活血祛瘀藥對三棱-莪術(shù)治療胃癌的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作用機制研究

張磊 程健 余瑩 何君君

1.廣東省第二人民醫(yī)院 廣州 510405 2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)

胃癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤，目前病因尚未明確，由于早期診斷難、發(fā)病率高、死亡率高，在全球范圍內(nèi)廣受關(guān)注[1-2]。胃癌早期癥狀缺乏特異性，多數(shù)患者確診時已到中晚期，這加大了胃癌的治療難度，西醫(yī)臨床多采取手術(shù)、化療或姑息療法[3]。中醫(yī)藥以其“安全低毒”“固本扶正祛邪”“辨證論治”等優(yōu)勢，在胃癌的治療中發(fā)揮了重要作用。中醫(yī)多將胃癌歸屬為“癥瘕”“巖”“積聚”等范疇，活血化瘀是治療胃癌的基本法則之一，而“三棱-莪術(shù)”作為行氣活血中藥的代表，功?；钛铕觥⑾Y散結(jié)，廣泛應(yīng)用于胃癌的臨床治療中。

莪術(shù)，始載于《藥性論》，味辛，性溫，具有行氣破血、消積止痛之功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素類、莪術(shù)醇、揮發(fā)油、多糖類成分是莪術(shù)主要活性成分[4]。姜黃素類為莪術(shù)活血化瘀的主要活性成分[5]；莪術(shù)油有廣泛的抗腫瘤作用，在胃癌、肝癌、直腸癌、卵巢癌、乳腺癌等的治療中均有效[6]。三棱，最早載于《本草拾遺》，其性平，味辛、苦，具有破血中之氣、消積祛瘀止痛之功效。三棱主要活性成分有黃酮類、有機酸和揮發(fā)油類，其中如苯丙素、琥珀酸、皂苷類、β-谷甾醇等具有抗炎、抗血小板聚集、抗血栓形成、抗腫瘤等多重功效[7-8]。中醫(yī)遣方用藥不僅注重“君臣佐使”，而且講究“七情配伍”，臨床療效及藥理研究均表明，三棱、莪術(shù)二者配伍，相須為用，在腫瘤、囊腫等實體腫物的治療中效果更佳。盡管諸多臨床案例皆證實了該藥對抗胃癌的療效，然而其具體作用機制尚不明確，這在一定程度上限制了二者的推廣與應(yīng)用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興學(xué)科，將傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代藥理學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)相結(jié)合，其整體性、系統(tǒng)性的特點與中醫(yī)藥整體合參、辨證論治的原則一致[9]，為從微觀角度闡明三棱-莪術(shù)藥對治療胃癌的作用機制提供了途徑，并為中醫(yī)藥抗癌的客觀化、精準化研究提供了證據(jù)及新思路。

1 材料和方法

1.1 化學(xué)成分構(gòu)建及篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php） 檢索三棱-莪術(shù)藥對的所有化學(xué)成分，共搜集了111個化合物，其中三棱30個、莪術(shù)81個。為更好地篩選藥對中的有效化合物，本研究聯(lián)合口服利用度（oral bioavailability，OB）與CaCo-2細胞滲透性進行三棱-莪術(shù)藥對活性成分的篩選。其中OB反映的是藥物被機體吸收進入循環(huán)的百分比，CaCo-2細胞滲透性則可反映小腸上皮細胞對藥物的轉(zhuǎn)運效率。基于此，將OB≥30%、CaCo-2細胞滲透性≥0作為化合物分子的篩選標(biāo)準。

1.2 藥物靶點篩選 在TCMSP中查找與篩選出的藥對活性分子相對應(yīng)的蛋白靶點，同時利用UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），查詢靶點蛋白對應(yīng)的人類基因名稱，進行名稱標(biāo)準化處理后錄入Excel表格。

1.3 胃癌靶點篩選 利用人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim） 與 GeneCards（http://www.genecards.org/）搜索關(guān)鍵詞gastric cancer，查找與其相關(guān)的疾病靶基因，合并2個數(shù)據(jù)庫的搜索結(jié)果，去除重復(fù)和假陽性的基因，以score＞5作為疾病靶點篩選的標(biāo)準。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運用UniProt數(shù)據(jù)庫，查詢篩選出的三棱-莪術(shù)藥對中活性分子相關(guān)靶點，將藥對作用靶點與胃癌相關(guān)靶點進行映射，從而獲取共同靶點，使用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建中藥活性成分-胃癌靶點相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。運用String數(shù)據(jù)庫（https://stringdb.org/cgi/input.pl），對靶點進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）功能富集及京都基因組百科全書 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析 為了闡明三棱-莪術(shù)藥對治療胃癌的作用機制，將網(wǎng)絡(luò)中的靶蛋白投射到DAVID生物信息資源庫6.8（https://david.ncifcrf.gov/），進行GO功能富集和KEGG通路富集，從生物過程及信號通路角度分析三棱-莪術(shù)藥對治療胃癌可能的作用機制，繼而繪制靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 藥物篩選結(jié)果 研究結(jié)果表明，三棱-莪術(shù)藥對中有60個活性成分滿足OB與CaCo-2細胞滲透性要求，其中三棱含有18個活性成分，莪術(shù)含有43個活性成分，二者共有活性成分1個，為常春（藤苷）配基（MOL000296）。符合篩選條件的60個活性化合物基本信息見表1。

2.2 靶點預(yù)測結(jié)果 利用UniProt數(shù)據(jù)庫，將TCMSP上檢索的活性成分所對應(yīng)的蛋白靶點，轉(zhuǎn)換成與之對應(yīng)的人類基因名稱，共得到117個靶點基因。檢索Gene Cards及OMIM數(shù)據(jù)庫，分別得到靶基因18 250、2 289個，合并去重后得到3 221個。將三棱-莪術(shù)藥對靶基因與胃癌相關(guān)基因進行映射，得到共同靶基因67個。以67個靶基因?qū)?yīng)的蛋白作為三棱-莪術(shù)藥對治療胃癌的靶點，建立三棱-莪術(shù)藥對活性成分-胃癌病變靶點網(wǎng)絡(luò)圖，其中黃色菱形代表三棱-莪術(shù)藥對的活性成分，紅色矩形代表胃癌相關(guān)靶點。見圖1。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將得到的活性成分作用靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。采用Cytoscape 3.7.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，設(shè)置節(jié)點大小與顏色以反映節(jié)點自由度值 （degree），邊的粗細表示綜合分值（combine score），最終獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。半胱天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3，CASP3）、c-JunN-末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、熱休克蛋白90AA1（heat shock protein 90AA1，HSP90AA1）、前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2），Degree值分別為33、32、29、28、26， 表明這些蛋白是三棱-莪術(shù)藥對治療胃癌的關(guān)鍵蛋白靶點。見圖2。

表1 三棱-莪術(shù)藥對部分活性成分Tab.1 Part of active compounds from Sparganii Rhizoma and Curcumae Rhizoma

圖1 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Compound-target network

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network

2.4 GO功能富集分析 通過DAVID軟件對三棱-莪術(shù)藥對治療胃癌所涉及的67個靶蛋白進行GO功能富集分析。根據(jù)P＜0.01、基因頻率＞0.05%，確定出10個條目，涉及“類固醇激素受體活性”“轉(zhuǎn)錄DNA模板”“細胞增殖調(diào)控”“絲氨酸型內(nèi)肽酶活性”等生物學(xué)過程。見圖3。

圖3 靶基因的GO功能富集Fig.3 GO enrichment of target genes

表2 靶基因的KEGG通路富集Tab.2 KEGG enrichment of target genes

2.5 KEGG通路富集分析 對三棱-莪術(shù)藥對治療胃癌所涉及的67個靶蛋白進行KEGG通路富集分析。根據(jù)P＜0.01、基因頻率＞0.05%，并排除如“小細胞肺癌”“甲狀腺激素信號通路”等與胃癌不相關(guān)的通路，最后確定出14條通路，包括“腫痛信息痛路”“腫病蛋白多糖”“p53信號通路”等信號通路，并做出KEGG通路富集分析圖。見表2及圖4。

根據(jù)靶點與信號通路之間的聯(lián)系，建立靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，其中藍色三角形表示疾病靶點，紅色矩形表示信號通路。見圖5。

圖4 KEGG通路富集Fig.4 KEGG pathway of target genes

圖5 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Target-pathway network

3 討論

胃癌，歸屬于中醫(yī)學(xué)中“積”“巖”“癥瘕”等范疇。中醫(yī)病機乃五臟六腑正虛為本，氣結(jié)、食滯、血瘀、濕阻、寒凝、熱壅等為標(biāo)，脾氣虧虛，肝氣郁結(jié)，氣機不行，血運不暢，病久化瘀，入絡(luò)入臟腑，毒瘀交阻，久積成塊，故正虛是胃癌形成的基礎(chǔ)，而血瘀是腫塊形成的關(guān)鍵因素，治療應(yīng)標(biāo)本兼顧，以益氣固本扶正、活血化瘀消積為基本治則。

“三棱-莪術(shù)”藥對作為臨床活血祛瘀的常用藥對，二者均能行氣活血、化癥散結(jié)，相須配伍，散結(jié)消積、活血化瘀之力增強，尤適用于胃癌等有形實邪積聚之癥瘕腫塊。且現(xiàn)代研究證實，三棱-莪術(shù)藥對可通過顯著抑制內(nèi)皮細胞增殖、阻滯細胞生長周期、抑制腫瘤細胞生成、直接殺死腫瘤細胞、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制血管生成、阻斷信號傳導(dǎo)通路等機制起到治療胃癌的作用[10-12]。盡管現(xiàn)階段對三棱-莪術(shù)二者抗癌的臨床療效已有較多研究報道，但檢索國內(nèi)外文獻發(fā)現(xiàn)，目前尚無針對三棱-莪術(shù)藥對抗胃癌的有效化學(xué)成分、作用靶點、信號通路及生物學(xué)途徑等具體機制的研究。因此，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)平臺明確其發(fā)揮臨床療效的活性成分及作用靶點，將成為現(xiàn)代中醫(yī)藥研究的新方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，三棱-莪術(shù)藥對活性成分在胃癌的治療上存在多成分、多靶點、多向作用的特點，針對復(fù)雜交叉的腫瘤內(nèi)環(huán)境，中藥成分“一對多”發(fā)揮多靶點調(diào)控的作用，體現(xiàn)出中醫(yī)整體治療作用的優(yōu)勢。通過整合分析得出，三棱-莪術(shù)藥對防治胃癌的關(guān)鍵靶點為CASP3、JNK、ESR1、HSP90AA1、PTGS2等。CASP3在細胞凋亡進程中發(fā)揮核心作用，是當(dāng)前治療腫瘤的一個重要靶點，其激活后損傷DNA，并破壞細胞內(nèi)多種蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致蛋白水解，引起細胞凋亡，以此為途徑殺傷腫瘤細胞[13]，使胃癌組織中CASP3表達下調(diào)[14]。JNK在不同腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用，Jun基因編碼的c-Jun蛋白是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族的組成成員，在調(diào)控細胞增殖、分化、侵襲和凋亡方面起關(guān)鍵作用，主要參與MAPK信號通路上游的調(diào)控，JNK-MAPK與核轉(zhuǎn)錄因子-κB （nuclear factor-κB，NF-κB）、兩面神激酶/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）等多條信號通路協(xié)同作用于腫瘤進程[15-17]。胃癌在男女不同性別人群中發(fā)病率存在差異，而這種差異在女性絕經(jīng)后消失，進一步研究發(fā)現(xiàn)其與雌激素水平相關(guān)[18]。雌激素與胞內(nèi)雌激素受體（estrogen receptor，ESR）結(jié)合，通過激活經(jīng)典的雌激素信號途徑，調(diào)控下游基因的表達，從而在胃癌發(fā)病進程中發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)[19]。ESR1基因的內(nèi)含子包含增強子、啟動子等調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程的重要序列，與編碼ESR相關(guān)，而不同的基因型導(dǎo)致不同個體間ESR的表達、結(jié)構(gòu)、功能等不同，進而影響雌激素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，誘發(fā)胃癌、乳腺癌、卵巢癌等疾病[20-22]。HSP90作為一種高度保守的分子伴侶蛋白，被認為是腫瘤蛋白穩(wěn)定性的重要調(diào)控因子[23]。隨著胃癌前病變到胃癌的進展，HSP90的表達呈上升趨勢，且在胃癌組織中高表達[24]。而HSP90AA1蛋白作為HSP90家族中一種進化上高度保守的蛋白亞型，與其它分子伴侶協(xié)同作用，維持數(shù)百種蛋白的穩(wěn)定性，在胃癌相關(guān)蛋白功能發(fā)揮中扮演重要調(diào)控角色。三棱-莪術(shù)藥對的主要活性成分（L）-alpha-Terpineol、（R）-p-Menth-1-en-4-ol、oleic acid中均有HSP90的作用靶點，阻斷HSP90可阻斷胃癌細胞多種促血管生成信號通路，抑制腫瘤生長[25]。PTGS2是花生四烯酸合成前列腺素類物質(zhì)的關(guān)鍵性限速酶的異構(gòu)酶，參與調(diào)控腫瘤、炎癥、凝血等多種生理和病理過程[26-27]。國外研究表明，幽門螺旋桿菌相關(guān)的急慢性胃炎與胃上皮細胞中PTGS2的表達有關(guān)，PTGS2在幽門螺桿菌感染者的胃上皮細胞中顯著升高[28]，且參與了胃癌細胞的惡性增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及免疫抑制[29]。

KEGG通路富集分析表明，三棱-莪術(shù)藥對主要作用的信號通路有腫瘤信號通路、PI3K-PKB/Akt信號通路、p53信號通路、VEGF信號通路、TNF信號通路等。PI3K-PKB/Akt信號通路被激活后，導(dǎo)致Akt下游靶基因活化，調(diào)控E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、β-連環(huán)蛋白（β-cadherin）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、 基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、波形蛋白（vimentin）等的表達，引起細胞外基質(zhì)降解、細胞間黏附力下降，加速胃癌上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）[30]。 另有研究證實，PI3K-PKB/Akt信號通路對重要抑癌基因p53的表達具有關(guān)鍵調(diào)控作用[31]。p53通路可通過對p53等基因的調(diào)控，引起胃癌細胞周期阻滯、老化及凋亡。VEGF信號通路包括VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3等不同途徑，腫瘤血管生成在腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移中起著重要作用，VEGF的作用機理為刺激血管內(nèi)皮細胞的增殖與遷移，促進腫瘤組織的血管及淋巴管新生，對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移進行調(diào)控[32-34]。研究發(fā)現(xiàn)胃癌伴隨淋巴管侵犯患者癌組織中VEGFC、VEGF-D、VEGFR3的表達強于癌旁組織[35]，VEGF信號通路與消化道腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)。體外實驗顯示，三棱-莪術(shù)通過降低胃癌發(fā)展過程中的關(guān)鍵分子VEGF、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的含量，從而抑制腫瘤生長[11]。 此外，VEGF亦受到PI3K-PKB/Akt信號通路的調(diào)控，PI3K-PKB/Akt信號通路可影響包括VEGF在內(nèi)的多種促血管新生因子，促進腫瘤血管新生[36]。TNF信號通路主要在細胞自穩(wěn)、細胞凋亡中發(fā)揮巨大作用，其中TNF-α作為該通路的核心成員，可維持體內(nèi)免疫平衡，誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡。TNF-α通過和細胞表面的受體相結(jié)合后發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)，引起下游如抑制性卡巴蛋白 （I-κBα，IkBα）、NF-κB p65亞基蛋白等一系列蛋白的磷酸化，亦可由此激活MAPK、JNK、NF-κB信號通路，導(dǎo)致腫瘤、炎癥及免疫性疾病的發(fā)生[37]。Rossi等[38]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌中TNF與其受體2（TNF receptor 2，TNFR2）結(jié)合介導(dǎo)細胞存活基因上調(diào)，而CASP3、TNFR1等促凋亡基因下調(diào)，有利于其促腫瘤作用的發(fā)揮?？傊煌男盘柾吠緩讲⒎仟毩l(fā)揮作用，它們以腫瘤相關(guān)基因、細胞因子、酶等為物質(zhì)基礎(chǔ)，相互協(xié)調(diào)，共同參與機體腫瘤的發(fā)病進程。

KEGG通路富集與GO功能富集從不同側(cè)面揭示了三棱-莪術(shù)的抗胃腫瘤作用機制，二者相互聯(lián)系，互為補充。GO功能富集結(jié)果提示，三棱-莪術(shù)藥對主要通過調(diào)控細胞增殖周期，實現(xiàn)對細胞核、細胞質(zhì)、DNA轉(zhuǎn)錄、RNA聚合酶Ⅱ啟動子等及對類固醇激素受體活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性的調(diào)控，發(fā)揮抗腫瘤生物學(xué)作用。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)中的β-欖香烯、姜黃素、莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮、莪術(shù)酮等成分通過直接細胞毒性、阻斷細胞生長周期、激活機體免疫系統(tǒng)等發(fā)揮抗癌作用[12，39]；姜黃素可抑制DNA甲基化，上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達，同時抑制MMP的表達，從而能夠抑制腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移[40-41]；莪術(shù)醇可上調(diào)B細胞淋巴瘤-2相關(guān)x蛋白（B cell lymphoma-2 associated x protein， bax）、下調(diào)B細胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2，bcl-2）基因的表達，將胃癌細胞阻滯于S期和G2期，抑制胃癌細胞增殖[42]。三棱中活性成分三棱內(nèi)酯B、三棱總黃酮、鋁絡(luò)合黑三棱堿三糖苷具有改善機體微環(huán)境、抗腫瘤血管新生、調(diào)節(jié)免疫等功效[43]。三棱總黃酮通過干擾細胞有絲分裂、阻滯細胞周期來抑制腫瘤增殖[44]，亦能下調(diào)VEGF等蛋白的表達，誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡[45]。趙航等[46]將胃癌根治術(shù)后患者分為化療組及化療加三棱莪術(shù)中藥組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)化療加三棱莪術(shù)中藥組患者臨床癥狀明顯減輕，且腫瘤相關(guān)標(biāo)志物血清VEGF、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、腫瘤抗原125（cancer antigen 125， CA125）、腫瘤抗原724（cancer antigen 724，CA724）含量較化療組明顯降低。由此可見，基礎(chǔ)及臨床研究從不同角度均驗證了三棱-莪術(shù)藥對胃癌的治療作用，其作用機制以調(diào)控腫瘤細胞生長周期及干預(yù)相關(guān)信號傳導(dǎo)通路為主。

綜上所述，胃癌的形成與發(fā)展是一個由多基因調(diào)控、多因素參與、多信號通路交叉作用的復(fù)雜過程，其治療至今仍然是一個世界性難題[47]。中藥以其“多成分、多靶點、多途徑”的特點在胃癌防治方面展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，分析活血祛瘀之代表藥對三棱-莪術(shù)治療胃癌的有效活性成分、關(guān)鍵靶點和信號通路，為闡明其抗胃腫瘤的具體作用機制提供了客觀依據(jù)。