干酪乳桿菌Lactobacillus casei及相近菌種的分類變遷

張哲，于學(xué)健，曹艷花，姚粟

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，北京，100015)

干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei,L.casei)作為乳酸菌中一個(gè)有重要應(yīng)用價(jià)值的菌種，常作為益生菌的候選菌[1-4]，呈革蘭氏陽性，不產(chǎn)芽胞，無鞭毛，不運(yùn)動(dòng)，兼性異型發(fā)酵乳糖，不液化明膠，接觸酶陰性；最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃，菌體長(zhǎng)短不一，兩端方形，常成鏈；菌落粗糙，灰白色，有時(shí)呈微黃色；生化反應(yīng)能發(fā)酵多種糖，可以發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸[2,5]。其在自然界中分布廣泛，是人類口腔、腸道和陰道中的正常菌種。同時(shí)也是一種應(yīng)用廣泛的菌種，常被應(yīng)用于制備發(fā)酵乳制品和益生菌制劑，其中最為人們所熟知的就是干酪乳桿菌代田株(L.caseistrain Shirota)[6]。盡管干酪乳桿菌有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值，但長(zhǎng)期以來人們對(duì)于干酪乳桿菌及其相近菌種的分類一直存在爭(zhēng)議。隨著分類學(xué)方法和技術(shù)的不斷進(jìn)步，知曉干酪乳桿菌及其相近菌種的分類變遷，有助于更好地了解這一菌種及其未來在各個(gè)方面的應(yīng)用[7]。

1 Lactobacillus casei(干酪乳桿菌)及模式菌株

1.1 早期干酪乳桿菌的提出

干酪乳桿菌(L.casei)相關(guān)菌株最早是在1889-1891年由VON FREUDENREICH[8]提出，并命名為Bacillusα。但根據(jù)國(guó)際命名法，該名稱的后綴α不符合法律規(guī)定，所以該名稱最終未能正式發(fā)表[8]。

之后ORLA-JENSEN在1919年提到了Caseibacteriumvulgare這一名稱，但沒有將該名稱作為一個(gè)新的菌種名稱有效發(fā)布[8]。ORLA-JENSEN同時(shí)還提出過Streptobacteriumcasei(S.casei)這一名稱并在文章中發(fā)表，但是由于其屬名Streptobacterium是鏈球菌，但其為乳桿菌，所以這個(gè)名稱并不符合微生物命名法規(guī)，因而沒有被繼續(xù)使用[8]。

1.2 Lactobacillus casei的提出

L.casei這一名稱最早是在HOLLAND[9]的文章中出現(xiàn)的，但是在該文章中HOLLAND只是把其歸為乳桿菌屬下的一個(gè)種，并標(biāo)明ORLA-JENSEN為該名稱的提出者，并沒有對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)描述，所以L.casei這一名稱仍未在其文章中正式發(fā)表。

1923年BERGEY也在其文章中使用過L.casei這一名稱[8]，在之后其他人用到該名稱時(shí)，他經(jīng)常被認(rèn)為是L.casei的作者。但是，BERGEY并未在他的文章中提出過將L.casei作為一個(gè)新的菌種命名[8]。此外KRASILNIKOV也在文章中提到過L.casei這一名稱，但該名稱最終未能有效發(fā)表[8]。直到在1971年，HANSEN在文章中正式提出并有效發(fā)表了L.casei這一名稱，并將ATCC 393(即ORLA-JENSEN的S.caseiNO.7)指定為該菌種的模式菌株。

1.3 干酪乳桿菌的5個(gè)亞種

干酪乳桿菌(L.casei)最初的分類有5個(gè)亞種，分別是：L.caseisubsp.casei(1916年ORLA-JENSEN，1971年HANSEN提出)[8]；L.caseisubsp.pseudoplantarum(1965年ABO-LNAGA，KANDLER提出)[10]；L.caseisubsp.tolerans(1965年ABO-LNAGA，KANDLER提出)[10]；L.caseisubsp.rhamnosus(1968年HANSEN提出)[10]；L.caseisubsp.alactosus(1973年MILLS提出)[10-11]。

1.4 關(guān)于干酪乳桿菌的模式菌株的爭(zhēng)議

在1971年HANSEN[8]提出了干酪乳桿菌(L.casei)的模式菌株ATCC 393之后，關(guān)于干酪乳桿菌的模式菌株一直存在著爭(zhēng)議。

在1975年DELLAGLIO等[12]進(jìn)行的干酪乳桿菌亞種的DNA雜交實(shí)驗(yàn)中，除了NIRDC15和ATCC 15820之外的所有菌株與ATCC 393的同源性都很低，只有8%～46%。而這些菌株與ATCC 334的同源性在71%～85%。因此DELLAGLIO建議應(yīng)該重新考慮是否將ATCC 393定為干酪乳桿菌的模式菌株。

1989年COLLINS等[13]進(jìn)行的干酪乳桿菌DNA同源性實(shí)驗(yàn)也表明大多數(shù)干酪乳桿菌的菌株與模式菌株ATCC 393的同源性很低。

1991年DELLAGLIO等[14]通過DNA分子雜交試驗(yàn)和可溶性細(xì)胞總蛋白數(shù)值分析得出結(jié)論，干酪乳桿菌的亞種與ATCC 393的同源性都不高，但與ATCC 334在基因上十分相近。此外ATCC 393與L.rhanmosusATCC 15820(曾經(jīng)L.zeae的模式菌株)DNA同源性達(dá)到80%。因此DELLAGLIO提出ATCC 334應(yīng)取代ATCC 393作為干酪乳桿菌的模式菌株。但這一提議在1994年被國(guó)際細(xì)菌系統(tǒng)學(xué)委員會(huì)的司法委員會(huì)拒絕了[15]。

1996年DICKS[16]認(rèn)為司法委員會(huì)的拒絕理由無法令人信服，DICKS對(duì)不同的干酪乳桿菌進(jìn)行了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction，RAPD-PCR)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明L.caseisubsp.caseiATCC 393與其他干酪乳桿菌RAPD-PCR結(jié)果不同。他認(rèn)為ATCC 393不應(yīng)該作為干酪乳桿菌的模式菌株，而應(yīng)該是典型的L.zeae，同時(shí)ATCC 15820也應(yīng)該是L.zeae。此外ATCC 334是干酪乳桿菌的4種亞種中最具代表性的，它在基因上最適合作為干酪乳桿菌的模式菌株。

1997年MORI等[11]對(duì)干酪乳桿菌相近菌種的16S rRNA進(jìn)行了比較分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ATCC 334和其他的干酪乳桿菌菌株之間有相似的16S rRNA基因；ATCC 393有自己獨(dú)特的16S rRNA基因，與ATCC 15820、ATCC 334以及其他的L.paracasei都不同；ATCC 393與ATCC 334、L.paracasei之間的差異比ATCC 393與L.zeae之間的差異更大。

1998年ZHONG等[17]和1999年TYNKKYNEN[18]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也都支持DELLAGLIO在1991年的結(jié)論，即ATCC 334應(yīng)取代ATCC 393作為干酪乳桿菌的模式菌株。

2000年CHEN[15]對(duì)干酪乳桿菌相近菌株23S-5S rRNA基因間隔區(qū)編碼基因的比較分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ATCC 393的間隔區(qū)序列不同于其他干酪乳桿菌的間隔區(qū)序列(在長(zhǎng)度和序列異質(zhì)性上都不同)，而ATCC 334與其他干酪乳桿菌的LISR(長(zhǎng)基因間隔區(qū)長(zhǎng)度)及SISR(短基因間隔區(qū)長(zhǎng)度)的相似性均高于ATCC 393與其他干酪乳桿菌的相似性。這一研究結(jié)果支持DICKS在1996年提出用ATCC 334替代ATCC 393 作為干酪乳桿菌的模式菌株的建議。

2001年FELIS[19]對(duì)干酪乳桿菌的看家基因recA基因片段序列進(jìn)行了比較分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在系統(tǒng)發(fā)育樹上ATCC 393與L.zeae模式菌株ATCC 15820的距離相較于ATCC 393與ATCC 334之間的距離更近。而ATCC 334與L.paracasei之間的距離幾乎為0。通過實(shí)驗(yàn)得到的Knue值進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，ATCC 334和ATCC 393是2個(gè)完全不同的菌種。FELIS同樣認(rèn)為ATCC 393不應(yīng)該作為干酪乳桿菌的模式菌株，而應(yīng)該是ATCC 334。

在1996-2002年的國(guó)際原核生物系統(tǒng)學(xué)委員會(huì)(International Committee on Systematics of Prokaryotes，ICSP)會(huì)議上[20-22]都對(duì)DICKS等的觀點(diǎn)進(jìn)行了討論，2002年ICSP會(huì)議決定根據(jù)ICSP法規(guī)，將在之后的適當(dāng)時(shí)間通過投票解決這一問題。

在2002年，DELLAGLIO等[23]再一次對(duì)ATCC 393是否應(yīng)該作為干酪乳桿菌(L.casei)的模式菌株向司法委員會(huì)提出建議，他們認(rèn)為，ATCC 393不應(yīng)該作為干酪乳桿菌的模式菌株，因?yàn)樗诨蛏吓c干酪乳桿菌是不相符的?；?qū)嶒?yàn)的結(jié)果證明，ATCC 393和ATCC 15820是同一種。而在1996年L.zeae才被正確的認(rèn)識(shí)，這是導(dǎo)致ATCC 393被錯(cuò)誤分類的原因。根據(jù)這些研究結(jié)果，建議把ATCC 393歸為L(zhǎng).zeae。基于干酪乳桿菌沒有合適的模式菌株，建議將ATCC 334作為干酪乳桿菌的模式菌株。2004年DOBSON等[24]的研究結(jié)果也支持DELLAGLIO的結(jié)論。

但這一建議在2008年被國(guó)際細(xì)菌系統(tǒng)學(xué)委員會(huì)(International Committee of Systematic Bacteriology，ICSB)的司法委員會(huì)[25]拒絕了。司法委員會(huì)認(rèn)為L(zhǎng).casei的分類是基于ATCC 393的，而ATCC 334應(yīng)該屬于L.paracasei，取消L.paracasei這一分類并將其中的菌株ATCC 334作為L(zhǎng).casei的模式菌株這一提議不符合規(guī)范。

此外ATCC 334作為L(zhǎng).paracasei的菌株，不能將其認(rèn)定為L(zhǎng).casei的模式菌株。ATCC 393仍應(yīng)該是干酪乳桿菌的模式菌株，盡管它在遺傳學(xué)上與ATCC 15820相近，也應(yīng)該保留L.paracasei這一名稱，而非恢復(fù)L.zeae這一分類名稱。

2 Lactobacillus paracasei(副干酪乳桿菌)的提出及存在的爭(zhēng)議

2.1 Lactobacillus paracasei及亞種的提出

在1989年COLLINS[14]進(jìn)行的干酪乳桿菌(L.casei)DNA-DNA雜交實(shí)驗(yàn)中，L.caseisubsp.alactosus，L.caseisubsp.pseudoplantarum，L.caseisubsp.tolerans以及大多數(shù)的L.caseisubsp.casei的DNA之間的同源性都很高(65%～85%)，并且形成了獨(dú)立的同源性組。但是這些菌株與干酪乳桿菌的模式菌株ATCC 393的同源性都較低(10%～20%)，因此COLLINS建議將干酪乳桿菌的4個(gè)亞種L.caseisubsp.alactosus，L.caseisubsp.pseudoplantarum，L.caseisubsp.tolerans以及大部分的L.caseisubsp.casei劃分為一個(gè)新的獨(dú)立菌種即Lactobacillusparacasei,其中包含L.paracaseisubsp.paracasei、L.paracaseisubsp.tolerans兩個(gè)亞種。COLLINS在文章中也對(duì)L.paracasei及亞種進(jìn)行了描述。

2.2 Lactobacillus paracasei存在的爭(zhēng)議

L.paracasei這一分類提出后仍存在許多爭(zhēng)議，許多學(xué)者認(rèn)為ATCC 393不應(yīng)該作為鑒定L.casei的模式菌株，因而L.paracasei這一分類是錯(cuò)誤且不必要的。

1991年DELLAGLIO[14]通過DNA分子雜交試驗(yàn)得出結(jié)論，L.paracasei菌株在基因型上與干酪乳桿菌亞種的菌株的基因型十分相似，同源性均在75%以上，所以他建議取消L.paracasei這一分類。

1996年DICKS[16]對(duì)干酪乳桿菌及相近菌株進(jìn)行的RAPD-PCR實(shí)驗(yàn)、1998年ZHONG等[17]對(duì)干酪乳桿菌及相近菌株進(jìn)行的分子分型實(shí)驗(yàn)、1999年TYNKKYNEN等[18]對(duì)干酪乳桿菌及相近菌株進(jìn)行的脈沖場(chǎng)凝膠電泳實(shí)驗(yàn)以及2001年FELIS等[19]對(duì)干酪乳桿菌及相近菌株的看家基因recA基因片段序列的比較分析得出的系統(tǒng)發(fā)育樹都支持了DELLAGLIO的觀點(diǎn)。

基于上述研究結(jié)果，在2002年，DELLAGLIO等[23]向ICSB下屬的司法委員會(huì)提出取消L.paracasei這一分類，同時(shí)保留L.caseisubsp.casei和L.caseisubsp.tolerans這2個(gè)亞種的建議。該建議在2008年被司法委員會(huì)拒絕[25-26]。

3 Lactobacillus rhamnosus(鼠李糖乳桿菌)的提出

1975年DELLAGLIO等[12]對(duì)干酪乳桿菌(L.casei)的5個(gè)亞種進(jìn)行了DNA分子雜交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干酪乳桿菌的所有亞種中，除了L.caseisubsp.rhamnosus之外，其他的4個(gè)亞種之間的同源性都很高。而L.caseisubsp.rhamnosus和L.caseisubsp.casei的同源性只有33%～37%。在實(shí)驗(yàn)中，以L.caseisubsp.rhamnosusATCC 7469為參考菌株，實(shí)驗(yàn)用到的17個(gè)菌株中13個(gè)都被鑒定為L(zhǎng).caseisubsp.rhamnosus。此外，這些菌株與L.caseisubsp.caseiATCC 393、L.caseisubsp.caseiATCC 334、L.caseisubsp.alactosusATCC 27216和LactobacillusplantarumATCC 14917的同源性非常低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，L.caseisubsp.rhamnosus不應(yīng)該作為干酪乳桿菌的一個(gè)亞種，而應(yīng)該是一個(gè)獨(dú)立的菌種Lactobacillusrhanmosus。

1989年COLLINS等[13]，對(duì)干酪乳桿菌進(jìn)行了DNA同源性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明L.caseisubsp.rhamnosus的菌株之間表現(xiàn)出高度的同源性，但與其他乳桿菌之間的同源性很低。所以COLLINS同樣建議將L.caseisubsp.rhamnosus歸為一個(gè)獨(dú)立的菌種。

1991年DELLAGLIO[14]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證明了應(yīng)該將L.caseisubsp.rhamnosus歸為一個(gè)獨(dú)立的菌種Lactobacillusrhamnosus。

由于許多研究結(jié)果都表明L.caseisubsp.rhamnosus亞種的菌株之間同源性高，而與L.casei其他亞種之間的同源性都很低。此后L.rhanmosus作為一個(gè)新菌種得到廣泛的認(rèn)可和接受。

4 Lactobacillus zeae(玉米乳桿菌)的提出與合并

1973年，核酸雜交技術(shù)開始用于厭氧型細(xì)菌的分類[27]。在此之前，多數(shù)細(xì)菌的分類都是依據(jù)表型分型的結(jié)果，表型分型并不能保證微生物之間的同源性。

1959年KUZNETSOV首次分離并提出了Lactobacilluszeae這一名稱，并將其作為一個(gè)新的菌種。1964年KUZNETSOV將該菌種的模式菌株提交到美國(guó)模式菌株保藏中心(ATCC)，并編號(hào)為ATCC 15820。但是該名稱并未在其文章中發(fā)表，與此同時(shí)發(fā)現(xiàn)L.zeae與L.casei十分相似[28]。

1973年MILLS和LESSEL[28]對(duì)L.caseiATCC 393和L.zeaeATCC 15820進(jìn)行了核酸相關(guān)性鑒定和G+C含量測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ATCC 393與ATCC 15820除了在能否發(fā)酵鼠李糖方面不同外(ATCC 393不能發(fā)酵鼠李糖，ATCC 15820可以發(fā)酵)，其他特性均相同。核酸同源性鑒定結(jié)果為82%。G+C含量也十分相近(ATCC 15820 48%摩爾比，ATCC 393 49%摩爾比)。因此，MILLS和LESSEL認(rèn)為ATCC 15820應(yīng)該是歸為L(zhǎng).casei的一個(gè)新的菌株。根據(jù)表型分析結(jié)果，ATCC 15820應(yīng)該屬于L.caseisubsp.rhamnosus。但根據(jù)DNA鑒定結(jié)果，ATCC 15820應(yīng)該屬于L.caseisubsp.casei[28]。MILLS和LESSEL對(duì)ATCC 15820究竟應(yīng)該屬于干酪乳桿菌的哪一個(gè)亞種沒有給出明確的結(jié)論。此后對(duì)L.zeae是否應(yīng)該作為一個(gè)獨(dú)立菌種也爭(zhēng)議不斷。

1991年DELLAGLIO[14]通過DNA分子雜交試驗(yàn)和可溶性細(xì)胞總蛋白數(shù)值分析得到結(jié)果，干酪乳桿菌(L.casei)的亞種與ATCC 393 DNA的同源性都不高，但ATCC 393與ATCC 15820(曾經(jīng)L.zeae的模式菌株)DNA同源性達(dá)到80%。故DELLAGLIO提出，應(yīng)重新研究原本屬于L.zeae的菌株，并將L.zeae劃分為獨(dú)立的菌種。但這一提議在1994年被ICSB的司法委員會(huì)拒絕了[20]。

1996年DICKS[16]對(duì)干酪乳桿菌(L.casei)及相近菌種進(jìn)行的RAPD-PCR實(shí)驗(yàn)、1997年MORI等[11]對(duì)干酪乳桿菌及相近菌群的16S rRNA進(jìn)行的比較分析實(shí)驗(yàn)、2001年FELIS[19]對(duì)干酪乳桿菌及相近菌種看家基因recA基因片段序列進(jìn)行的比較分析實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都支持DELLAGLIO的觀點(diǎn)，即L.zeae(包含ATCC 15820及ATCC 393)應(yīng)該歸為獨(dú)立菌種。該觀點(diǎn)在2008年同樣被ICSB的司法委員會(huì)[25-26]以違反命名法為理由拒絕。

5 Lactobacillus chiayiensis sp.nov.的提出

2018年HUANG等[29]首次發(fā)表文章提出了Lactobacilluschiayiensissp.nov.這一與干酪乳桿菌菌群關(guān)系密切的新種。HUANG等分別從臺(tái)灣的牛糞和菲律賓的椰子汁中分離出2株菌NCYUAST和BCRC 18859(=NRIC 1947)，并采用了全基因組測(cè)序、3種看家基因(dnaK,pheS和yycH)比對(duì)分析和RAPD-PCR分析等多種方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果表明，NCYUAST和BCRC 18859是相同菌株，它們是屬于干酪菌群的新菌種，HUANG等將這一新種命名為L(zhǎng)actobacilluschiayiensissp.nov.，指定NCYUAST作為該菌種的模式菌株，并在文章中對(duì)該菌種進(jìn)行了描述。

6 Lactobacillus(乳桿菌屬)的分類變化

2020年，ZHENG等[30]通過對(duì)乳桿菌屬(Lactobacillus)的261個(gè)菌種的核心基因的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究、菌種之間的平均核苷酸一致性(average nucleotide indentity,AAI)比較、特征基因分析及菌種的生理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和生態(tài)學(xué)分析，提出將乳桿菌屬重新分為25個(gè)屬，其中包括乳桿菌屬和23個(gè)新的屬，同時(shí)建議將明串珠菌科(Leuconostocaceae)中的一個(gè)屬劃分到乳桿菌科(Lactobacillaceae)。根據(jù)這項(xiàng)研究，干酪乳桿菌群中的Lactobacilluscasei、Lactobacillusparacaseisubsp.paracasei、Lactobacillusparacaseisubsp.tolerans、Lactobacillusrhamnosus、Lactobacilluschiayiensis分別更名為L(zhǎng)acticaseibacilluscasei、Lacticaseibacillusparacaseisubsp.paracasei、Lacticaseibacillusparacaseisubsp.tolerans、Lacticaseibacillusrhamnosus、Lacticaseibacilluschiayiensis，其中乳桿菌屬包含了許多重要的益生菌資源，其分類的變化可能會(huì)影響到各國(guó)微生物相關(guān)行業(yè)法規(guī)的更新和菌種的應(yīng)用。

7 結(jié)論

干酪乳桿菌(L.casei)的提出及其相近菌種的分類爭(zhēng)議長(zhǎng)達(dá)一個(gè)世紀(jì)，其分類方法經(jīng)歷了從開始的表型分析到現(xiàn)在的多種分子生物學(xué)鑒定方法，到2020年，干酪乳桿菌經(jīng)重新分類并更名為L(zhǎng)acticaseibacilluscasei(干酪乳酪桿菌)[30]，其模式菌株依舊是ATCC 393。而副干酪乳桿菌(L.paracasei)也更名為L(zhǎng)actobacillusparacasei，其模式菌株為ATCC 25302，并保留了Lacticaseibacillusparacaseisubsp.paracasei、Lacticaseibacillusparacaseisubsp.tolerans兩個(gè)亞種。研究表明僅通過表型分析和16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析都無法將干酪乳桿菌群準(zhǔn)確鑒定到種，需要多種方法相互結(jié)合，特別是全基因組測(cè)序技術(shù)和菌種之間的平均核苷酸一致性分析。基于全基因組序列分析和系統(tǒng)發(fā)育的分類鑒定技術(shù)的應(yīng)用，將有助于干酪乳桿菌的科學(xué)分類。隨著未來分子生物學(xué)和分類學(xué)方法的不斷進(jìn)步，干酪乳桿菌及其相近菌種的分類可能依舊會(huì)發(fā)生變化[31-39]。

干酪乳桿菌及相近菌種作為重要的益生菌資源，長(zhǎng)期以來不僅是在酸奶，發(fā)酵乳飲料的生產(chǎn)、益生菌制品等食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[40-42]，而且近年來在微生物藥品開發(fā)、畜牧業(yè)[43]也得到了越來越多的應(yīng)用。干酪乳桿菌及其相近菌株的科學(xué)分類不僅有助于我們正確認(rèn)識(shí)菌種之間的進(jìn)化關(guān)系，而且對(duì)于益生菌類保健食品的規(guī)范也有著重要影響。例如，在國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局2005年頒布的《益生菌類保健食品申報(bào)與審評(píng)規(guī)定(試行)》[44]中，可用于保健食品的益生菌菌種名單包含了L.caseisubsp.casei這一亞種，而在現(xiàn)在的干酪乳桿菌分類中已無該亞種的存在。