章能勝,陳曉玲,胡豐林
1(安徽衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院 醫(yī)學(xué)系,安徽 池州,247099)2(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),微生物防治省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥,230036)
蟲生真菌因具有特異的殺蟲作用,并且與昆蟲長期協(xié)同進(jìn)化[1],已成為生物防治的重要材料[2-3],也是寶貴的藥用資源,如冬蟲夏草、蟬花等[4-6]。古尼蟲草[Cordycepsgunnii(Berk.)Berk. ]是寄生于蝙蝠蛾幼蟲的一種蟲草[7],其藥用作用與冬蟲夏草生藥相當(dāng),古尼擬青霉(PaecilomycesgunniiLiang)為古尼蟲草的無性型[8]。近年來,對古尼擬青霉液體發(fā)酵活性成分[9]和藥理作用[10-13]的研究較多,但對其固體培養(yǎng)物研究較少。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)古尼擬青霉固體發(fā)酵培養(yǎng)物有較強(qiáng)的抗氧化活性。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上對古尼擬青霉產(chǎn)抗氧化活性成分進(jìn)行分離純化與鑒定,為規(guī)?;a(chǎn)提供基礎(chǔ)。
1.1.1 供試菌種
古尼擬青霉,采自安徽省金寨縣,分離于蝙蝠蛾科幼蟲,菌株編號為RCEF4117,由安徽省微生物防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供(菌庫國際微生物數(shù)據(jù)中心登記號為WDCM No.1031)。
1.1.2 培養(yǎng)基
基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖40 g,蛋白胨10 g,酵母浸粉10 g,瓊脂20 g,配制好后用蒸餾水定容至1 L。
1.1.3 儀器與設(shè)備
6210 TOF高分辨液質(zhì)聯(lián)用分析儀(liquid chromatography/mass spectrometry,LC/MS),美國安捷倫公司;SPD-M20A高效液相色譜儀,日本島津公司;Atlantis dC18(5 μm,3.9 mm×150 mm)分析型色譜柱、Atlantis dC18(5 μm,10 mm×150 mm)半制備型色譜柱,美國沃特世公司;Spectra Max M2酶標(biāo)儀,美國Molecular device公司;LRT-250G光照培養(yǎng)箱,廣東省醫(yī)療器械廠;分析級甲醇,上海建信化工有限公司;色譜級甲醇,美國天地(Tedia)公司。
1.2.1 樣品制備
按照1.1.2配制好培養(yǎng)基,高壓蒸汽滅菌20 min后待冷卻至55 ℃左右倒培養(yǎng)皿。待培養(yǎng)基完全冷卻凝固,將剪好的玻璃紙(已滅菌)平鋪覆蓋在培養(yǎng)基上方,用移液器接種1 mL種子液于玻璃紙表面,置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為25 ℃,時間為8 d,培養(yǎng)好后刮取玻璃紙上方的菌絲冷凍干燥備用。將凍干菌絲粉碎,稱取古尼擬青霉固體培養(yǎng)菌絲凍干粉100 g,按照料液比1∶30(g∶mL)加入甲醇,超聲波浸提30 min,提取功率為80 kHz,提取溫度為40 ℃。提取液經(jīng)真空濃縮凍干后備用。
1.2.2 抗氧化活性測定
本研究采用二苯代苦味肼基(1,1-dipheny1-2-picrylhyldrazyl,DPPH)自由基法測定自由基清除率來表示抗氧化活性,具體選擇了測定抗氧化活性較方便快捷的酶標(biāo)儀實(shí)驗(yàn)法(DPPH-Microplate)[14-16]和薄層色譜實(shí)驗(yàn)法(DPPH-thin layer chromatography,DPPH-TLC)[17]。DPPH自由基清除率計算如公式(1)所示:
(1)
式中:Ap,樣品加入DPPH試液的吸光值;Ac,樣品不加入DPPH試液的吸光值;Am,不加樣品(以100%甲醇代替)DPPH試液的吸光值。
1.2.3 LC/MS條件
MS條件:ESI離子源,霧化氣壓為35 Psi,液相色譜到質(zhì)譜的分流比為4∶1,氮?dú)饬魉?2 L/min;陽離子下離子化電壓為4 000 V,碎片電壓250 V,陰離子下離子化電壓為3 500 V,碎片電壓175 V。高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)洗脫條件:流動相A為甲醇,B為水;洗脫速度為0.8 mL/min;檢測波長為200~600 nm全波長掃描;梯度洗脫程序如表1所示。
1.2.4 高效液相制備色譜條件
制備用反相高效液相色譜條件:流動相A為甲醇,B為水;洗脫速度為3.5 mL/min;檢測波長為254 nm;梯度洗脫程序如表1所示。
表1 HPLC梯度洗脫程序
精確稱取30 mg古尼擬青霉固體培養(yǎng)菌絲凍干粉放入1.5 mL離心管中,加 1 mL甲醇,超聲波浸提30 min,靜置24 h,離心后取上清液。按DPPH-TLC法進(jìn)行清除自由基活性的定性試驗(yàn),薄層色譜圖(圖1)中可見多條黃色色帶(DPPH為穩(wěn)定的自由基,能與自由基清除劑反應(yīng)使吸收光發(fā)生藍(lán)移顯黃色)[18]。分別取100 μL上清液和100 μL質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL DPPH試液于96孔酶標(biāo)板中,混勻振蕩30 s,常溫靜置20 min后于517 nm波長下測定其吸光值(Ap)。同時測定上清液不加入DPPH試液的吸光值(Ac)和加0.2 mg/mL DPPH試液但不加上清液(以同體積100%甲醇代替)的吸光值(Am)。按1.2.2中公式(1)測得其自由基清除率高達(dá)95%。結(jié)果顯示古尼擬青霉固體培養(yǎng)菌絲中存在著較強(qiáng)自由基清除能力的活性成分。
圖1 古尼擬青霉甲醇提取物DPPH薄層色譜圖
2.2.1 提取物活性成分分析
將20 mg/mL的樣品甲醇提取物進(jìn)樣20 μL進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析,同時用1.5 mL離心管收集分流物,按1 min每管的速度收集,然后用氮?dú)獯蹈?,?0 μL甲醇溶解,按DPPH-Microplate法測定每管的自由基清除率,找出相應(yīng)的活性組分。
由圖2可知,樣品中清除自由基活性組分主要集中在2個時間段,即10~13 min和15~17 min收集的流分,分別對應(yīng)著HPLC色譜圖(圖3)中保留時間為10.8 min和15.8 min的2個峰,MS色譜圖(圖4)中保留時間為11.2 min和16.2 min的2個離子流峰??梢猿醪脚袛鄻悠分泻?個活性組分。
圖2 古尼擬青霉甲醇提取物的HPLC流分活性
圖3 古尼擬青霉甲醇提取物的HPLC圖譜
a-陰離子流圖譜;b-陽離子流圖譜圖4 古尼擬青霉HPLC-MS的離子流圖譜
2.2.2 提取物中活性組分分離制備
將20 mg/mL的樣品甲醇提取物進(jìn)樣500 μL,利用反相高效液相色譜分離制備上述2個活性組分。從提取物的HPLC制備圖譜(圖5)中可以看出,應(yīng)重點(diǎn)收集峰A和峰B,同時也收集其他峰,以備做進(jìn)一步研究。收集得到的峰A、峰B流分分別記為PG-1、PG-2。重復(fù)進(jìn)樣20次,合并對應(yīng)的目標(biāo)組分,將收集到的PG-1、PG-2于低溫真空濃縮后凍干,分別得到目標(biāo)化合物21 mg和12 mg。
圖5 古尼擬青霉甲醇提取物的HPLC制備圖譜
2.3.1 活性分析
精確稱取10 mg PG-1溶解于1 mL甲醇中,取70 μL PG-1甲醇溶解液和70 μL質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL DPPH試液加入384孔酶標(biāo)板中混勻,按照DPPH-Microplate法于517 nm下測定其吸光值,計算PG-1的清除自由基活性的平均值,對其進(jìn)行活性定量分析確認(rèn)。PG-2的活性定量分析確認(rèn)方法同PG-1。結(jié)果顯示目標(biāo)化合物PG-1和PG-2清除自由基活性仍較強(qiáng),自由基清除率分別達(dá)89.62%和75.45%。同時用DPPH-TLC法進(jìn)行活性定性確認(rèn),顯示制備的PG-1和PG-2在接觸DPPH試劑后均顯現(xiàn)出黃色斑點(diǎn)。定量和定性分析結(jié)果均表示制備過程中活性未丟失。
2.3.2 純度鑒定
用HPLC對活性成分進(jìn)行純度鑒定,由圖6可知,在254 nm條件下,活性組分PG-1和PG-2均僅有1個色譜峰,且其峰前、中、后3段的紫外-可見光吸收譜相同,并與制備前提取物HPLC-MS分析結(jié)果一致,說明制備的組分中無紫外可見光吸收的雜質(zhì),可初步判斷活性組分PG-1和PG-2均為純品。同時,采用HPLC峰面積歸一化法,計算分離到的PG-1和PG-2純度分別為97.31%和97.12%。
a-活性組分PG-1 HPLC色譜圖;b-活性組分PG-2HPLC色譜圖圖6 活性組分HPLC色譜圖
a-活性組分PG-1陽離子質(zhì)譜圖;b-活性組分PG-1陰離子質(zhì)譜圖圖7 活性組分PG-1的高分辨質(zhì)譜圖
a-活性組分PG-2陽離子質(zhì)譜圖;b-活性組分PG-2陰離子質(zhì)譜圖圖8 活性組分PG-2的高分辨質(zhì)譜圖
由于組分PG-1和組分PG-2純品的質(zhì)荷比與分離純化前一致,確認(rèn)制備出的2種化合物為古尼擬青霉固體培養(yǎng)物中存在的天然化合物。通過從天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫中查詢,發(fā)現(xiàn)2種化合物為首次從古尼擬青霉中分離出。
蟲生真菌天然活性物質(zhì)常用的分離純化方法有:柱色譜法[19-20]、薄層色譜法[21]和高速逆流色譜法[22]等,本研究利用制備型HPLC對古尼擬青霉固體培養(yǎng)物抗氧化活性組分進(jìn)行分離純化,得到2種純度較高的抗氧化活性物質(zhì),并驗(yàn)證了分離純化過程中目標(biāo)組分的抗氧化活性未丟失。本研究還利用高分辨HPLC-MS對古尼擬青霉固體培養(yǎng)物產(chǎn)抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)行分析,為找出目標(biāo)組分的分離制備條件,結(jié)合高分辨質(zhì)譜能快速確定活性物的種類與性質(zhì)。此方法適合用于活性強(qiáng)、含量高,有可能為未知化合物的研究[23-24]。若將各活性組分成功分離純化,同時確定其結(jié)構(gòu)相關(guān)信息,會為進(jìn)一步研究和開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。