一種新型氟化物單體和聚合物19F-MRI成像性能對比

王昱青 黃平升 郭宏博胡西學(xué)王東亮王 婷何芳菲*

(1 國家納米科學(xué)中心納米技術(shù)發(fā)展部 北京 100190，2 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所 天津 300192)

19F原子體內(nèi)豐度極低(<10-6M)、活體成像時特異性高、便于建立標準曲線定量計算、成像靈敏度達到1H原子的83%，近年來19F核磁成像技術(shù)(19F magnetic resonance imaging,19F-MRI)受到廣泛關(guān)注[1，2]。由于19F-MRI是在19F原子進動頻率范圍內(nèi)直接對氟化物進行成像，因此成像信號強度(signal intensity, SI)與化合物中可成像的19F原子豐度密切相關(guān)。

由氟含量最高的超疏水全氟化合物，如全氟化碳(PFC)、全氟聚醚(PFPE)及全氟冠醚(PFCE)等制備的納米乳造影劑，被率先用于19F-MRI成像研究[3-9]。但是其在肝臟和脾臟中快速富集以及長期滯留，為實現(xiàn)其臨床應(yīng)用增加了安全性障礙。為了提高生物安全性，由兩親性氟化分子自組裝構(gòu)建的“智能”納米探針，被應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、pH、氧化還原微環(huán)境、離子和活性氧等生物活性分子/生物信號檢測和腫瘤診斷研究[10-15]。但是分子結(jié)構(gòu)中可檢測的氟含量不足，成為制約自組裝智能納米造影劑體內(nèi)成像效果的瓶頸。另外，一些研究組利用磁性離子順磁弛豫增強效應(yīng)調(diào)控19F弛豫率的方式，將幾個19F化合物分子與金屬離子配形成螯合物，通過自組裝方式形成團簇等，旨在通過加快成像速度提高單位時間內(nèi)采集到的信號強度[16，17]。但是自組裝團簇和金屬螯合物橫向弛豫率過高，在成像信號采集之前，已經(jīng)嚴重衰減，難以獲得理想的成像結(jié)果。針對這些問題，本團隊提出了超親水19F-MRI造影劑的設(shè)計和制備策略；合成了具有羧酸甜菜堿兩性離子結(jié)構(gòu)的N-(2-甲基丙烯酸乙酯) -N-(3, 3,3-三氟丙基)-N-甲基甘氨酸分子(CBF3)，分子結(jié)構(gòu)式如圖1(左)所示，分子式為C12H19F3NO4+，分子量為298.28；具有分子量小，超親水，代謝速度快等特點[18]。但其縱向弛豫率低，成像速度慢，成像時間窗較短，制約其作為19F-MRI造影劑的活體成像性能。為此，我們利用可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移(reversible addition-fragmentation chain transfer, RAFT)聚合制備均聚物(PCBF3)，分子結(jié)構(gòu)式如圖1(右)所示，此方式不會降低分子結(jié)構(gòu)中的氟含量。期望利用PCBF3結(jié)構(gòu)中19F的自旋-自旋耦合作用，顯著提高其縱向弛豫率和橫向弛豫率，有效地提升成像速度和延長成像時間窗，改善成像性能。

圖1 氟化物單體和聚合物結(jié)構(gòu)式 (左).單體分子結(jié)構(gòu)；(右).聚合物分子結(jié)構(gòu)

評價CBF3或PCBF3的成像性能包括體外和活體成像兩部分。首先，采用多反轉(zhuǎn)恢復(fù)時間(multi-TI-IR-SE)方法，定量計算下列成像參數(shù)：縱向弛豫值(R1)、橫向弛豫值(R2)、磁化矢量(M19F)，評估CBF3和PCBF3的體外成像性能并建立濃度相關(guān)標準曲線[19，20]。然后，通過標準曲線計算CBF3和PCBF3的活體濃度，評估CBF3或PCBF3的活體成像性能[21-23]。為了能夠綜合評估造影劑總注射量、代謝速度等因素對成像性能的影響，我們引入：活體成像利用率(imaging availability in-vivo, IAIV)。該參數(shù)主要衡量19F化合物注入體內(nèi)后，某一時間點活體成像時，總注射劑量的實際可利用比率，比例越高表明該種19F化合物作為造影劑的成像利用率越高、成像時間窗越長，有望獲得更好成像性能。

19F-MRI作為一種新興的核磁成像技術(shù)，可對進入體內(nèi)的外源含氟分子進行專一性可視化研究，在疾病精準診斷、量化示蹤生物活性分子和細胞等方面具有重要的意義。因此，本研究中設(shè)計的化合物以及建立的評價方法，對優(yōu)化19F化合物作為造影劑的成像性能，促進19F-MRI在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用具有重要作用。

1 實驗方法

1.1 材料

CBF3由中國醫(yī)科院生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供，分子式為C12H19F3NO4+，PCBF3由RAFT聚合制備。RAFT聚合合成方法：在shlenk反應(yīng)管中依次加入RAFT轉(zhuǎn)移劑苯基-(2-羥乙基)硫代碳酸酯(0.1 mM)、N-(2-氟乙基)-N-(2-甲基丙烯酸乙酯)-N-甲基甘氨酸單體(20 mM)、引發(fā)劑偶氮二異丁腈(0.01 mM)和溶劑二甲基甲酰胺(3 mL)，抽真空/通氬氣3個循環(huán)后，密閉反應(yīng)管, 在68～72℃的油浴中反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，加入DMF溶解，裝入透析袋中(截留分子量3500 Da)，用去離子水透析72 h，每12 h更換一次。之后，冷凍干燥得到PCBF3聚合物?？梢酝ㄟ^調(diào)整單體和鏈轉(zhuǎn)移劑的摩爾比，進而調(diào)控聚合物的聚合度。

1.2 體外37oC條件下19F-MRI成像

采用國家納米科學(xué)中心小動物核磁共振譜像系統(tǒng)(Bruker Biospec 70/20 USR)對CBF3或PCBF3進行成像。將CBF3或PCBF3水溶液置于0.5 mL離心管中，濃度分別為20、401、680和100 mg/mL，利用循環(huán)水浴加熱恒溫至37℃，放入19F/1H雙頻鳥籠線圈中進行波譜檢測和體外成像。采用multi-TI-IR-SE序列測量樣本的19F-MRI圖像，參數(shù)如下：TE/TR=1.88/5000 ms，TI=100/300/…/1100 ms, FA=90°, FOV=50×50mm, MTX=100×100, slice thickness=4mm, slice number=1, NEX=10。

體外成像參數(shù)R1、R2、M19F值的計算公式如下：

SI=M19F×(1-2×e(-TI×R1)+e(-TR×R1))×e(-TE×R2)

(1)

SI：采集的CBF3或PCBF3的信號強度；TI：反轉(zhuǎn)時間；TR：重復(fù)時間；TE：回波時間。利用Levenberg-Marquardt算法進行曲線擬合，計算37oC時所有濃度CBF3或PCBF3的R1、R2、M19F值及它們與濃度的對應(yīng)關(guān)系r1、r2、m19F值。

1.3 活體成像

Balb/c小鼠(雌，6～8周)尾靜脈注射200 μL濃度100 mg/mL的CBF3或PCBF3，2小時后水合氯醛腹腔麻醉后，將小鼠放入19F/1H雙頻鳥籠線圈中，通氧氣和循環(huán)水維持小鼠生理狀態(tài)，檢測CBF3或PCBF3在活體水平上的波譜。然后，將成像的工作頻率與體外測量工作頻率調(diào)節(jié)一致，進行活體19F-MRI圖像采集，采用IR-SE序列，參數(shù)如下：TE/TR=1.88/5000 ms, TI=0ms, FA=90°, FOV=50×50mm, MTX=100×100, slice thickness=4mm, slice number=5, NEX=10。相應(yīng)的，測量1H-MRI圖像作為背景圖，采用TSE序列，參數(shù)如下：TE=4.64ms, TR=300ms, FA=90°, FOV=50×50 mm, MTX=256×256, slice thickness=1mm, slice number=20, ETL=2。

1.4 活體成像速度計算

活體成像速度與MTX中的相位編碼數(shù)量和TR參數(shù)相關(guān)，當(dāng)TI=0、MTX值固定時，活體成像速度僅由TR決定。根據(jù)公式(1)，在保持T1成分(1-e(-TR×R1))不變的情況下，根據(jù)R1值可以計算出對應(yīng)的TR值。

1.5 活體濃度和活體成像利用率定量計算

定量計算CBF3或PCBF3活體濃度包括兩個步驟，第一步：通過體外成像建立CBF3或PCBF3的SI與濃度對應(yīng)的標準曲線；第二步：將活體成像采集的SI代入標準曲線，計算CBF3或PCBF3活體濃度分布[24-26]。選取活體成像時背景噪聲的平均SI為閾值，計算對應(yīng)的濃度閾值。然后將高于閾值的濃度分布圖疊加到小鼠的1H-MRI圖像上觀察濃度分布?；铙w成像利用率IAIV計算公式如下：

(2)

C：體素i的濃度；V：體素i的體積；n：高于濃度閾值的體素個數(shù)；M：總注射量。然后計算活體成像時CBF3或PCBF3工作頻率的譜峰信噪比與體外成像時同濃度同體積CBF3或PCBF3的譜峰信噪比的比值(RIA)，將波譜結(jié)果與成像結(jié)果進行比較。

2 實驗結(jié)果

2.1 R1值

37℃時PCBF3的R1值比CBF3的R1值顯著升高(p=3.363*10-15< 0.001), R1值平均升高了約125.9%。如圖2所示，PCBF3濃度與R1之間的相互關(guān)系r1=0.00003(p=0.0577>0.05)，表明PCBF3的R1值與濃度之間無顯著的線性關(guān)系，在該濃度范圍內(nèi)PCBF3的R1值為一個常數(shù)1.83 s-1；CBF3濃度與R1之間的相互關(guān)系r1=0.000015(p=0.0749>0.05)，表明CBF3的R1值與濃度之間無顯著的線性關(guān)系，在該濃度范圍內(nèi)CBF3的R1值為一個常數(shù)0.81 s-1。

圖2 CBF3和PCBF3的R1與濃度的線性關(guān)系r1

2.2 R2值

37℃時PCBF3的R2值比CBF3的R2值顯著升高(p=4.192*10-19<0.001), R2值平均升高了約1126.9%。如圖3所示，PCBF3濃度與R2之間的相互關(guān)系r2=0.00001(p=0.1393>0.05)，這表明R2值與濃度之間無顯著的線性關(guān)系，在該濃度范圍內(nèi)PCBF3的R2值為一個常數(shù)20.49 s-1；CBF3濃度與R2之間的相互關(guān)系r2=0.000001(p=0.1423>0.05)，這表明R2值與濃度之間無顯著的線性關(guān)系，在該濃度范圍內(nèi)CBF3的R2值為一個常數(shù)1.67 s-1。

圖3 CBF3和PCBF3的R2與濃度的線性關(guān)系r2

2.3 M19F值

37℃時PCBF3的M19F值比CBF3的M19F值顯著升高(p=0.005<0.01)，M19F值平均升高了約32.3%。如圖4所示，PCBF3濃度與M19F之間的相互關(guān)系m19F=0.316 (p=4.18*10-6<0.001)，這表明M19F值與濃度之間存在顯著的線性關(guān)系；CBF3濃度與M19F之間的相互關(guān)系m19F=0.241 (p=4.1*10-6<0.001)，這表明M19F值與濃度之間存在顯著的線性關(guān)系。根據(jù)公式(1)，當(dāng)TI時間固定后，CBF3或PCBF3的SI僅與M19F呈線性關(guān)系。

圖4 CBF3和PCBF3的M19F與濃度的線性關(guān)系m19F

2.4 建立標準曲線

將公式(1)中TI/TE/TR分別設(shè)定為0/1.88/5000 ms時，根據(jù)上述參數(shù)計算結(jié)果，PCBF3的M19F值與SI之間的線性關(guān)系為：SI= 0.9621*M19F，濃度與M19F值的線性關(guān)系為：C= 3.169*M19F-2.701(R2=0.9995)；CBF3的M19F值與SI之間的線性關(guān)系為：SI=0.9795*M19F，濃度與M19F值的線性關(guān)系為：C= 4.146*M19F-1.961。將PCBF3和CBF3各自的兩組線性關(guān)系結(jié)合，PCBF3的標準曲線為：C= 3.294*SI-2.701(R2=0.9994)，即CBF3的標準曲線為：C= 4.233*SI-1.961。

2.5 活體成像速度

CBF3活體成像時參數(shù)如下：R1=0.81s-1, NEX=10, TI=0, TR=5000 ms, acquired time=1140 s，CBF3活體成像時間為1140s。根據(jù)公式(1)如果PCBF3和CBF3的T1成分(1-e(-TR×R1))相同，則PCBF3活體成像時參數(shù)如下：R1=1.83 s-1, NEX=10, TI=0, TR=2213 ms, acquired time=505s, 即PCBF3活體成像時間為505s。

2.6 活體濃度及活體成像利用率

將活體成像時采集到的CBF3或PCBF3的SI分別代入各自的標準曲線計算，獲得活體濃度分布圖，結(jié)果如圖5所示。體外、活體19F-MRS結(jié)果如圖5右側(cè)所示。圖5a為CBF3的注射后2小時活體濃度分布圖；圖5b為PCBF3的注射后2小時活體濃度分布圖。CBF3或PCBF3的活體成像利用率IAIV值和波譜分析結(jié)果RIA值，結(jié)果如表1所示。如圖5a所示，尾靜脈注射后2小時后其他臟器組織廓清，CBF3全部匯聚于膀胱。表1顯示，CBF3注射后2小時的IAIV為8.3%，波譜分析計算出的RIA為8.1%，結(jié)果基本一致。如圖5b所示，PCBF3注射后2小時廣泛地分布在血管、各臟器、肌肉等區(qū)域。表1顯示，PCBF3注射后2小時的IAIV為84.7%，波譜分析計算出的RIA為84.3%，兩者基本一致。

表1 CBF3和PCBF3的IAIV和RIA

圖5 CBF3和PCBF3的活體濃度分布圖和波譜圖左側(cè)圖a表示CBF3注射后2小時活體濃度分布圖；左側(cè)圖b表示PCBF3注射后2小時活體濃度分布圖；右側(cè)上兩幅圖分別表示CBF3的體外和體內(nèi)波譜圖；右側(cè)下兩幅圖分別表示PCBF3的的體外和體內(nèi)波譜圖。

3 討論

本研究利用multi-TI-IR-SE方法在體外37oC溫度條件下分別計算了CBF3和PCBF3的R1、R2、M19F值，并建立了CBF3和PCBF3的SI與濃度的標準曲線，依據(jù)各自的標準曲線，分別計算CBF3和PCBF3的活體成像利用率。

計算結(jié)果表明，PCBF3的R1、R2、M19F值均比CBF3的明顯升高。PCBF3的R1值升高是因為其分子結(jié)構(gòu)由CBF3重復(fù)單元通過碳碳鍵鏈接形成，分子量大，其進動頻率與周圍晶格的進動頻率更接近，高能級19F原子更容易向周圍晶格釋放能量，縱向弛豫時間變短[27]。PCBF3的R2值升高是因為19F原子間自旋-自旋耦合作用更強，19F原子散相速度更快，橫向弛豫時間更短[28]。雖然PCBF3的氟含量與CBF3相同，但CBF3分子量小，37℃時在主磁場中處于低能級的19F原子更容易躍遷至高能級。相比之下，PCBF3分子量大，37℃時在主磁場中處于低能級的19F原子不易躍遷至高能級?？偟谋憩F(xiàn)是PCBF3中低能級與高能級19F原子數(shù)量比值，相比CBF3增加，因而PCBF3的M19F更高[16-19]。

從信號強度貢獻度來看，PCBF3或CBF3的SI均由T1、T2和M19F 3個成分組成。與同濃度的CBF3相比，R1值升高使得PCBF3的SI的T1成分增強了1.76%，R2值升高使得PCBF3的SI的T2成分減弱了3.48%，M19F值升高使得PCBF3的SI的M19F成分增強了約32.3%。因此，同濃度的PCBF3與CBF3之間的SI差別主要來源于M19F值。此外，如果和CBF3保持相同的T1成分信號強度貢獻度，由于PCBF3的R1值升高活體成像速度可以提高約2.26倍。

從濃度依賴性來看，無論是PCBF3還是CBF3，僅M19F值具有濃度依賴性。37℃時，PCBF3或CBF3的R1值在20 ～ 100 mg/mL濃度范圍內(nèi)均為常數(shù)，其原因是在該溫度下不同濃度兩者的分子運動自由度差異很小[29]。PCBF3或CBF3的R2值在20 ～ 100 mg/mL濃度范圍內(nèi)均為常數(shù)，這是因為不同濃度PCBF3或CBF3的溶解性很好，沒有分子間自旋耦合現(xiàn)象發(fā)生[29]。PCBF3和CBF3的M19F值與濃度均存在顯著線性關(guān)系，這是因為M19F值是用來定量描述某一溫度下處于主磁場中單位體積溶液里低能級比高能級多出來的19F原子總數(shù)，即成像可利用的19F原子密度，因而化合物濃度越高則19F原子密度越高，即M19F值越高[2]。

從活體成像來看，如圖5a所示，活體濃度分布圖表明CBF3在注射后2小時后，全部匯聚于膀胱，在其它組織很難檢測到信號。圖5中活體19F-MRS譜圖顯示，工作頻率譜峰的信噪比很低，與單體的生物分布結(jié)果一致。表1結(jié)果顯示，CBF3的活體成像利用率IAIV僅8%左右，表1波譜計算結(jié)果RIA為8.1%，與成像方法計算的結(jié)果基本吻合。綜合表明CBF3在體內(nèi)代謝速度很快，并未與體內(nèi)蛋白或細胞等發(fā)生結(jié)合；該結(jié)果可歸因于CBF3的分子結(jié)構(gòu)，其分子量僅298，親水性好，代謝速度非?？欤虼烁髋K器的成像時間窗很短。如圖5b所示，活體濃度分布圖表明PCBF3在注射后2小時主要分布在腹主動脈、各臟器、肌肉等區(qū)域。PCBF3濃度的生物分布結(jié)果表明其較為穩(wěn)定，代謝過程較長(代謝動力學(xué)分析和活體成像結(jié)果顯示48小時后基本代謝完成)。表1結(jié)果顯示PCBF3的活體成像利用率達到84%左右，波譜計算結(jié)果RIA與成像方法計算的結(jié)果基本吻合。從結(jié)構(gòu)上來說，PCBF3的活性官能團得到保護，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高，分子量較大，代謝速度降低，成像時間窗更長。

綜上所述，PCBF3的活體成像性能更好，但是也存在進一步優(yōu)化的地方。比如19F-MRS譜圖顯示PCBF3的譜峰半高寬較寬，這將導(dǎo)致其19F原子在工作頻率內(nèi)吸收射頻能量效率不一致，成像性能比理論水平有所降低；此外，PCBF3的R2值增高會帶來成像信號的T2成分衰減。因此，下一步研究將重點探討聚合度對PCBF3成像效能的影響，以及通過序列優(yōu)化消除T2成分衰減的問題。

4 結(jié)論

本研究采用19F-MRS/MRI相結(jié)合的方法，定量分析了CBF3和PCBF3的成像性能。相比之下，PCBF3的活體成像利用率更高，可以延長成像時間窗、提升成像速度，成像性能更好；作為19F-MRI造影劑在活體核磁成像方面更具潛力。