CO2和N2氣體的生成和質(zhì)譜分析，減少了人為因素引起的誤差[18]。樣品的燃燒、注入?yún)⒖細(xì)怏w、質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)處理均由計算機控制完成，方法高效、準(zhǔn)確度高。

目前使用EA-IRMS聯(lián)用方法測定海洋沉積物中有機碳、氮穩(wěn)定同位素的報道不多，且主要局限于對比不同前處理方法的異同或前處理方法的條件優(yōu)化，沒有橫向?qū)Ρ认嗤瑯?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)下，儀器測試準(zhǔn)確度和精密度之間的差異。除此之外，對于海洋沉積物δ13C、δ15N缺少相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)方法，現(xiàn)階段各實驗室僅采用各自的工作標(biāo)準(zhǔn)。國際原子能機構(gòu)(IAEA)、美國地質(zhì)調(diào)查局(USGS)等國外機構(gòu)研制并定值的有機碳、氮穩(wěn)定同位素相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)種類較多，涉及純品類型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，也包括沉積物、土壤、生物樣品等天然基體的同位素參考物質(zhì)，但價格十分昂貴，不利于在我國實驗室的推廣。我國海洋地質(zhì)調(diào)查及分析資料積累豐富，各類技術(shù)規(guī)范中都明確規(guī)定了使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進行樣品分析測試質(zhì)量監(jiān)控，一段時間以來我國海洋沉積物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值僅涉及常微量組分，青島海洋地質(zhì)研究所針對我國在海洋沉積物碳氮穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方面的需求，于2018年研制了三個涵蓋我國潮間帶、近海、深海等海域沉積物中碳氮穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW04701、GBW04702、GBW04703)。基于此，本文對多個實驗室使用相同的實驗儀器，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW04701、GBW04702、GBW04703和國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(EMA-B2152、 EMA-B2151)的δ13C、δ15N進行比對實驗，得到較好的精密度，以確定EA-IRMS聯(lián)用方法測定海洋沉積物中有機碳、氮穩(wěn)定同位素的適用性并驗證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的可靠性。

1 實驗部分

1.1 樣品的選擇

本文選用5個不同有機碳、氮穩(wěn)定同位素水平范圍的實驗室間水平測試樣品(表1)，其中水平1～水平3是國家一級海洋沉積物碳、氮穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW04701、GBW04702、GBW04703，它們分別是2012～2013年期間在我國渤海錦州灣濕地(潮間帶)、東海閩浙近岸(海岸帶)、東海沖繩海槽(深海)三個海域采集得到的表層沉積物，涵蓋了“潮間帶—海岸帶—深?！眳^(qū)域。該系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由3個不同梯度的同位素比值的樣品組成，通過了均勻性和穩(wěn)定性檢驗[19-21]，定值信息豐富(包含碳同位素δ13C-TC、δ13C-Corg和氮同位素δ15N-TN、δ15N-Norg)，應(yīng)用范圍廣，不僅可用于儀器工作條件的優(yōu)化與校準(zhǔn)，還可對整個實驗測試流程進行質(zhì)量監(jiān)控與評價[22-23]，是我國第一套以海底沉積物為介質(zhì)的自然基體型碳、氮穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。水平4、水平5是英國元素微量分析公司(Elemental Microanalysis，EMA)研制的土壤、沉積物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(EMA-B2152、 EMA-B2151)。

1.2 測試方法

樣品采用真空冷凍干燥后，取0.5g過100目的研磨樣品放入聚丙烯離心管中，加入5mL稀鹽酸(1.2mol/L)，待劇烈反應(yīng)結(jié)束后，充分搖勻，于通風(fēng)櫥中靜置，敞口反應(yīng)8～12h，期間于旋渦混合儀上混勻2～3次，2000r/min下離心5min后倒出上清液，再加入5mL高純水對樣品進行漩渦混勻并離心，去除上清液，充分操作3～4次，直至上清液接近中性。

將上述酸化好的樣品置于-50℃凍干機中冷凍干燥48h，干燥后搗碎、研均，用錫杯緊密包裹置于Flash EA1112型元素分析儀中，爐溫950℃，柱溫50℃，He流量為300mL/min，氧氣注入流量為175mL/min，通氧時間選為3s。在高溫富氧條件下瞬間燃燒，所產(chǎn)生的CO2、N2O、NOx等混合氣體在高純氦氣的帶動下，依次通過Cr2O3、Cu和Co3O4/Ag填料發(fā)生氧化還原反應(yīng)，最終轉(zhuǎn)換成CO2和N2，在載氣的帶動下，通過連續(xù)流接口送入同位素比值質(zhì)譜儀。IRMS真空度為2.6×10-8kPa，發(fā)射電流1.5mA。質(zhì)譜儀將氣體分子電離為不同m/z比值的離子束，測定并記錄離子束各組分的強度。測定δ13C時，IRMS監(jiān)測離子(m/z)為44、45、46，測定δ15N時，IRMS監(jiān)測離子(m/z)為28、29，并保證樣品m/z44和m/z28的信號都大于1000mV。數(shù)據(jù)處理程序?qū)㈦x子束強度轉(zhuǎn)化為同位素豐度，并將待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比較，得到相對于國際標(biāo)準(zhǔn)的碳、氮同位素比值。

經(jīng)過對行業(yè)代表性、實驗室技術(shù)能力及設(shè)備條件等多方面因素進行綜合考慮，在我國選擇了十家實驗室作為協(xié)作單位承擔(dān)此次比對實驗工作。通過對測試樣品準(zhǔn)確度、精密度的研究，評估該方法的適用性。

同位素比值是某一元素的重同位素豐度與之輕同位素豐度的比值，由于自然界中各元素的重同位素豐度遠(yuǎn)低于輕同位素，國際上通常采用δ來表示樣品的同位素比值，δ13C、δ15N的分析計算公式為：

式中：Rsample、Rstandard分別為樣品、國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)VPDB中13C與12C和15N與14N的豐度比(13C/12C,15N/14N),δ13C和δ15N的儀器分析精度分別為±0.05%、±0.10%。

2 實驗室間準(zhǔn)確度和精密度協(xié)作實驗

各家實驗室按照統(tǒng)一的前處理方法[24-25]、實驗流程[26-27]、操作方法與測試要求[28]，分別進行了5個水平的協(xié)作試驗工作，每個樣品測定4～6次。協(xié)作實驗的質(zhì)量控制按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《地質(zhì)礦產(chǎn)實驗室測試質(zhì)量管理規(guī)范 第8部分 同位素地質(zhì)樣品分析》(DZ/T 0130.8—2006)執(zhí)行。協(xié)作實驗δ13C和δ15N的測定準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)見表2。

表2 協(xié)作試驗δ13C和δ15N測定準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)

(續(xù)表1)

2.1 δ13C和δ15N值測試結(jié)果的準(zhǔn)確度

十家實驗室對5個平行樣品δ13C和δ15N的測試結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值相吻合，各比對樣品測量值與標(biāo)準(zhǔn)值之差(準(zhǔn)確度)見圖1。所有比對樣品δ13C的準(zhǔn)確度在-0.32‰～0.37‰范圍內(nèi)；δ15N值的準(zhǔn)確度在-0.35‰～0.29‰范圍內(nèi)。δ13C值的最大偏差為K實驗室的樣品，準(zhǔn)確度為0.37‰；δ15N值的最大偏差為F實驗室的樣品，準(zhǔn)確度為-0.35‰。

實驗結(jié)果表明，元素分析-同位素比值質(zhì)譜法測量δ13C、δ15N同位素的結(jié)果穩(wěn)定，與標(biāo)準(zhǔn)值無明顯差異，能夠快速、準(zhǔn)確地完成樣品測試。

2.2 δ13C和δ15N值測試結(jié)果的精密度

通過5個水平樣品測量結(jié)果計算出的精密度統(tǒng)計結(jié)果見圖2。所有實驗室測試的δ13C精密度均好于0.10‰，δ15N精密度好于0.14‰。因此元素分析-同位素比值質(zhì)譜法測量海洋沉積物有機碳、氮同位素取得數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確，精密度較高，能夠滿足實驗室各種測試要求。

3 比對實驗數(shù)據(jù)一致性檢驗

3.1 曼德爾h-k值檢驗一致性數(shù)理統(tǒng)計

通過檢驗多個實驗室測試結(jié)果的一致性，可以保證測試方法的準(zhǔn)確性和測試水平的適用性。按照國家標(biāo)準(zhǔn)《測量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度(正確度與精密度)第2部分 確定標(biāo)準(zhǔn)測量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法》(GB/T 6379.2—2004)，對各實驗室所測數(shù)據(jù)進行實驗室間一致性曼德爾統(tǒng)計量h和k檢驗。δ13C測定結(jié)果的1%的h臨界值為±2.18，5%的h臨界值為±1.80；1%的k臨界值為1.66，5%的k臨界值為1.45。δ15N測定結(jié)果的1%的h臨界值為±2.13，5%的h臨界值為±1.78，1%和5%的k臨界值分別為1.66、1.45。

曼德爾h、k統(tǒng)計量可以用來描述測量方法的變異，也可以應(yīng)用到方法再現(xiàn)性評估中(圖3)。計算實驗室間的一致性統(tǒng)計量h的方法是用單元對平均值的利差除以單元平均值的標(biāo)準(zhǔn)差。h值可正可負(fù)，h值越小，表示數(shù)據(jù)越接近于所有實驗室數(shù)據(jù)的平均值[29]。測試結(jié)果顯示，十家實驗室之間δ13C、δ15N同位素測試水平比較穩(wěn)定。其中，在δ13C的h統(tǒng)計圖中，C實驗室的水平1達(dá)到5%臨界值，δ15N的h統(tǒng)計圖中，D實驗室的水平5、F實驗室的水平3、G實驗室的水平1、I實驗室的水平2接近或達(dá)到臨界值，除極少數(shù)結(jié)果超過1%臨界值，其他都在1%臨界值以內(nèi)，說明整體比較穩(wěn)定；計算實驗室內(nèi)一致性統(tǒng)計量k的方法是先對每個水平計算聯(lián)合單元內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差，然后對每個實驗室的每個水平內(nèi)計算。k值表示實驗室內(nèi)樣品中各個水平測試數(shù)據(jù)結(jié)果在整體平均值上分布基本都在顯著性水平1%曼德爾臨界值之內(nèi)。其中，在δ13C的k統(tǒng)計圖中，B實驗室的水平2、D實驗室的水平3、G實驗室的水平4、5、H實驗室的水平5達(dá)到或接近臨界值；在δ15N的k統(tǒng)計圖中，A實驗室的水平4、C實驗室的水平2、E實驗室的水平3、G實驗室的水平5接近或達(dá)到臨界值，除極少數(shù)結(jié)果超過1%臨界值，其他都在1%臨界值以內(nèi)，說明整體比較穩(wěn)定。δ13C、δ15N實驗室內(nèi)重復(fù)性基本都能控制在顯著性水平1%曼德爾臨界值之內(nèi)，因此元素分析-同位素比值質(zhì)譜法在不同實驗室重復(fù)性和再現(xiàn)性整體良好。

圖1 不同實驗室測試δ13C和δ15N的準(zhǔn)確度(A～J為參與比對測試的實驗室代碼)Fig.1 Accuracy of δ13C and δ15N in different laboratories (A-J is the laboratory code that participated in the comparison test)

圖2 不同實驗室測試δ13C和δ15N的精密度(A～J為參與比對測試的實驗室代碼)Fig.2 Precision of δ13C and δ15N in different laboratories (A-J is the laboratory code that participated in the comparison test)

圖3 實驗室間比對δ13C和δ15N曼德爾h-k統(tǒng)計圖Fig.3 Mandel h-k value statisticalFigures of δ13C and δ15N in inter-laboratory

3.2 離群值的檢驗

對離群值的檢驗方法有柯克倫(Cochran)檢驗和格拉布斯(Grubbs)檢驗?？驴藗悪z驗是對實驗室內(nèi)變異的檢驗，格拉布斯檢驗主要是對實驗室間變異的檢驗。如果檢驗統(tǒng)計量小于或等于5%臨界值，則接受被檢驗項目為正確值；如果檢驗統(tǒng)計量大于5%臨界值，但小于等于1%臨界值，則稱被檢驗的項目為歧離值，用單星號(*)標(biāo)出；如果檢驗統(tǒng)計量大于1%臨界值，則稱被檢驗的項目為離群值，用雙星號(**)標(biāo)出。

3.3 重復(fù)性和再現(xiàn)性統(tǒng)計結(jié)果

比對數(shù)據(jù)的一致性體現(xiàn)在方法的重復(fù)性和各個實驗室的再現(xiàn)性，參與比對的實驗室之間再現(xiàn)性試驗獲得的實驗數(shù)據(jù)精密度應(yīng)遵循一定的數(shù)值數(shù)理統(tǒng)計，在多個水平測試下的實驗數(shù)據(jù)，除了需要對這些數(shù)據(jù)的精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、再現(xiàn)性進行估計，還需要對這些實驗數(shù)據(jù)進行考察。J實驗室在δ15N測試中未能得到合理的結(jié)果，排除J實驗室對統(tǒng)計結(jié)果的影響，不參與統(tǒng)計。

按GB/T 6379.2—2004規(guī)定的方法，利用5個不同水平的試樣，在9～10家實驗室進行了方法精密度試驗。在剔除離群值后，得到方法重復(fù)性和再現(xiàn)性的統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表3。從測量的本質(zhì)和計算擬合的結(jié)果可知，重復(fù)性(r)和再現(xiàn)性(R)與m值的變化結(jié)果較微弱。因此，十家實驗室測試結(jié)果的重復(fù)性和再現(xiàn)性良好[30]。

表3 δ13C和δ15N測定的重復(fù)性與再現(xiàn)性統(tǒng)計結(jié)果

3.4 測量方法正確度計算結(jié)果

按照國家標(biāo)準(zhǔn)《測量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度(正確度與精密度) 第4部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測量方法正確度的基本方法》(GB/T 6379.4—2006)規(guī)定的方法，利用5個不同水平的試樣，在9～10家實驗室進行了方法正確度試驗，得到方法偏倚統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表4。多個實驗室和多組樣品參與協(xié)作比對實驗時，實驗室的偏倚量可以有效地評價每個實驗室對每個樣品測試的偏倚情況。在95%的置信水平下，實驗室偏倚范圍就是每個實驗室對特定樣品測試值與該樣品標(biāo)準(zhǔn)值相比偏倚程度和偏倚方向。其中偏倚區(qū)間[δ-A×SR,δ+A×SR]包含0，則實驗室偏倚不顯著，否則偏倚顯著。測試結(jié)果表明，δ13C測試中的EMA-B2151的δ+A×SR測試結(jié)果相對于標(biāo)準(zhǔn)值偏負(fù)，其余樣品都獲得了較好結(jié)果。

4 結(jié)論

本文通過對多家實驗室開展比對實驗，用元素分析-同位素比值質(zhì)譜法測定不同海洋沉積物樣品有機碳、氮穩(wěn)定同位素比值，測得的δ13C和δ15N精密度分別好于0.10‰、0.14‰。該方法的精密度和準(zhǔn)確度良好，比對實驗采用的方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性可靠，比對方法穩(wěn)定，驗證了元素分析-同位素比值質(zhì)譜法在海洋沉積物有機碳、氮穩(wěn)定同位素測試方面的適用性。

隨著同位素質(zhì)譜方法的不斷完善和推廣，迫切需要開展標(biāo)準(zhǔn)化工作，海洋沉積物標(biāo)準(zhǔn)分析方法的建立與完善，有利于測試技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、科學(xué)化。本研究驗證了三種國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW04701、GBW04702、GBW04703)的可靠性，為后續(xù)元素分析-同位素比值質(zhì)譜法測定海洋沉積物中有機碳、氮穩(wěn)定同位素的方法比對工作補充了資料和奠定基礎(chǔ)。這三個標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為我國不同海域的海洋沉積物樣品，種類豐富，沉積環(huán)境多樣，但δ13C和δ15N數(shù)值范圍較小，在進行質(zhì)量控制工作時可控范圍較小，還需要更多標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制工作的推進。

表4 δ13C和δ15N測量方法偏倚的估計