正交試驗優(yōu)化超聲波提取尾巨桉DH32-39樹葉抗菌成分的工藝研究

●吳霖鋒 鮑明隆 邱春妙 廖華維 張繼東 劉曉曦

（廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院廣東湛江524000）

桉樹是一種優(yōu)良的經(jīng)濟樹種，具有生長速度快、經(jīng)濟價值高等特點[1]。桉葉含有多種化學(xué)成分，主要包括桉葉精油、黃酮、有機酸等物質(zhì)[2]。其中桉葉有效成分精油具有抑菌、消炎、抗氧化等生理活性[3]。桉葉的提取方法主要有溶劑提取法、超聲波提取法和微波提取法等，其中超聲提取法具有快速高效、保留有效活性成分等優(yōu)點[2]，值得深入研究。金黃色葡萄球菌是常見的食源性致病菌，常導(dǎo)致機體局部皮膚、組織、器官發(fā)生化膿性感染，甚至是中毒性休克[4]?？股厥强刂平瘘S色葡萄球菌感染的有效措施，但細菌耐藥性現(xiàn)象日趨嚴(yán)重[5]。研究發(fā)現(xiàn)，桉葉提取物對金黃色葡萄球菌有抑菌作用[6]，可作為抗生素的替代品。本實驗以桉葉為原料，以金黃色葡萄球菌為研究對象，通過正交試驗優(yōu)化超聲波提取桉葉抗菌成分的方法，以最低抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）評價桉葉提取物的抑菌、殺菌效果，最終確定超聲波提取桉葉抗菌成分的工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象桉葉采摘于廣東海洋大學(xué)教學(xué)動物醫(yī)院種植的尾巨桉DH32-39。金黃色葡萄球菌（ATCC26112）由廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院微生物實驗室保存。

1.1.2 主要試劑瓊脂培養(yǎng)基，由杭州濱和微生物試劑有限公司生產(chǎn)；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，由杭州濱和微生物試劑有限公司生產(chǎn)；無水乙醇，由上海珊億化工科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要儀器多用途恒溫超聲提取機，北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司（DCTZ-1000)；生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠（SPX-250B-Z型)；流線型支架粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司（DFY-1000C)；臺式低速離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司（TDZ5臺式低速離心機)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理將尾巨桉DH32-39樹葉置于通風(fēng)處陰干獲得飲片；用流線型支架粉碎機粉碎干燥的桉樹葉15s，獲得桉葉碎片；將粉碎的桉葉經(jīng)20目檢驗篩均勻搖晃，獲得20目粒度桉葉，備用。

1.2.2 正交試驗稱取10g桉葉（飲片、破碎、20目粒度）置于燒杯中，加入30mL的蒸餾水。正交試驗選取提取時間、超聲波功率及粒度3個因素，每個因素3個水平，進行L9(34)正交試驗，優(yōu)化超聲提取桉葉。因素與水平設(shè)計，見表1。超聲后獲得的桉葉提取液，經(jīng)4層紗布過濾取濾液，離心機4 000r/min離心8min，過濾，加熱濃縮至10mL（藥液最終濃度為1g/mL)。121℃高壓蒸汽滅菌，4℃溫度條件下保存。

1.2.3 不同濃度乙醇作為提取溶劑的對比試驗以

1.2.2 正交試驗優(yōu)化后的超聲波提取工藝獲得桉葉提取物。在此工藝條件基礎(chǔ)上，探討不同濃度（50%~100%）的乙醇對桉葉提取液抑菌、殺菌效果的作用。桉葉的處理：取10g桉葉置于燒杯中，分別加入30mL 50%~100%乙醇，以1.2.2正交試驗優(yōu)化工藝煎煮，離心，過濾，加熱濃縮至10mL。

1.2.4 菌液制備將金黃色葡萄球菌菌種和海豚鏈球菌菌種分別接種于營養(yǎng)肉湯中，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)18h。用接種環(huán)蘸取適量菌液，在營養(yǎng)瓊脂平板中劃線培養(yǎng)24h，挑取單個菌落置于10mL無菌營養(yǎng)肉湯中，制成菌液。

1.2.5 桉葉提取液對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)在無菌條件下，取無菌試管10支，第1管加1.6mL營養(yǎng)肉湯，第2~10管各加1mL營養(yǎng)肉湯。吸取桉葉提取液0.4mL（濃度為1g/mL）加入第1管中，混勻。在第1管中吸取1mL混合液加入第2管中，混勻。按此方式依次倍比稀釋至第10管。此時，1~10號管中桉葉提取液的濃度分別為200mg/mL、100 mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、12.5mg/mL、6.25mg/mL、3.125mg/mL、1.563mg/mL、0.781mg/mL和0.391mg/mL。在試管中加入10L菌液，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h。肉眼觀察試管內(nèi)液體情況，如液體澄清，說明試管內(nèi)無細菌生長，液體渾濁則說明試管內(nèi)有細菌生長。以無細菌生長的液體濃度記為桉葉提取液對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.6 桉葉提取液對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度(MBC)在無菌條件下，用接種環(huán)蘸取1.2.5中1~10號管37℃培養(yǎng)24h后的菌液，接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)18h。觀察結(jié)果，以營養(yǎng)瓊脂平板上無細菌生長的最低菌液濃度記為桉葉提取液對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度(MBC)。

2 結(jié)果

2.1 不同超聲提取工藝對于金黃色葡萄球菌的MIC影響的試驗結(jié)果

通過正交試驗超聲提取的桉葉提取液對金黃色葡萄球菌的抑制效果，見表2。以水平組合A2B1C2超聲提取的桉葉提取液對金黃色葡萄球菌的MIC為0.781mg/mL，是9種水平組合中的最低值，說明該條件下獲得桉葉提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好。其他條件下超聲提取的桉葉提取液對金黃色葡萄球菌的MIC在3.13~100mg/mL之間。

表2桉葉提取液對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度

續(xù)表2

2.2 不同超聲提取工藝對于金黃色葡萄球菌的MBC影響的試驗結(jié)果

通過正交試驗超聲提取的桉葉提取液對金黃色葡萄球菌的殺滅效果，見表3。在水平組合A2B2C3條件下，超聲獲得的桉葉提取液對金黃色葡萄球菌的MBC為12.25mg/mL，為9種水平組合中的最低值，此時桉葉提取液對金黃色葡萄球菌的殺菌效果最好。其他水平組合條件下超聲獲得的桉葉提取液對金黃色葡萄球菌的MBC在25~50mg/mL之間。

表3桉葉提取液對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度

2.3 不同提取溶劑對于提取液抗菌、殺菌效果影響的試驗結(jié)果

以蒸餾水對照，使用不同濃度的乙醇（50%~100%）作為提取溶劑，測定其提取液的MIC和MBC，結(jié)果見表4。蒸餾水、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇以及90%乙醇的桉葉提取液的MIC均為1.6mg/mL，而100%乙醇的桉葉提取液的MIC為8mg/mL，蒸餾水、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇的桉葉提取液的MBC均為40mg/mL，而90%和100%乙醇的桉葉提取液的MBC為8mg/mL，因此90%乙醇作為桉葉提取液的提取劑的效果最好，在選擇提取溶劑時應(yīng)使用90%乙醇。

表4桉葉乙醇超聲提取液對金黃色葡萄球菌的MIC和MBC

3 討論與結(jié)論

桉樹作為一種我國南方重要的速生高產(chǎn)人工林樹品種[7]，其樹葉中含有大量的活性成分，包括桉葉精油、黃酮類、鞣質(zhì)、多酚等[8]。桉葉精油對于金黃色葡萄球菌有較好的滅殺效果[6]。桉葉活性成分的提取方式有很多，常見的包括溶劑提取法和超聲提取法，目前國內(nèi)應(yīng)用較多的為溶劑提取法，但超聲提取法相對于溶液提取法具有快速高效、可保留熱敏物質(zhì)和易氧化物質(zhì)的特點[2]，本試驗選擇以超聲提取法中不同提取時間、超聲功率、原料粒度以及不同溶劑為變量，以桉葉提取液對于金黃色葡萄球菌的MIC、MBC為衡量標(biāo)準(zhǔn)，嘗試優(yōu)化桉葉的超聲提取工藝。

正交試驗中不同的提取時間、超聲功率、原料粒度的組合，會使桉葉提取液對于金黃色葡萄球菌的MIC產(chǎn)生明顯差異，MIC處于0.781~100mg/mL之間。其中A2B1C2超聲工藝提取的桉葉提取液對金黃色葡萄球菌的MIC為0.781mg/mL，為所有數(shù)值中的最低值。同時通過極差分析可知，各因素影響金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度的順序為：中藥粒度（C）>超聲功率（B）>時間（A），見表2。在正交試驗中不同的提取時間、超聲功率、原料粒度的組合會造成桉葉提取液對于金黃色葡萄球菌的MBC存在明顯差異，MBC處于12.25~50mg/mL之間。其中A2B2C3超聲工藝提取的桉葉提取液對金黃色葡萄球菌的MBC為12.25mg/mL，為所有數(shù)值中的最低值。通過極差分析可知，各因素影響金黃色葡萄球菌最小殺菌濃度的順序為：中藥粒度（C）>時間（A）>超聲功率（B），見表3。

綜合分析正交試驗的試驗結(jié)果，中藥粒度是最大的影響因素，顆粒細化程度最高的是20目粒度，故將粒度確定為20目。正交試驗結(jié)果顯示提取時間在2水平為最佳，時間確定為10min。在超聲功率的3個水平中，正交試驗MIC結(jié)果顯示，在B因素中1水平結(jié)果最差；正交試驗MBC的結(jié)果顯示，在B因素中3水平的結(jié)果最差，所以B因素中的1水平和3水平都不是最優(yōu)的選項，故選取2水平的超聲功率480W。所以桉樹葉的最佳提取工藝可以確定為：桉葉粒度20目、超聲波功率480W條件下超聲10min?？紤]到提取溶劑會對桉葉提取物的抗菌殺菌能力產(chǎn)生影響，本試驗以蒸餾水為參照，探討不同濃度的乙醇（50%~100%）桉葉提取物抑制、殺滅金黃色葡萄球菌的能力變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較高濃度的乙醇（90%~100%）桉葉提取物對金黃色葡萄球菌的MBC由40mg/mL降至8mg/mL，表明較高濃度的乙醇（90%~100%）增強了尾巨桉DH32-29桉葉殺滅金黃色葡萄球菌的能力，而以90%乙醇為溶劑的桉葉提取液的MIC和MBC數(shù)值最小，說明此時桉葉提取液抑制、殺滅金黃色葡萄球菌的能力最強，效果最好。

最終結(jié)論，尾巨桉DH32-39桉葉最佳超聲提取工藝為：90%乙醇作為提取溶劑，桉葉粒度20目，超聲波功率480W條件下超聲10min。