水解豌豆蛋白特性表征及其與石榴皮提取物協(xié)同抗氧化作用探究

曹云剛，李朝蕊，韓馨蕊，朱振寶，馮莉，黃峻榕，熊幼翎

1(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安,710021)2(肯塔基大學(xué) 動物與食品科學(xué)系，列克星頓 美國，40546)

豌豆蛋白是一種低脂低熱量低致敏的植物蛋白，具有較為全面而均衡的營養(yǎng)成分，其氨基酸組成接近FAO/WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)模式，是一種天然優(yōu)質(zhì)的必需氨基酸來源[1]。適當(dāng)?shù)臈l件下酶法水解蛋白，不僅改善蛋白溶解度及加工特性、提高蛋白利用率，酶解得到的水解豌豆蛋白(pea protein hydrolysates, PPHs)的多肽或多肽片段還具有完整蛋白所不具備的一些生理活性，比如降血壓、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)活力及優(yōu)良的抗氧化性等[2-5]。水解豌豆蛋白的成分及功能與水解前豌豆蛋白的構(gòu)象、水解用酶的種類、水解條件等息息相關(guān)。加熱處理、極端pH處理、超高壓、超聲波等[6-7]處理方式均可改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，進(jìn)而影響水解酶與蛋白質(zhì)的相互作用，最終獲得結(jié)構(gòu)、功能及活性不同的水解產(chǎn)物，極大地拓寬了其在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用[8]。

蛋白水解物具有較好的抗氧化性能，但基于食品體系及加工貯藏環(huán)境的復(fù)雜多變性，單獨(dú)使用蛋白水解物作為抗氧化劑有時(shí)難以獲得理想的效果。植物多酚作為優(yōu)良的天然抗氧化劑，具有多種生理活性功能，在食品中的應(yīng)用是目前的研究熱點(diǎn)之一。張欣[1]研究發(fā)現(xiàn)，豌豆蛋白水解物與甘草提取物在乳狀液體系中的抗氧化機(jī)制存在一定互補(bǔ)性，而CHARLTON等[9]的研究表明多肽能夠抑制多酚化合物的抗氧化作用。因而蛋白水解物與多酚復(fù)配的抗氧化性能有待進(jìn)一步研究。

石榴皮提取物具有抑菌、抗癌、抗病毒、抗氧化等作用，石榴皮多酚是石榴皮中主要的抗氧化活性物質(zhì)[10]。然而目前石榴皮作為榨取石榴汁的副產(chǎn)物大都被丟棄，造成了資源的浪費(fèi)。因此，本研究探究極堿處理及不同水解酶對豌豆蛋白水解物抗氧化性的影響，在此基礎(chǔ)上探究豌豆蛋白水解物與石榴皮提取物復(fù)配的抗氧化活性，為合理利用豌豆蛋白資源，開發(fā)天然新型高效的復(fù)合抗氧化劑提供以理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)參考[11]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中豌八號青豌豆，沭陽唱亮園林綠化有限公司；石榴皮提取物(CSLP-A-708089)，陜西嘉禾生物科技有限公司；風(fēng)味蛋白酶、 復(fù)合蛋白酶，丹麥Novozymes公司中國分公司；大豆卵磷脂、組氨酸，上海源葉生物科技有限公司；2,4,6-三硝基苯磺酸，美國Ark Pharm公司；水溶性維生素E(Trolox)，美國Sigma-Aldrich公司；二硫蘇糖醇、丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))溶液(29∶1)、過硫酸銨等，生工生物工程(上海)股份有限公司；正己烷、α-脫氧核糖、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基雜兵噻唑啉-6-磺酸(2,2′-azino-bis-(3-ethylben zothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS)二銨鹽等試劑均為分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速多功能粉碎機(jī)，武義海納電器有限公司；QLM-90k對撞式氣流磨粉機(jī)，上虞市和力粉體有限公司；HR/T20MM立式高速冷凍離心機(jī)、水分測定儀，湖南赫西儀器裝備有限公司；冷凍干燥機(jī)，上海比朗儀器制造有限公司；自動凱氏定氮儀、SE-A6全自動脂肪測定儀，濟(jì)南市阿爾瓦儀器有限公司； Mini-PROTEAN 3 Cell電泳儀，美國 Bio-Rad 公司；電熱恒溫干燥箱，上海一恒科學(xué)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 豌豆分離蛋白(pea protein isolate, PPI)的制備及其性質(zhì)測定

(1)PPI的制備

參照J(rèn)IANG等[6]的方法，稱取5 kg青豌豆，40 ℃烘干后用多功能粉碎機(jī)破碎去皮并粉碎為30～300目的粗粉，再經(jīng)過氣流磨粉機(jī)處理20 min得到20目左右的豌豆細(xì)粉。用正己烷-乙醇混合溶劑(體積比10∶1)對豌豆細(xì)粉進(jìn)行2次脫脂處理。干燥后的脫脂豆粉按1∶10(g∶mL)的料液比與超純水混合，用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0并攪拌2 h，在4 ℃下以3 300×g離心30 min。離心后的上清液用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.5，以3 300×g冷凍離心20 min后用超純水洗滌2次，4 740×g離心10 min。最終以5倍的超純水將沉淀分散，再用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0。樣品經(jīng)冷凍干燥并密封后于4 ℃保存。

(2)PPI性質(zhì)測定

水分含量測定：直接干燥法[12]；蛋白質(zhì)含量測定：凱氏定氮法[13]；灰分含量測定：恒重法[14]；脂肪含量測定：索氏提取法[15]。

1.3.2 PPHs的制備

豌豆蛋白極堿處理：參照J(rèn)IANG等[6]的方法，用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)蛋白水溶液(20 g/L)pH值至12.0并保持1 h，使蛋白結(jié)構(gòu)部分展開；再將溶液pH值調(diào)回至7.0，保持1 h使蛋白結(jié)構(gòu)重新折疊。

PPHs的制備：參照張欣等[3]的方法，將未處理和加堿處理(pH 12，1 h)的20 g/L豌豆蛋白水溶液分別同風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶在50 ℃水浴作用30 min(酶與蛋白質(zhì)量比為1∶100)[16,23]。水解結(jié)束后在80 ℃處理15 min滅酶，待冷卻到室溫后將pH調(diào)節(jié)至7.0。水解物在9 010×g離心10 min除去沉淀，冷凍干燥后4 ℃密封保存待用。

1.3.3 PPHs凝膠電泳

參照LIU等[17]的方法，在非還原條件下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)實(shí)驗(yàn)，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。將樣品稀釋為4 mg/mL，與樣品緩沖液等體積混合后，于沸水浴加熱3 min后立即冷卻，每孔上樣量為15 μL。

1.3.4 PPHs性質(zhì)測定

(1)水解度測定[18]：取200 μL PPHs樣品溶液(4 mg/mL)與2 mL 0.1% SDS 混合，再加入1 mL 2,4,6-三硝基苯磺酸溶液(0.01%)充分混勻，50 ℃水浴中避光反應(yīng)1 h后，加入2 mL Na2SO3溶液(0.1 mol/L)終止反應(yīng)，取出并冷卻至室溫放置15 min，于420 nm處測定吸光度值。以2 mmol/L亮氨酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線，水解度表示為蛋白水解液中游離氨基含量與蛋白完全水解后所含氨基含量之比。豌豆蛋白完全水解后氨基酸含量為4.37 mmol/g。

(2)溶解度測定[19]：將蛋白水解液(2 mg/mL)在5 000×g離心15 min后，采用雙縮脲法測定上清液中蛋白含量。蛋白溶解度以上清液中蛋白含量占總蛋白含量(2 mg/mL)百分比表示。

1.3.5 PPHs抗氧化能力測定

(1)ABTS自由基清除能力：參照LIU等[17]的方法，取20 μL PPHs樣品溶液與1 980 μL ABTS自由基工作液振蕩混合，30 ℃條件下避光反應(yīng)10 min，734 nm處測定吸光度值A(chǔ)S。以超純水做空白測定吸光度值A(chǔ)b。以Trolox做標(biāo)準(zhǔn)曲線，清除能力以Trolox當(dāng)量(mmol/L)表示。ABTS自由基清除率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

(2)羥自由基清除能力：配制20 mg/mL PPHs樣品溶液，參照周媛媛等[20]的描述，采用α-脫氧核糖法測定·OH清除率。

(3)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除能力[21]：配制20 mg/mL的PPHs樣品溶液，將1.5 mL樣品和等體積0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液振蕩混合，于30 ℃條件下反應(yīng)30 min后于517 nm處測定吸光度值A(chǔ)S，同時(shí)以樣品溶劑為空白測定其吸光度值A(chǔ)b。

(4)Fe2+螯合能力[22]：取1 mL PPHs樣品溶液(20 mg/mL)與3.7 mL超純水和0.1 mL 2 mmol/L FeCl2混合，反應(yīng)3 min后加入0.2 mL 5 mmol/L菲啰嗪，混合均勻?？瞻捉M用超純水代替待測樣品。室溫放置10 min，用超純水調(diào)零，在562 nm處讀取吸光值。

(5)抑制脂質(zhì)體氧化能力：參照ZHANG等[24]的方法，取0.8 mL待測PPHs樣品溶液(20 mg/mL)和4 mL 脂質(zhì)體懸濁液混合均勻，加入0.1 mL FeCl3和0.1 mL抗壞血酸誘發(fā)脂質(zhì)體氧化。通過測定硫代巴比妥酸反應(yīng)物(thiobarituric acid reative substances，TBARS)生成量，每升脂質(zhì)體懸濁液所含丙二醛的毫克數(shù)(mg/L)表示。空白以樣品溶劑代替待測樣品。計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：A532，樣品組在532 nm的吸光值;VS，待測樣品的體積0.8 mL； 9.48，由摩爾消光系數(shù)152 000 L/(mol·cm)轉(zhuǎn)換而得。

1.3.6 石榴皮提取物對PPHs抑制脂質(zhì)體氧化作用的影響

上述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加堿前處理所得PPHs具有更好的抗氧化能力，因而本實(shí)驗(yàn)在脂質(zhì)體體系中繼續(xù)探究石榴皮提取物與加堿前處理所得PPHs復(fù)配是否具有協(xié)同效應(yīng)。配制4種混合物樣品(包含4 mg/mL加堿1(或2)PPHs、50(或100) μg/mL石榴皮提取物)。將混合物樣品分別添加到脂質(zhì)體懸濁液后，再加入0.1 mL FeCl3和0.1 mL抗壞血酸誘發(fā)脂質(zhì)體氧化[1]。樣品測定方法與1.3.5中抑制脂質(zhì)體氧化測定方法相同。PPHs與PE抑制TBARS生成的協(xié)同率計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中:C，PH，PE和M分別代表空白組、PPHs、PE、PPHs和PE的混合物對于TBRAS生成的抑制能力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究中所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置2～3次重復(fù)，使用Statistix 9.0分析軟件的一般線性模型程序進(jìn)行方差分析，采用LSD全配對多重比較進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)，采用SigmaPlot 12.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPI組分分析

對PPI的組分進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PPI中蛋白質(zhì)含量為92.7%，水分含量為3.71%，灰分含量為4.89%，脂肪含量小于0.5%。

2.2 PPHs的性質(zhì)

2.2.1 SDS-PAGE

由圖1可知，加堿前處理及水解酶種類對PPI的水解影響非常顯著。加堿前處理顯著提高了2種酶對PPI的水解效果，尤其是提高了復(fù)合蛋白酶對PPI的水解效果，其水解產(chǎn)物分子質(zhì)量均較小且分布范圍較窄。極端pH處理使得蛋白分子結(jié)構(gòu)展開，導(dǎo)致埋藏于蛋白內(nèi)部的活性基團(tuán)暴露出來，增加了蛋白酶作用位點(diǎn)，因而提高了蛋白酶水解效果。風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對PPI的水解能力較弱，所得水解產(chǎn)物中仍有較多高分子質(zhì)量片段，且水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布相對較寬。2種酶的水解產(chǎn)物具有明顯的差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，張欣等[3]及PEA-RAMOS等[16]的研究結(jié)果也表明蛋白酶種類是影響水解物成分的重要因素。

圖1 PPI和不同PPHs的聚丙烯酰胺凝膠電泳

2.2.2 水解度和溶解度

(1)水解度

由圖2可知，加堿前處理和水解酶種類對于豌豆分離蛋白的水解度有明顯的影響。PPI經(jīng)過加堿預(yù)處理后，水解程度顯著提高。極端堿性處理下，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化，保留了大部分二級結(jié)構(gòu)，三級結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，其原始結(jié)構(gòu)中包裹的部分活性基團(tuán)或特殊位點(diǎn)暴露，與水解酶相應(yīng)結(jié)合能力增加[3]而水解效率得到了有效提高，形成了更多小肽段，這與SDS-PAGE的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。風(fēng)味蛋白酶對PPI的水解度高于復(fù)合蛋白酶的水解度，二者對加堿預(yù)處理PPI的水解度相當(dāng)，這與SDS-PAGE的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不完全一致。ADLER-NISSEN[25]研究認(rèn)為大分子多肽的空間位阻作用可以影響游離氨基與TNBS的相互作用，從而影響了水解度的準(zhǔn)確測定。

圖2 不同處理對PPI水解度的影響

(2)溶解度

由圖3可知，相比天然處理，加堿處理略微提高了蛋白水解物的溶解度，這與蔣將等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[26]。當(dāng)前處理方式相同時(shí)，復(fù)合蛋白酶水解物溶解度更高，其原因可能在于不同蛋白酶的作用位點(diǎn)不同，酶解所得水解物的組成和結(jié)構(gòu)也不同。

圖3 不同處理對PPHs溶解度的影響

2.3 水解豌豆蛋白的抗氧化能力

2.3.1 自由基清除能力

由圖4可知，加堿前處理顯著提高了所得PPHs的3種自由基清除能力(P<0.05)。這可能是由于加堿處理導(dǎo)致豌豆蛋白分子適當(dāng)展開，暴露出埋藏于天然蛋白內(nèi)部的活性基團(tuán)，增加了與蛋白酶的作用位點(diǎn)，提高了蛋白水解度，并生成了許多小分子質(zhì)量的新肽段。一般來說分子質(zhì)量較小的多肽具有更好的自由基清除能力，這與其他文獻(xiàn)的報(bào)道類似[27-28]。水解酶種類對PPHs的自由基清除能力影響也很顯著，整體而言復(fù)合蛋白酶水解物的體現(xiàn)出了更高的自由基清除能力，這和不同酶類與蛋白作用位點(diǎn)不同從而導(dǎo)致水解產(chǎn)物組分及水解度等迥異有關(guān)。

2.3.2 Fe2+螯合能力

過渡金屬離子如Fe2+是重要的氧化誘發(fā)劑，可以誘發(fā)脂肪及蛋白等食品分子的氧化，導(dǎo)致食品化學(xué)穩(wěn)定性及感官品質(zhì)下降。Fe2+螯合能力是評價(jià)氧化劑抗氧化性能常用的方法。Fe2+能與菲啰嗪結(jié)合形成紫色復(fù)合物，在562 nm波長處有最大光吸收值。當(dāng)金屬離子螯合劑存在時(shí)，競爭性結(jié)合Fe2+導(dǎo)致紫色復(fù)合物形成量減少，吸光度值降低。由圖4-d可知，與自由基清除能力趨勢相一致，加堿前處理能夠顯著提高PPHs螯合Fe2+的能力；復(fù)合蛋白酶酶解得到的PPHs螯合Fe2+的能力明顯優(yōu)于風(fēng)味蛋白酶作用，這可能是由于復(fù)合蛋白酶具有更加寬泛的底物特性，更有利于獲得具有較強(qiáng)螯合金屬離子能力的酶解產(chǎn)物[22]。

圖4 不同處理對PPHs抗氧化能力的影響

2.3.3 抑制脂質(zhì)體氧化能力

脂質(zhì)體是一種人工合成的具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)的顆粒，作為模型被廣泛用于探究抗氧化劑在食品體系中的應(yīng)用具有很大的研究潛力[1]。如圖5所示，經(jīng)誘導(dǎo)氧化后空白組的TBARS值約為0.8 mg/mL，各種類型的PPHs均具有一定的抑制脂質(zhì)體氧化作用，但效果具有明顯差異。加堿前處理顯著提高了所得PPHs的抑制脂質(zhì)體氧化作用，相比風(fēng)味蛋白酶水解物，復(fù)合蛋白酶水解物具有更好的抑制效果。整體趨勢與PPHs自由基清除能力及Fe2+螯合能力趨勢相一致。PPHs的抗氧化能力與其氨基酸組成和序列密切相關(guān)，前人研究表明具有較強(qiáng)抑制 TBARS 生成能力的 Fro-PPHs含有更多可電離 R 殘基[1]，此外，水解前的加熱處理能促進(jìn)蛋白結(jié)構(gòu)適度展開，有利于更多具有自由基清除能力的活性氨基酸殘基暴露[1]。但需要注意的是蛋白水解物抑制脂肪氧化的作用機(jī)制主要體現(xiàn)在兩方面[3,17]。在化學(xué)方面PPHs作為自由基清除劑、氫(電子)供體或過渡金屬離子螯合劑可以阻斷自由基鏈反應(yīng)的發(fā)生；在物理方面，PPHs可以在脂肪球表面形成一層物理保護(hù)膜，在一定程度上阻止自由基與脂肪的接觸進(jìn)而抑制脂肪的氧化。因而，PPHs對脂質(zhì)體中脂肪氧化的抑制作用是綜合作用的結(jié)果，除了化學(xué)方面的抗氧化作用以外，可能還與不同類型PPHs在脂肪可能表面的分散情況不同有關(guān)[29]。

圖5 不同PPHs抑制脂質(zhì)體氧化的能力

2.4 石榴皮提取物(pomegrante peel extract，PE)對A-PPHs抗氧化能力的影響

由前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，經(jīng)加堿前處理所得的A-PPHs具有更好的抗氧化能力，在此我們選擇A-PPHs作為代表，在脂質(zhì)體體系中進(jìn)一步探究了石榴皮提取物對PPHs抗氧化能力的影響。由圖6可知，石榴皮提取物(PE)、加堿處理得到的風(fēng)味蛋白酶水解物(A-Fla-PPHs)和復(fù)合蛋白酶(A-Pro-PPHs)均具有明顯的抑制脂質(zhì)體氧化能力。石榴皮提取物富含酚類物質(zhì)而蛋白水解物含有大量的可電離R殘基二者均具有一定的自由基清除能力及金屬離子螯合能力，因而可以抑制脂肪氧化[1]。PE與PPHs復(fù)配使用的效果均優(yōu)于PPHs單獨(dú)使用(即“1<1+1”)，且石榴皮提取物濃度越高抗氧化效果越好；但PE與A-Fla-PPHs復(fù)配使用的協(xié)同率均為負(fù)值，即為“1+1<2”；而PE與A-Pro-PPHs復(fù)配使用具有較好的協(xié)同增效作用，即“1+1>2”。其中加堿前處理得到的復(fù)合蛋白酶水解物A-Pro-PPHs與100 μg/mL的石榴皮提取物復(fù)配使用時(shí)，協(xié)同效果最好，協(xié)同率達(dá)24.22%。與本研究結(jié)果類似，張欣研究發(fā)現(xiàn)不同PPHs與甘草提取物在脂質(zhì)體體系中也存在協(xié)同或拮抗效應(yīng)，蛋白酶的特異性可能導(dǎo)致了PPHs的分子質(zhì)量、氨基酸序列等不同，從而影響其在脂質(zhì)體體系中的分布及其與LE之間的相互作用，最終導(dǎo)致其與LE復(fù)配使用時(shí)呈現(xiàn)協(xié)同或拮抗效應(yīng)[1]。

圖6 不同濃度PE對A-PPHs抑制脂質(zhì)體抗氧化能力的影響

3 結(jié)論

前處理方式和水解酶種類對于水解豌豆蛋白的性質(zhì)及抗氧化性能有明顯的影響。加堿預(yù)處理能夠有效地提高豌豆蛋白的水解度、溶解度及水解產(chǎn)物的抗氧化性能。整體來看，與風(fēng)味蛋白酶水解物相比，復(fù)合蛋白酶水解物具有更好的水解度、溶解度及抗氧化性能。單獨(dú)使用PPHs時(shí)，加堿預(yù)處理豌豆蛋白復(fù)合蛋白酶水解物抑制脂質(zhì)體氧化效果最佳。石榴皮提取物與PPHs復(fù)配使用的抑制脂質(zhì)體氧化的效果均優(yōu)于PPHs單獨(dú)使用(即“1<1+1”)，且石榴皮提取物濃度越高抗氧化效果越好；但PE與A-Fla-PPHs復(fù)配使用的效果為“1+1<2”；而PE與A-Pro-PPHs復(fù)配使用具有協(xié)同增效作用(即“1+1>2”)。