多變量統(tǒng)計分析評價1-甲基環(huán)丙烯對牛心甘藍(lán)貯藏特性的影響

胡花麗，趙歡歡，羅淑芬，周宏勝，李建斌，李鵬霞,3*

1(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)設(shè)施與裝備研究所，江蘇 南京，210014)2(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，江蘇 南京，210014)3(江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇 南京，210014)

甘藍(lán)屬于十字花科蕓薹屬植物，在世界各地均有種植。由于它富含葉酸、抗壞血酸、硫代葡萄糖苷和蘿卜硫素等生物活性成分，在抗腫瘤、抗氧化及抗炎方面表現(xiàn)突出，因而深受消費(fèi)者的喜愛。盡管在低溫(0～2 ℃)下甘藍(lán)可貯藏3～4月，但在30 ℃左右的環(huán)境溫度下，甘藍(lán)的葉片組織易發(fā)生黃化，同時伴有腐爛黑斑癥狀的出現(xiàn)，致使其僅有2～4 d的貨架期[1]。因此研究者探索了多種處理方法，包括熱處理[2]、保鮮涂膜[3]及LED輻照[4]對甘藍(lán)貨架期及營養(yǎng)品質(zhì)的影響，但由于處理過程的繁瑣或食品安全等方面的原因，這些方法的應(yīng)用受到了限制。相比之下，比較推薦的方法為預(yù)冷和氣調(diào)處理，然而這2種方法的應(yīng)用受制于基礎(chǔ)設(shè)施的完備性。在實(shí)際生產(chǎn)中，甘藍(lán)的采收、流通及市場銷售常遭遇高溫環(huán)境的影響。因此有必要發(fā)展有效的采后處理技術(shù)，用以控制甘藍(lán)采后的衰敗，延長其貨架期。

甘藍(lán)葉片組織的鮮綠狀態(tài)與其葉綠素的水平有關(guān)。植物激素乙烯可促進(jìn)植物中葉綠素的降解[5]。相反，乙烯受體抑制劑1-甲基環(huán)丙烯(1-methylcyclopropene，1-MCP)可減緩多種園藝作物中葉綠素的降解。例如，AL-UBEED等[6]研究表明，1-MCP通過抑制葉綠素降解而延長了青菜的貨架期。在芹菜和香菜中也得到了同樣的結(jié)果[7-8]。表明1-MCP可作為一種控制葉菜組織黃化的采后處理措施。然而1-MCP 的這種有益影響常因作物種類、處理濃度及時間等因素的不同而不同。例如MENG等[9]的研究顯示，1-MCP處理可抑制白菜的脫幫，但澳大利亞學(xué)者發(fā)現(xiàn)1-MCP對白菜采后的貯藏特性無影響[10]?？梢?，1-MCP對蔬菜貯藏特性的影響依賴于其本身的特性。就甘藍(lán)而言，截至目前尚未見1-MCP對其貯藏特性影響的報道。

單一的分析方法往往不能滿足整體評價果蔬品質(zhì)的需要，然而多變量統(tǒng)計分析方法包括主成分分析、偏最小二乘回歸分析和通徑分析，可分別用于區(qū)別主效因子、確定參數(shù)間相關(guān)性、辨別直接效應(yīng)與間接效應(yīng)。為了探查1-MCP對甘藍(lán)采后貯藏特性和貨架期的影響，本研究分析了1-MCP對甘藍(lán)采后乙烯生成、呼吸速率、葉綠素降解、生物活性成分、抗氧化能力及亞硝酸鹽積累的影響，并結(jié)合多變量統(tǒng)計的分析方法，綜合評估了1-MCP處理對各參數(shù)的影響特點(diǎn)。研究結(jié)果不僅可拓展1-MCP的應(yīng)用范圍，并且可為控制常溫下甘藍(lán)采后的快速衰敗提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

新鮮牛心甘藍(lán)采購于南京眾彩物流批發(fā)市場的供貨基地，采購后1 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗室，挑選無機(jī)械損傷，無病蟲害，大小基本一致的甘藍(lán)為試驗材料。

將所選甘藍(lán)隨機(jī)分成2組，每組50顆。根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果，一組用1.0 μL/L 1-MCP在(25±1) ℃下熏蒸12 h，另一組為對照(CK)，在無1-MCP的條件下熏蒸同樣時間。熏蒸完成后進(jìn)行通風(fēng)30 min。隨后將所有的甘藍(lán)用帶孔塑料薄膜袋包裝，每處理設(shè)置3個重復(fù)。貯藏溫度為(25±1) ℃，相對濕度為85%～90%。貯藏期間每2 d取樣1次，用干凈的刀具切取甘藍(lán)最外面的3層外衣，液氮速凍后置于-70 ℃冰箱，用于相關(guān)指標(biāo)的測定。其中，葉綠素、乙烯和呼吸速率的測定采用同期鮮樣進(jìn)行。

1.2 儀器與設(shè)備

MIR-254恒溫箱,日本SaIlvo公司產(chǎn)品；UV-1102紫外可見分光光度計,上海天美科學(xué)儀器有限公司； A11 Basic液氮研磨器,艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；Sigma 3K15高速冷凍離心機(jī),美國Sigma-Aldrich公司；1260高效液相色譜儀,美國安捷倫科技有限公司；pH計,梅特勒-托利多儀器(中國)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總?cè)~綠素(chorophyll，Chl)含量

參考劉紅艷等[11]的方法。

1.3.2 乙烯和呼吸速率

乙烯的測定參照王瑤等[12]的方法略有改動。每組取36顆甘藍(lán)，其中每個平行12顆，稱重后置于密封箱中。于(25±1) ℃條件下密閉4 h 后取氣1 mL，用氣相色譜完成測定。色譜條件：FID檢測器，柱溫70 ℃，N2壓力0.5 MPa，H2壓力0.3 MPa，空氣壓力0.5 MPa，重復(fù)3次，外標(biāo)法定量。除了要打開鎳轉(zhuǎn)化爐外(375 ℃)，呼吸速率測定的其他條件與乙烯相同。

1.3.3 丙二醛(malondialdehyde，MDA)

MDA含量的測定參考高建曉等[13]的方法略有改動。稱取3 g甘藍(lán)樣品，加入5%三氯乙酸10 mL，研磨后所得勻漿在10 000 ×g下離心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL 0.67% 硫代巴比妥酸，混合后水浴煮沸30 min，冷卻后離心，分別取上清液測定在450、532、600 nm處的吸光值，計算MDA含量(mmol/kg)。

1.3.4 總硫代葡萄糖苷(glucosinolates,Glu)和蘿卜硫素(sulforaphane,Sulp)

總硫代葡萄糖苷含量的測定參照WEI等[14]方法，采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

蘿卜硫素的測定參考GUO等[15]的方法略有改動。稱取1.0 g甘藍(lán)樣品，加入5 mL蒸餾水，于37 ℃水解3 h后加入8 mL二氯甲烷，采用氮吹儀吹干后用2 mL 10%乙腈超聲溶解，過0.22 μm有機(jī)系膜，HPLC測定。液相色譜分析條件：XDB-C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；檢測波長254 nm，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30 ℃。流動相A為超純水，流動相B為乙腈，洗脫程序：0 min～25 min～30 min，10%乙腈～60%乙腈～100%乙腈。

1.3.5 亞硝酸鹽(nitrite,Nitr)和葉酸

亞硝酸鹽采用鹽酸萘乙二胺法[16]。

葉酸參照張毅[17]方法略有改動。稱取2 g甘藍(lán)樣品置于50 mL離心管遮光，加入10 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)，于離心管，置于氮吹儀上吹氮15 s，之后在90 ℃水浴10 min，后取出離心管，在避光條件下放入冰浴中冷卻，隨后在10 000×g離心15 min，取離心后的上清液過0.45 μm無機(jī)濾膜。高效液相色譜條件：A相為0.1 mol/L KH2OH-KOH溶液(pH 6.5)，B相為甲醇；采集數(shù)據(jù)時間為22 min；色譜柱：C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；流速1 mL/min；檢測器紫外檢測；波長280 nm；進(jìn)樣量20 μL；梯度洗脫程序[t(A/B)，V/V]：0 min(0/100)～3 min(0/100)～8 min(30/70)～13 min(30/70)～17 min(0/100)～22 min(0/100)。

1.3.6 抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)和總酚

抗壞血酸的測定采用鉬藍(lán)比色法[18]，稱取1.0 g甘藍(lán)樣品，加入5 mL草酸-EDTA溶液研磨成勻漿，(4 ℃，轉(zhuǎn)速為8 000×g條件下離心15 min)，取1 mL上清液，冰浴上依次加入4 mL草酸-EDTA溶液、0.5 mL偏磷酸-乙酸、1 mL 5%的H2SO4及2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的鉬酸銨溶液。將其混勻置于30 ℃水浴15 min后于760 nm處比色。同時以抗壞血酸含量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總酚的測定參考王亞楠等[19]的方法略有改動。稱取2 g甘藍(lán)樣品，加5 mL 80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇充分勻漿，4 ℃ 12 000×g離心20 min，上清液用于總酚的測定。取0.1 mL上清液，加0.9 mL蒸餾水，0.4 mL Folin試劑，于25 ℃反應(yīng)3 min，再加入1 mL飽和Na2CO3溶液，25 ℃反應(yīng)1 h，于760 nm測吸光值。以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

1.3.7 抗氧化能力及還原力

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0進(jìn)行鄧肯氏單因素方差分析(P< 0.05)和相關(guān)性分析，使用Simca-p 11.5進(jìn)行主成分和偏最小二乘分析，使用DPS 7.5進(jìn)行通徑分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 1-MCP對牛心甘藍(lán)貯藏特性的影響

表1的結(jié)果表明，隨著貯藏時間的延長，甘藍(lán)表面外衣組織中Chl含量不斷下降，相反MDA含量的變化呈增加趨勢。然而，1-MCP處理可減緩組織中Chl的降解和MDA的積累，反映出1-MCP處理甘藍(lán)的衰老進(jìn)程較緩；乙烯釋放量的結(jié)果表明，采后甘藍(lán)在貯藏第6天出現(xiàn)釋放高峰，1-MCP處理明顯降低了該峰值，也降低了其他時期組織中乙烯的釋放量；采后甘藍(lán)的呼吸高峰出現(xiàn)在貯藏的第2天，之后呈下降趨勢，1-MCP處理也降低了采后甘藍(lán)的呼吸速率。Nitr的測定結(jié)果顯示，在常溫貯藏過程中，采后甘藍(lán)中的Nitr有所積累，在貯藏第6天達(dá)到最大，相比之下，1-MCP處理維持了組織中較低的Nitr含量。

表1 1-MCP對采后甘藍(lán)衰老指標(biāo)、生物活性成分及抗氧化能力的影響

生物活性成分Glu、Sulp和葉酸的結(jié)果顯示，在甘藍(lán)的貯藏期間，Glu含量總體呈下降趨勢，Sulp和葉酸在貯藏第2天出現(xiàn)峰值后開始下降，然而1-MCP處理緩解了組織中Glu含量的下降，降低了Sulp和葉酸的峰值及其隨后的下降率，從而維持了采后牛心甘藍(lán)中較高的生物活性成分。

2.2 主成分分析

由圖1-a，圖1-b可知，前2個主成分(PC1和PC2)累積貢獻(xiàn)率為77.3%，可較好地反映整體數(shù)據(jù)信息。其中，Chl、Glu、葉酸、AsA、DPPH·清除率及·OH清除率在PC1正坐標(biāo)處具有較高載荷，MDA和Nitr在PC1負(fù)坐標(biāo)處載荷較高，表明PC1主要反映的是組織衰老及抗氧化活性的情況。PC1很好地區(qū)分了同一天內(nèi)CK和1-MCP處理的樣本。說明1-MCP對Chl、Glu、葉酸、AsA、DPPH·清除率、·OH清除率、MDA和Nitr變化的影響較明顯。此外，PC1還較好地將CK和1-MCP的樣本整體區(qū)分開來，即除貯藏第8天外，1-MCP處理組的樣本均分布在PC1正坐標(biāo)區(qū)域，而CK中僅有貯藏第2天的樣本分布在正坐標(biāo)區(qū)域。

聚類分析的結(jié)果(圖1-c)顯示，整個貯藏期的樣本可聚為三大類，第一層次為0 d、CK-2 d、1-MCP-2 d和1-MCP-4 d，然后與1-MCP-6 d、1-MCP-8 d聚為第二層次，最后與CK-4 d、CK-6 d和CK-8 d聚為第三層次。這一分類與圖1-b中PC1對CK和1-MCP樣本的區(qū)分結(jié)果一致。表明1-MCP處理甘藍(lán)的貯藏特性更接近于0 d的結(jié)果，這暗示其衰老進(jìn)程較對照緩慢。

2.3 相關(guān)性分析

圖2 牛心甘藍(lán)葉綠素與其他指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

2.4 偏最小二乘回歸分析

以葉綠素為因變量(Y)，其他指標(biāo)為自變量(X)，建立偏最小二乘回歸分析模型。由圖3-a可知，前2個變量解釋了X變量的74.0%以及Y變量的92.6%。其中，Glu、葉酸、AsA、總酚、DPPH·清除率、·OH清除率與葉綠素位于PC1的正坐標(biāo)處，表明其與葉綠素呈正相關(guān)；MDA和Nitr位于PC1的負(fù)坐標(biāo)處，表明其與葉綠素呈負(fù)相關(guān)，暗示葉綠素含量的下降伴隨著組織內(nèi)MDA和Nitr的積累。

同PCA分析的結(jié)果一致，偏最小二乘回歸分析的得分也顯示，在PC1坐標(biāo)軸上，可明顯區(qū)分同一天內(nèi)CK和1-MCP處理的樣本，以及CK和1-MCP處理樣本的整體情況；在PC2坐標(biāo)軸上，也可將同一天的CK和1-MCP處理樣本得以區(qū)分(圖3-b)。圖3-c進(jìn)一步分析了自變量對因變量影響的重要性，根據(jù)變量權(quán)重 > 1的原則，可得出對因變量葉綠素具有重要影響的自變量有7個，其重要性依次為葉酸>MDA>AsA>DPPH·清除率 > Glu > ·OH清除率。

a-因子載荷;b-得分;c-變量權(quán)重圖3 以葉綠素為因變量的偏最小二乘回歸分析的因子載荷圖、得分及變量權(quán)重

2.5 通徑分析

以牛心甘藍(lán)中的總?cè)~綠素作為因變量，進(jìn)行逐步回歸分析，得到的逐步回歸方程為：Y=-23.062 432 68-0.180 955 701 79X1+0.251 570 439 70X2-70.317 904 03X6+5.772 336 348X7+1.225 627 962 7X8+1.094 176 761 6X10-1.593 038 077 8X11。式中X1、X2、X6、X7、X8、X10和X11分別代表乙烯、呼吸、Nitr、葉酸、AsA、DPPH·清除率和·OH清除率。調(diào)整決定系數(shù)R2=0.998，并進(jìn)行顯著性檢驗，得該方程方差分析的F=714.46，P=0.002 9，說明該回歸方差有顯著意義，進(jìn)一步做通徑分析。各參數(shù)對葉綠素的直接通徑系數(shù)由大到小依次為DPPH·清除率、·OH清除率、葉酸、Nitr、AsA、呼吸和乙烯。具體來看，DPPH·清除率對葉綠素的直接通徑系數(shù)高達(dá)0.654 7，表明DPPH·清除率對葉綠素有較大的正直接作用，同時，DPPH·清除率通過葉酸、AsA及·OH清除率產(chǎn)生較大的正間接作用；葉酸、AsA及·OH清除率與葉綠素的損失有較高的直接相關(guān)性，且這三者主要通過DPPH·清除率起間接作用。乙烯的直接通徑系數(shù)較小，但通過Nitr和·OH清除率分別對甘藍(lán)葉綠素產(chǎn)生較高的間接作用。另外，呼吸和Nitr對甘藍(lán)葉綠素有一定的負(fù)直接作用，而葉酸、AsA及·OH清除率則起一定的正直接作用。

3 討論

單因素方差分析研究，主要關(guān)注因變量在單一因素影響下的變化過程。本研究首先對數(shù)據(jù)進(jìn)行了單因素方差分析。結(jié)果顯示，與對照CK相比，1-甲基環(huán)丙烯顯著降低了采后牛心甘藍(lán)中的乙烯釋放量，與其他果蔬上的研究結(jié)果一致[21]。同時，1-MCP處理降低了采后甘藍(lán)的呼吸強(qiáng)度。同樣，在李果實(shí)采后貯藏過程中也證實(shí)了對呼吸強(qiáng)度的抑制伴隨著低水平的乙烯釋放量[22]。葉綠素的測定結(jié)果顯示，伴隨牛心甘藍(lán)采后衰老進(jìn)程的發(fā)生，組織中的葉綠素含量不斷下降，然而1-MCP處理顯著減緩了葉綠素的下降。與1-MCP在青菜、芹菜和香菜上的研究結(jié)果一致[7]。

表2 以總?cè)~綠素為因變量的通徑分析結(jié)果

十字花科蔬菜是多種生物活性成分的絕好來源。例如多數(shù)十字花科蔬菜富含酚類、硫代葡萄糖苷和蘿卜硫素等物質(zhì)。CIESLIK等[23]研究顯示，采后西蘭花中的硫代葡萄糖苷損耗嚴(yán)重。同樣在甘藍(lán)的采后也存在硫代葡萄糖苷的損耗，但1-MCP處理減緩了其在衰老過程中的損耗。YUAN等[24]研究也發(fā)現(xiàn)，1-MCP處理可更好地保留采后西蘭花中硫代葡萄糖苷的含量。另外，1-MCP處理也減緩了組織中蘿卜硫素、葉酸含量的下降。這些結(jié)果表明1-MCP具有維持采后牛心甘藍(lán)部分生物活性成分的作用。

抗氧化物質(zhì)為園藝作物中的重要植化成分，它們具有多種作用。當(dāng)組織中的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平超過其清除能力，導(dǎo)致氧化脅迫的發(fā)生。氧化脅迫狀態(tài)與園藝作物的貯藏品質(zhì)密切相關(guān)[19]。本研究中，對甘藍(lán)采后組織抗氧化水平的測定發(fā)現(xiàn)，總體上，隨著衰老進(jìn)程的發(fā)生，組織的抗氧化能力下降，然而1-MCP處理可顯著減緩甘藍(lán)中抗氧化能力的下降。同樣，1-MCP也維持了采后西蘭花組織中較高的抗氧化水平[21]。高的抗氧化能力有助于保持組織中ROS的平衡狀態(tài)，進(jìn)而控制組織中MDA積累。這些結(jié)果表明，施加1-MCP可減緩采后甘藍(lán)的衰老進(jìn)程。

4 結(jié)論

單因素方差分析、主成分分析、相關(guān)性分析、偏最小二乘回歸分析、通徑分析這5種多變量分析方法的綜合結(jié)果表明，與對照相比，1-MCP處理抑制了采后甘藍(lán)中呼吸強(qiáng)度和乙烯的釋放水平，維持了組織中較高的抗氧化能力，進(jìn)而減緩了組織的衰老進(jìn)程。