東莞地區(qū)慢性乙肝患者乙肝病毒基因分型及耐藥性研究

朱梓年，謝小燕，羅秀霞，丁愛嬌，張拔山

(東莞市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科, 廣東 中山)

0 引言

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)有一個(gè)非常顯著的特點(diǎn)，其屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒類型，病毒因子在逆轉(zhuǎn)錄過程中因缺乏校對(duì)酶作用，很容易產(chǎn)生堿基錯(cuò)配問題，進(jìn)而累積形成多種基因型[1]。按照全基因序列同源性分類，乙型肝炎病毒包括B型、C型、D型等基因型，其分布有顯著的地域性特征，且不同的基因型對(duì)乙肝的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后有重要影響[2]。鑒于此，本文將對(duì)東莞地區(qū)乙型肝炎患者乙肝病毒的基因分型和耐藥性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2015年1月至2019年12月，選取在東莞市人民醫(yī)院就診的東莞地區(qū)的慢性乙型肝炎患者1175例，HBVDNA＞5.0IU/mL納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均與中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)制定的《慢性乙型肝炎臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)(2015 年)》相吻合[3]；②患者均知情，同意參與本次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：酒精性肝病、代謝性肝病及其他病毒感染導(dǎo)致的肝病等。其中，男789例，女386例，患者年齡18-65歲，平均年齡(35.6±2.4)歲。

1.2 檢驗(yàn)方法

采用深圳亞能公司提供的應(yīng)用基因擴(kuò)增以及采用膜反向雜交技術(shù)(PCR-RDB)的成品試劑盒進(jìn)行血清檢測(cè)，檢測(cè)內(nèi)容為基因分型和耐藥突變情況。

晨起空腹抽取患者靜脈血3mL，置于促凝管中進(jìn)行4 000 r/min 離心10min，分離血清并及時(shí)放到-40℃冰箱保存?zhèn)溆?。?yán)格按照深圳亞能公司所提供的試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用離心柱法提取乙肝病毒DNA，使用珠海黑馬HEMA 9600擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件設(shè)為：50℃ 2分鐘，1 cycles；95℃ 10分 鐘，1 cycles；94℃ 60秒，68 ℃ 90秒，30cycles ；94℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃ 30秒，30cycles ； 72℃5分鐘，1 cycles。擴(kuò)增產(chǎn)物加至含試劑盒膜條的雜交液中，在47℃環(huán)境中雜交1.5-4小時(shí)；洗膜，避光顯色15分鐘，結(jié)合藍(lán)色斑點(diǎn)判讀結(jié)果。

使用試劑盒膜條檢測(cè)區(qū)分中國和其他亞洲國家乙型肝炎病毒常見的B型、C型、D型基因。rt180M、rt204V、rt204I、rt207I、rt181V、rt236T六個(gè)突變位點(diǎn)。使用兩種膜條檢測(cè)耐藥性，主要檢測(cè)對(duì)拉米夫定、阿德福韋酯以及替比夫定的耐藥性。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 統(tǒng)計(jì)上述乙肝患者乙肝病毒基因分型與突變分型。

1.3.2 統(tǒng)計(jì)B、C基因型對(duì)拉米夫定等常用藥物耐藥性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行綜合處理，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)和例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 上述乙肝病毒基因分型與耐藥突變分型

1022例陽性感染病例中，B型感染606例，占59.3%，C型感染410例，占40.1%，D型感染6例，占0.6%，東莞地區(qū)乙肝病毒基因分型以B型和C型為主。見表1。

表1 乙肝病毒基因分型

1022例陽性感染病例中，出現(xiàn)rt180M突變161例，占15.8%，出 現(xiàn)rt204V突 變117例，占11.4%，出 現(xiàn)rt204I突變157例，占15.4%，出現(xiàn)rt207I突變9例，占0.9%，出現(xiàn)rt181V突變15例，占1.5%，出現(xiàn)rt236T突變34例，占3.3%。rt180M突變、rt204V突變、rt204I突變發(fā)生幾率最高。見表2。

表2 乙肝病毒突變點(diǎn)位

2.2 B、C基因型對(duì)拉米夫定等常用藥物耐藥性

B基因型發(fā)生拉米夫定耐藥性15.5%、替比夫定耐藥性15.5%，C基因型發(fā)生拉米夫定耐藥性37.6%、替比夫定耐藥性37.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。見表3。

表3 B、C基因型對(duì)拉米夫定等常用藥物耐藥性分析

3 討論

按照核苷酸序列的異源性不同，可以將乙型肝炎病毒分為A-J十大類型，乙型肝炎病毒的基因分型呈現(xiàn)明顯的地域性特點(diǎn)，我國乙型肝炎病毒基因分型主要以B、C和D型為主[4]。有研究資料指出，我國南方地區(qū)的乙型肝炎病毒基因主要以B型為主，北方地區(qū)的乙型肝炎病毒基因以C型為主；漢族人群的乙型肝炎病毒基因以B型和C型為主，少數(shù)民族地區(qū)的乙型肝炎病毒基因A型和D型占比較多[5]。在本文研究的1022例乙肝陽性感染病例中，B型感染606例，占59.3%，C型感染410例，占40.1%，D型感染6例，占0.6%，東莞地區(qū)乙肝病毒基因分型以B型和C型為主，這也與上述研究結(jié)果相吻合。

乙型肝炎病毒感染之后的轉(zhuǎn)歸會(huì)受到多方面因素的影響，其中乙肝病毒基因分型是非常重要的指標(biāo)[6]。有研究指出，乙肝病毒C型基因多導(dǎo)致嚴(yán)重病變，而乙肝病毒B型基因多引起輕度病變。其原因可能為乙肝病毒C型基因病毒的復(fù)制性較強(qiáng)、毒株致病性較強(qiáng)，不容易出現(xiàn)e抗原轉(zhuǎn)換，很容易出現(xiàn)持續(xù)的病毒血癥甚至較為嚴(yán)重的肝臟病變[7]。同時(shí)，乙肝病毒C型基因患者預(yù)后較差，這與乙肝病毒C型基因病毒血癥水平高、不易被清除有直接關(guān)系。

核苷酸類似物耐藥問題是乙肝治療中的關(guān)鍵問題之一，近年來，隨著核苷酸類似物等藥物的廣泛應(yīng)用，該類藥物的耐藥菌顯著增多。有研究資料指出，在乙型肝炎的治療中，使用拉米夫定的一年耐藥率為24%，五年耐藥率為70%，使用阿德福韋酯五年耐藥率為29%，使用替比夫定兩年耐藥率為17%，乙肝病毒的耐藥性問題非常嚴(yán)重。耐藥性的增加會(huì)導(dǎo)致臨床療效喪失，增加臨床治療難度，患者發(fā)生肝硬化等嚴(yán)重并發(fā)癥的幾率也會(huì)增加[8]。在本文研究中發(fā)現(xiàn)，B型與C型均會(huì)出現(xiàn)耐藥性，C基因型發(fā)生拉米夫定耐藥性37.6%、替比夫定耐藥性37.6%，顯著高于B基因型的耐藥性，這與C基因型感染預(yù)后差有直接關(guān)系。臨床上，拉夫米定是治療乙肝病毒的常用藥物，其抗病毒機(jī)制明確、臨床應(yīng)用廣泛，隨著該類藥物的普遍應(yīng)用，拉夫米定耐藥性問題凸顯，誘發(fā)乙型肝炎病毒基因變異是導(dǎo)致拉夫米定耐藥的主要機(jī)理，一旦突變毒株成為優(yōu)勢(shì)菌株后，其抗病毒效果會(huì)大打折扣，甚至毫無效果，嚴(yán)重的還會(huì)導(dǎo)致乙型肝炎病毒活躍、患者病情加重。本次研究還發(fā)現(xiàn)，rt180M突變、rt204V突變、rt204I突變發(fā)生幾率最高，故而在使用核苷酸類似物治療的過程中，必須及時(shí)開展基因耐藥突變檢測(cè)，更好地幫助醫(yī)生判斷病情、合理選擇藥物，這對(duì)改善患者預(yù)后有重要作用。

綜上所述，東莞地區(qū)乙肝病毒基因分型以B型和C型為主，rt180M突變、rt204V突變、rt204I突變發(fā)生幾率最高，C型耐藥性更強(qiáng)，對(duì)此應(yīng)根據(jù)病毒基因分型選擇治療藥物，不斷改善患者預(yù)后。