視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病外周血IgH-CDR3免疫組庫多樣性及其與疾病的相關(guān)性☆

鐘洪坤 吳萱 張黎潔 張先興 黃穎 陳煒 林艾羽

視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病 (neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD)，目前普遍認為是一種主要由體液免疫介導(dǎo)的以視神經(jīng)和脊髓受累為主的急性或亞急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病[1-2]。免疫組庫（immune repertoire，IR）是指個體在任何指定時間，其循環(huán)系統(tǒng)中所有免疫細胞多樣性的總和[3]，可有效地反映機體整體的免疫能力[4-5]。我們使用新一代高通量測序技術(shù)和多重PCR技術(shù)，擴增NMOSD患者外周血B淋巴細胞受體 （B cell receptor，BCR） 最具多樣性的 CDR3區(qū)域，獲得其IgH-CDR3的免疫組庫信息，并結(jié)合其臨床資料進行分析，旨在更深入地揭示NMOSD的免疫應(yīng)答機制，以期為臨床特異性免疫治療提供新的分子靶點和理論基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2015年5月至2017年12月在我院住院或門診確診的女性NMOSD患者6例，年齡31～47歲，入組的患者符合2015年國際成人NMOSD診斷標準[6]。研究對象在治療早期及穩(wěn)定期分別留取雙份外周血標本，研究對象AQP4抗體均為陽性，在發(fā)病1個月內(nèi)接受規(guī)范治療，隨訪時間8個月以上且隨訪期間無妊娠；并排除其他類型的炎癥性脫髓鞘疾病、免疫缺陷?。粺o長期使用免疫抑制藥物，近期無合并感染。選取性別、年齡相匹配的健康女性志愿者6例作為正常對照組。

入組患者由神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師進行病史詢問和查體，完善相關(guān)輔助檢查，并搜集的基本臨床資料包括：基本信息、首次發(fā)病時間、具體起病情況、臨床表現(xiàn)及病情演變過程、診治經(jīng)過、常規(guī)化驗檢查(血常規(guī)、尿常規(guī)、糞常規(guī)、肝腎功能、抗核抗體譜、抗中性粒細胞抗體、血管炎五項、甲狀腺功能等)、顱腦和(或)脊髓的磁共振圖像、血清AQP4抗體情況、EDSS評分、B細胞亞群及治療方案。

1.2 研究方法研究對象均在清晨空腹采集靜脈血2 mL，所有血液標本均在采集后靜置15 min，置于離心管中，存于-80℃冰箱中待測，待標本收集結(jié)束后統(tǒng)一送往武漢華大基因公司進行檢測。

華大基因公司使用多重PCR技術(shù)對樣品進行擴增，并運用Hiseq4000平臺對擴增的樣品進行免疫組庫測序，使用過濾軟件SOAPnuke進行過濾，使用免疫組庫比對軟件MiXCR進行序列比對，比對庫為軟件自帶基因庫。最終得到的結(jié)果包括CDR3長度分布，V/J基因使用頻率，V/J組合頻率，測序飽和度曲線，克隆頻率分布，多樣性指數(shù)，多樣品共有克隆，層次聚類，MDS聚類等。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間均數(shù)比較用Mann-Whitney U檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 建立NMOSD患者外周血B細胞IgH-CDR3免疫組庫在本研究中，運用了Hiseq 4000平臺，對送檢的樣品進行了免疫組庫測序，得到6例NMOSD患者治療早期和穩(wěn)定期及6個健康志愿者的外周血IgH-CDR3的免疫組庫信息（表1）。

2.1.1 CDR3總數(shù)、種類分析 治療早期及穩(wěn)定期NMOSD患者組外周血IgH-CDR3的總數(shù)及種類相較于正常對照組均有所下降。NMOSD患者治療早期組外周血B細胞 IgH-CDR3總數(shù)為 3.26×106，穩(wěn)定期組的為3.29106，均低于正常對照組的3.49×106，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；NMOSD患者治療早期組外周血B細胞 IgH-CDR3種類為 1.46×104，穩(wěn)定期組的為 1.3×104，均低于正常對照組的1.56×104，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.1.2 CDR3長度統(tǒng)計分析 NMOSD患者組外周血B細胞IgH-CDR3氨基酸序列長度的分布情況近似正態(tài)分布，這與正常對照組的結(jié)果是相一致的，但氨基酸序列長度分布情況在一定范圍內(nèi)與正常對照組存在差異。NMOSD患者組IgH-CDR3區(qū)域氨基酸序列長度在12-14aa及16-18aa范圍內(nèi)的使用頻率較正常對照組高；氨基酸序列長度在21-29aa范圍內(nèi)的使用頻率較正常對照組低（圖 1）。

表1 研究標本免疫組庫基本信息

2.2 V、J基因使用頻率分析NMOSD患者外周血B細胞受體V基因使用頻率最高的為IGHV3-7，且NMOSD患者組偏好使用IGH-V1族及IGHV3族基因，這與正常對照組無差異。NMOSD患者組V基因的等位基因使用頻率和健康對照組之間存在一定差異，其中等位基因IGHV1-69、IGHV3-23的使用頻率在NMOSD患者組中相較于正常對照組要高，等位基因IGHV1-8、IGHV3-30的頻率相較于正常對照組卻要低（圖2）。①NMOSD患者治療早期組外周血B細胞IGHV3-23基因的使用頻率為0.083±0.014(n=6)，高于正常對照組的0.062±0.015(n=6，P=0.065)；穩(wěn)定期組的為 0.082±0.018(n=6)，高于正常對照組的 0.062±0.015(n=6，P＜0.05)；②NMOSD患者治療早期組的外周血B細胞IGHV3-30基因的使用頻率為0.078±0.026(n=6)，穩(wěn)定期組的為 0.081±0.027(n=6)，均低于正常對照組的0.095±0.02(n=6)，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 外周血B細胞IgH-CDR3氨基酸序列長度分布

治療早期及穩(wěn)定期NMOSD患者組B細胞IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4 亞基因的使用頻率較正常對照組均有所增加，相反IGHJ5、IGHJ6亞基因的使用頻率較正常對照組均有所減少 （圖3）。①治療早期組的NMOSD患者外周血B細胞IGHJ3基因的使用頻率為0.072±0.013(n=6)，高于正常對照組的 0.057±0.012(n=6，P=0.065)；穩(wěn)定期組的為 0.077±0.02(n=6)，高于正常對照組的0.057±0.012(n=6，P＜0.05)；②NMOSD 患者治療早期組外周血B細胞IGHJ5基因的使用頻率0.124±0.009(n=6)，低于正常對照組的 0.142±0.014(n=6，P＜0.05)；穩(wěn)定期組的為 0.123±0.02(n=6)，低于正常對照組的 0.142±0.014(n=6，P=0.065)。

2.3 免疫組庫多樣性分析NMOSD患者組的外周血B細胞IgH-CDR3免疫組庫多樣性相較于正常對照組存在著一定的降低趨勢，治療早期NMOSD患者組的B細胞IgH-CDR3免疫組庫多樣性普遍高于穩(wěn)定期患者。本研究采用D50這一指標，作為IgH-CDR3序列多樣性的評價指標 （表 2）：①NMOSD患者治療早期組外周血B細胞IgHCDR3序列多樣性為4.08±1.21(n=6)，穩(wěn)定期組的為3.13±1.35(n=6)，均低于正常對照組的4.30±0.29(n=6)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；② NMOSD患者治療早期組的外周血IgH-CDR3序列多樣性相較于穩(wěn)定期組要高 (除外患者6)，D50分別為4.42±1.04（n=5）和 2.82±1.27（n=5），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；③ NMOSD患者治療早期(除外患者2、患者3)外周血B細胞IgH-CDR3序列多樣性相較于正常對照組要低，D50 分別為 3.33±0.71（n=4）和 4.30±0.29(n=6)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；NMOSD患者穩(wěn)定期組的(除外患者6)外周血B細胞IgHCDR3序列多樣性也低于正常對照組，D50分別為2.82±1.42（n=5）和 4.30±0.29(n=6)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 TOP20-V基因頻率分布圖

圖3 J基因頻率分布圖

2.4 疾病優(yōu)勢取用序列的篩選及分析將NMOSD患者外周血B細胞IgH-CDR3序列庫與正常對照者進行進一步比較，初步篩選出2種疾病特征性的優(yōu)勢取用序列“CASSICLGSGCGGYYYGMDVW”、“CARPNYYGSVRTGYGMDVW”。治療早期NMOSD患者優(yōu)勢取用序列高于穩(wěn)定期患者及正常對照者（表 3）；其中“CASSICLGSGCGGYYYGMDVW”這種序列在NMOSD患者治療早期組中的克隆頻次顯著高于NMOSD患者穩(wěn)定期組及正常對照組（圖 4）。

3 討論

盡管眾多研究表明B細胞功能的紊亂在NMOSD發(fā)病及進展中起到重要作用[7]，但關(guān)于NMOSD外周血IgH-CDR3免疫組庫的報告卻較為少見，更加深入地了解B細胞的功能，有利于臨床上對NMOSD疾病進行更高效的研究[8]。BCR的可變區(qū)包括 CDR1、CDR2、CDR3， 具有高度多樣性，其中最具多樣性的是IgH-CDR3，該區(qū)域在其識別抗原的過程中可起到?jīng)Q定性作用[9-10]。以往常用的免疫組庫測序技術(shù)存在有效信息量少、影響因素多等不足之處[11-12]。本研究中將多重PCR技術(shù)與第二代高通量測序技術(shù)相結(jié)合，獲得了容量巨大的NMOSD患者外周血B細胞IgH-CDR3序列的免疫組庫，并通過對其免疫組庫特點及臨床資料進行研究，發(fā)現(xiàn)在疾病的不同時期，NMOSD患者外周血B細胞克隆擴增的情況存在一定程度的差異。

表2 克隆多樣性指標統(tǒng)計表

本研究中雖可觀察到6例NMOSD患者外周血B細胞IgH-CDR3總數(shù)目及CDR3種類較正常對照組有所下降，但差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義，并且無論是治療早期還是穩(wěn)定期的NMOSD患者，其外周血IgH-CDR3氨基酸序列長度的分布均表現(xiàn)為近似正態(tài)分布，這個結(jié)果與正常對照組相一致，說明NMOSD患者外周血B細胞的IGH-CDR3的數(shù)目與種類并未出現(xiàn)整體性偏移。然而，值得關(guān)注的是患者2及患者3外周血IgH-CDR3總數(shù)、CDR3種類和免疫組庫多樣性指標D50都要明顯高于其他NMOSD患者及正常對照者，這兩位患者在發(fā)病后均接受1000 mg激素沖擊治療，其他患者發(fā)病后僅接受500 mg或更低劑量的激素治療，表明這兩位患者在治療早期免疫系統(tǒng)反應(yīng)更為活躍，推測大劑量激素沖擊治療可調(diào)動NMOSD患者的免疫系統(tǒng)，短時間內(nèi)可顯著提高患者的免疫組庫多樣性，這一反應(yīng)可能有助于清除體內(nèi)的特異性抗原。

NMOSD患者更偏好使用等位基因IGHV1-69、IGHV3-23、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4， 而等位基因 IGHV1-8、IGHV3-30、IGHJ5、IGHJ6 的 使用頻率較正常對照組降低，但是導(dǎo)致這些改變的具體原因尚未明確，推測可能與NMOSD患者在疾病狀態(tài)下的免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，具體機制有待進一步研究。

表3 IgH-CDR3優(yōu)勢取用序列表達頻次表

圖4 NMOSD患者各階段和正常對照者外周血B細胞IgHCDR3優(yōu)勢取用序列頻次 NMOSD：視神經(jīng)脊髓炎譜系疾?。?：NMOSD患者治療早期組（除外患者2）；2：NMOSD患者穩(wěn)定期組（除外患者2）；3：正常對照組使用非參數(shù)檢驗進行差異顯著性檢驗，其中ns表示差異不顯著（P＞0.05）；*表示有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

本研究運用免疫組庫測序技術(shù)挑選出了高頻表達的NMOSD患者外周血B細胞IgH-CDR3序列，即為優(yōu)勢取用序列，并與正常對照組進一步比較，發(fā)現(xiàn)了2種可能與NMOSD疾病的發(fā)病、進展高度相關(guān)的優(yōu)勢取用序列“CASSICLGSGCGGYYYGMDVW”、“CARPNYYGSVRTGYGMDVW”。其中氨基酸序列“CASSICLGSGCGGYYYGMDVW”在治療早期NMOSD患者外周血B細胞IgHCDR3序列庫中高度表達，累計頻次達21429次，顯著高于穩(wěn)定期NMOSD患者及健康志愿者，提示治療早期的NMOSD患者免疫系統(tǒng)正在識別與該抗體相對應(yīng)的抗原，可能與NMOSD疾病的發(fā)生、進展密切相關(guān)，但具體作用及機制需要進一步的研究。此外，NMOSD患者外周血B細胞免疫組庫多樣性較健康志愿組降低，且治療早期患者免疫組庫多樣性較穩(wěn)定期患者增加；在治療早期，經(jīng)大劑量激素 （甲強龍1000 mg）沖擊治療的NMOSD患者其多樣性較經(jīng)其它劑量激素 （甲強龍≤500 mg）治療的患者明顯增高，說明免疫組庫的多樣性可在一定程度上評估NMOSD患者的疾病狀態(tài)及不同治療方案的治療效果。已有研究表明免疫組庫的多樣性可以反映機體的免疫狀態(tài)[13]，因此或可依據(jù)免疫組庫的多樣性及疾病特異性B細胞克隆擴增水平反應(yīng)NMOSD的疾病進展及疾病的治療效果，預(yù)測疾病復(fù)發(fā)及評估預(yù)后。

總之，雖然由于病例數(shù)量的限制，該研究存在一定的局限性，但病例數(shù)量若能擴大，并使上述發(fā)現(xiàn)在試驗中得到更多證實，有期為NMOSD的診斷、治療及疾病狀態(tài)的評估提供重要的新型臨床監(jiān)測指標。另外，假如這些疾病特征性BCR IgHCDR3序列所對應(yīng)的抗原的性質(zhì)和特征可以得到更深層次的研究，必定可以為深入研究NMOSD發(fā)病及進展的免疫應(yīng)答機制提供新的思路，并可期為NMOSD的免疫治療提供重要的理論基礎(chǔ)和新的分子靶點。