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    過表達(dá)HMGA1 影響動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和p38MAPK 信號(hào)通路

    2022-01-04 11:27:30朱沈輝酈俊長沙市第一醫(yī)院急診科湖南長沙410005
    中國老年學(xué)雜志 2021年24期
    關(guān)鍵詞:明顯降低內(nèi)皮細(xì)胞活力

    朱沈輝 酈俊 (長沙市第一醫(yī)院急診科,湖南 長沙 410005)

    動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是指主要發(fā)生在大中動(dòng)脈管腔內(nèi)的慢性炎癥及纖維增生性病變,是大部分心血管疾病的病理學(xué)基礎(chǔ),具有高的發(fā)病率、致殘率和死亡率的特點(diǎn),嚴(yán)重威脅人類的生命健康〔1,2〕。AS形成是一個(gè)復(fù)雜的過程,其中炎癥、氧化應(yīng)激被認(rèn)為是AS 的核心發(fā)病機(jī)制〔3,4〕。有研究表明,內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致AS 和高血壓的一個(gè)關(guān)鍵因素〔5〕。因此,抑制由氧化應(yīng)激引起的AS 血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷對(duì)于其治療具有重要意義。高遷移率族蛋白(HMG)A1 是一種非組蛋白性質(zhì)的染色體蛋白,參與包括DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)等多種重要的生理功能調(diào)控,其中對(duì)基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄調(diào)控尤為重要〔6〕。有研究表達(dá),HMGA1 表達(dá)與糖尿病大血管病變形成有關(guān)〔7〕。此外,也有研究顯示,AS 斑塊中有HMGA1 蛋白存在,HMGA1 可通過調(diào)節(jié)CD44 參與AS 形成,是AS 病變發(fā)生發(fā)展過程的一個(gè)重要調(diào)節(jié)者〔8〕。目前關(guān)于HMGA1 對(duì)AS 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長影響尚未明確。本研究通過過表達(dá)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)HMGA1 表達(dá),旨在探討HMGA1 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs 增殖凋亡的影響,并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

    1 材料方法

    1.1 試劑和儀器 HUVECs 購自美國ATCC。DMEM 培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素、胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco;Lopofectamine 2000 購自美國Invitrogen;MTT、DMSO 及SB203580 均購自美國Sigma;HMGA1、p38MAPK、p-p38MAPK、Bcl-2 和Bax 抗體均購自美國CST;細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基;酶標(biāo)儀購自美國Thermo;流式細(xì)胞儀購自美國BD。

    1.2 研究對(duì)象 本研究所用AS 組織來源于長沙市第一醫(yī)院自2017 年1 月至2018 年1 月經(jīng)血管造影確診為AS 患者52 例,其中男28 例,女24 例,年齡51.9~78.2 歲,平均(67.1±11.1)歲。嚴(yán)格排除有糖尿病、心肌梗死病史及曾有心絞痛的AS 患者。上述AS 患者中的20 例,后期進(jìn)行心血管手術(shù)切除斑塊組織時(shí),同時(shí)切除正常血管組織作為自身正常對(duì)照(對(duì)照組)。組織采集后做好標(biāo)記,即可放入液氮中保存。所有樣本的采集經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過,并簽署知情同意書。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng) HUVECs 在DMEM 培養(yǎng)基中(含10% FBS 及青霉素和鏈霉素),于5% 體積分?jǐn)?shù)CO2、37℃及相對(duì)飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔日換液,待細(xì)胞生長至融合時(shí),按照實(shí)驗(yàn)需要傳代。實(shí)驗(yàn)為生長至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。

    1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將生長至對(duì)數(shù)期的HUVECs細(xì)胞分為空白組、H2O2組、H2O2+NC 組和H2O2+HMGA1 組??瞻捉M細(xì)胞不經(jīng)特殊處理。H2O2組使用0.5 mmol/L 的H2O2刺激細(xì)胞4 h。H2O2+NC 組和H2O2+si-HMGA1 組分別用0.5 mmol/L 的H2O2刺激細(xì)胞4 h,再分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 空載體及重組體pcDNA3.1-HMGA1 48 h。其中pcDNA3.1 的轉(zhuǎn)染參照Lopofectamine 2000 說明進(jìn)行操作。

    1.5 Western 印跡 采用蛋白提取試劑盒提取總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。按照50 μg/孔等量上樣,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、電轉(zhuǎn)移聚偏氟乙烯(PVDF)膜及封閉膜后,加HMGA1、p38 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、p-p38MAPK、B 淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2 和Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bax)抗體(稀釋比例1 ∶1000),4℃孵育過夜,次日,TBST 洗膜,加HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗,室溫孵育1 h,TBST 洗膜,電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色,顯影、定量。Quantity One 軟件進(jìn)行灰度值分析。蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH 灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

    1.6 甲基噻唑基四唑(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活力 以5×103個(gè)/孔接種HUVECs 細(xì)胞等量于96 孔板,按照1.4 分組處理細(xì)胞,處理結(jié)束后每孔中加入20 μl的MTT 溶液(5 mg/ml),培養(yǎng)箱中孵育4 h,棄掉上清,加入150 μl/孔的二甲基亞砜(DMSO),搖床震蕩10 min,以使結(jié)晶能夠溶解充分。490 nm 波長下,酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(A)。以A 值衡量細(xì)胞的增殖活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

    1.7 AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集按照1.3 分組處理后的細(xì)胞,制備成單細(xì)胞懸液,收集1×106個(gè)細(xì)胞。按照膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)雙染細(xì)胞凋亡試劑盒說明。預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞,然后用1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。分別加入5 μl 的AnnexinV-FITC和5 μl 的PI,避光孵育10 min,1 h 內(nèi)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

    1.8 制p38MAPK 信號(hào)對(duì)HUVECs 細(xì)胞活力和凋亡影響 使用5 mmol/L 的p38MAPK 信號(hào)通路抑制劑SB203580 處理HUVECs 細(xì)胞,細(xì)胞分為H2O2組、H2O2+SB203580 組和H2O2+SB203580+HMGA1組。通過MTT 法及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)3 組細(xì)胞活力和凋亡率。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 軟件進(jìn)行方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 AS 組織HMGA1 表達(dá) 以正常血管組織作為對(duì)照,AS 患者斑塊組織HMGA1 表達(dá)(0.481 ±0.052)明顯高于對(duì)照組(0.046±0.006,P<0.05)。見圖1。

    圖1 Western 印跡檢測(cè)AS 患者斑塊組織HMGA1 表達(dá)

    2.2 HMGA1 在H2O2誘導(dǎo)的HUVECs 細(xì)胞表達(dá) 空白組、H2O2組、H2O2+NC 組和H2O2+HMGA1 組HMGA1 蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.711 ±0.058、0.053±0.006、0.074±0.009、0.335±0.026;F=271.396,P<0.05)。與空白組比較,H2O2組和H2O2+NC 組HMGA1 表達(dá)明顯降低(P<0.05),H2O2組和H2O2+NC 組間HMGA1 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與H2O2+NC 組比較,H2O2+HMGA1 組HMGA1 表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見圖2。

    圖2 Western 印跡檢測(cè)H2O2 誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞HMGA1 蛋白表達(dá)

    2.3 HMGA1 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs 細(xì)胞活力影響 空白組、H2O2組、H2O2+NC 組和H2O2+HMGA1 組A 值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.806 ±0.062、0.432±0.038、0.424±0.035、0.671±0.056;F=43.758,P<0.05),H2O2可明顯降低HUVECs 細(xì)胞活力,而過表達(dá)HMGA1 后細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05)。

    2.4 HMGA1 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs 細(xì)胞凋亡影響 空白組、H2O2組、H2O2+NC 組和H2O2+HMGA1 組細(xì)胞凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(2.47±0.34)%、(30.97 ± 1.65)%、(30.60 ±1.57)%、(15.77±1.01)%;F=284.271,P<0.05〕。H2O2可明顯誘導(dǎo)HUVECs 細(xì)胞凋亡,而過表達(dá)HMGA1 后細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖3。

    圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過表達(dá)HMGA1 后HUVECs 細(xì)胞凋亡率

    2.5 HMGA1 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs 細(xì)胞p38MAPK 信號(hào)通路影響 空白組、H2O2組、H2O2+NC 組和H2O2+HMGA1 組p38MAPK 蛋白表達(dá)分別為(0.682 ±0.058、0.662 ±0.054、0.691 ±0.059、0.690 ± 0.060),p-p38MAPK 蛋白表 達(dá)分別 為(0.023±0.005、0.134±0.015、0.148±0.016、0.078±0.010),Bcl-2 蛋白表達(dá)分別為(0.654 ±0.062、0.089±0.011、0.096±0.013、0.547±0.056),Bax 蛋白表達(dá)分別為(0.067±0.008、0.482±0.052、0.491±0.053、0.166±0.018),4 組的p-p38MAPK、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=64.691、145.152、96.147,均P<0.05)而p38MAPK 蛋白表達(dá)整體比較差異不顯著(F=0.163,P>0.05),見圖4。H2O2可明顯上調(diào)HUVECs 細(xì)胞p-p38MAPK 和Bax表達(dá),下調(diào)Bcl-2,而過表達(dá)HMGA1 后p-p38MAPK和Bax 表達(dá)明顯降低,Bcl-2 表達(dá)明顯升高(P<0.05)。

    圖4 Western 印跡檢測(cè)過表達(dá)HMGA1 后HUVECs 細(xì)胞p38MAPK、p-p38MAPK、Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)

    2.6 抑制p38MAPK 信號(hào)通路對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HUVECs 細(xì)胞活力和凋亡影響 H2O2組、H2O2+SB203580 組和H2O2+SB203580+HMGA1 組細(xì)胞A值(0.438±0.041、0.613±0.049、0.825±0.069),凋亡率〔(30.47±1.72)%、(17.03±1.21)%、(6.90±0.72)%〕 差異均 有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義(F=38.223、236.164,均P<0.05),見圖5。與H2O2組比較,H2O2+SB203580 組細(xì)胞活力明顯升高,凋亡率降低(P<0.05),與H2O2+SB203580 組比較,H2O2+SB203580+HMGA1 組細(xì)胞活力明顯升高,凋亡率降低(P<0.05)。

    圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

    3 討論

    血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常與AS 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),是AS 一系列改變的始動(dòng)者〔9〕。活性氧是導(dǎo)致內(nèi)皮損傷的一個(gè)主要因素〔10〕。H2O2是機(jī)體產(chǎn)生的活性氧,可通過對(duì)生物膜中多不飽和脂肪酸過氧化引起細(xì)胞損傷,最終導(dǎo)致AS 形成,并加重動(dòng)脈狹窄及增加血管支架成型術(shù)后再狹窄發(fā)生率〔11〕。目前多項(xiàng)研究實(shí)現(xiàn),H2O2可引起細(xì)胞內(nèi)皮損傷、凋亡〔12〕。本研究也使用H2O2為處理因素建立血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。HMG 家族在高等真核生物細(xì)胞核中廣泛分布,廣泛的參與多種重要的核內(nèi)生物學(xué)功能調(diào)節(jié),HMGA1 基因定位于人類第6 號(hào)染色體,其表達(dá)水平高低與多種腫瘤惡性程度密切相關(guān)〔13,14〕。最近的研究表明,HMGA1 表達(dá)減少被證實(shí)與2 型糖尿病發(fā)生及胰島素抵抗有關(guān)〔15〕。HMGA1 突變可增加胰島素抵抗及代謝性綜合征的風(fēng)險(xiǎn),而糖尿病是導(dǎo)致AS 的重要危險(xiǎn)因素之一〔16〕。HMGA1 在AS 中研究較少,已有研究表明,AS 中HMGA1 呈現(xiàn)陽性表達(dá)〔8〕。本研究通過H2O2刺激HUVECs 細(xì)胞,檢測(cè)HMGA1 過表達(dá)對(duì)細(xì)胞活力和凋亡影響,結(jié)果顯示,HMGA1 可明顯降低H2O2對(duì)HUVECs 細(xì)胞生長抑制和凋亡促進(jìn)作用。提示HMGA1 對(duì)AS 具有保護(hù)作用。MAPKs 級(jí)聯(lián)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式之一,在哺乳動(dòng)物中廣泛存在,可將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi),從而引起細(xì)胞增殖、凋亡、分化等生物學(xué)改變,對(duì)多種心血管疾病進(jìn)展均發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用〔17,18〕。p38MAPK 是MAPKs 超家族成員之一,有研究表明,AS 形成過程與p38MAPK 信號(hào)激活存在密切關(guān)系,p38MAPK 信號(hào)通路的激活可促進(jìn)VSMCs 增殖信號(hào)傳入細(xì)胞核,使其從中膜浸入內(nèi)膜,并發(fā)生增殖,從而促進(jìn)AS 的形成〔19,20〕。有研究顯示,使用p38MAPK 抑制劑SB203580 干預(yù)HUVECs 細(xì)胞,可明顯降低細(xì)胞凋亡率,上調(diào)Bcl-2 及下調(diào)Bax 表達(dá)〔21,22〕。Bcl-2 家族成員與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),Bcl-2 和Bax 分別為Bcl-2 家族的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白,其比例可決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。Bcl-2 表達(dá)升高,Bax 表達(dá)降低,可抑制細(xì)胞凋亡〔23,24〕。本研究結(jié)果提示HMGA1 可能通過抑制p38MAPK 信號(hào)對(duì)VSMCs 細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。進(jìn)一步研究表明,SB203580 可降低VSMCs 細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,并增加HMGA1 對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。說明HMGA1 可通過抑制p38MAPK 信號(hào)影響VSMCs 細(xì)胞生長。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)HMGA1 在AS 斑塊組織高表達(dá),HMGA1 可通過抑制p38MAPK 信號(hào)降低H2O2誘導(dǎo)的VSMCs 細(xì)胞凋亡,提高細(xì)胞增殖。提示HMGA1 可能是AS 治療的有效靶點(diǎn)之一。

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