基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的免疫傳感器檢測(cè)黃曲霉毒素B1

歐陽(yáng)秀醞，李琳，張林威，程云輝，許宙*

1(長(zhǎng)沙理工大學(xué) 化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410114)2(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州，511442)

黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)是一類由黃曲霉與寄生曲霉的某些菌株產(chǎn)生的強(qiáng)毒性次級(jí)代謝產(chǎn)物[1-2]。目前已分離出的AFT有B1、B2、G1、G2等20多種，其中黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)極易污染花生、玉米、大豆以及其他糧油產(chǎn)品，分布范圍廣，毒性和致癌能力強(qiáng)，與人類的健康密切相關(guān)[3]。攝入AFB1的劑量和時(shí)間決定了個(gè)體的毒性程度，并對(duì)罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)具有累積效應(yīng)[4]。毋庸置疑，對(duì)AFB1的快速高效檢測(cè)是有效控制AFB1食品污染的關(guān)鍵。

目前檢測(cè)AFB1最常用的方法是高效液相色譜法[5-7]和液相色譜-質(zhì)譜法[8-10]，這些方法在食品樣品中檢測(cè)AFB1具有高準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，但耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，且預(yù)處理過程復(fù)雜，很難應(yīng)用于AFB1污染的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[11]。因此，迫切需要建立一種可靠的AFB1的快速定量檢測(cè)方法，這對(duì)保障食品安全和人身健康至關(guān)重要。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)是一種均相分析檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高，操作簡(jiǎn)單方便的優(yōu)點(diǎn)，目前已被用于檢測(cè)氯噻啉[12]，雙酚A[13]，蛋白質(zhì)[14-15]等物質(zhì)。對(duì)于提高FRET的效率，供體和受體的選擇尤為關(guān)鍵。相較于傳統(tǒng)的有機(jī)染料以及半導(dǎo)體量子點(diǎn)等下轉(zhuǎn)換熒光供體，上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒(up-conversion nanoparticles, UCNPs)因其優(yōu)異的光化學(xué)特性備受研究者青睞，UCNPs在980 nm近紅外光激發(fā)下，能發(fā)出一種短波長(zhǎng)、反斯托克斯定律的熒光[16]，能避免待測(cè)樣品的自發(fā)熒光所導(dǎo)致的背景干擾[17]，因此，UCNPs可在FRET體系中作為一種理想的能量供體。目前，基于UCNPs的FRET方法在食品安全尤其是真菌毒素檢測(cè)中還鮮有報(bào)道。與此同時(shí)，金納米顆粒(gold nanoparticles，AuNPs)的吸收峰與UCNPs的熒光發(fā)射光譜有很大程度的重合，可見光吸收范圍寬，猝滅效率和消光系數(shù)較高[18]。因此，UCNPs與AuNPs可形成FRET體系。

本研究利用UCNPs和AuNPs，構(gòu)建了一種基于FRET的免疫傳感器用于AFB1檢測(cè)。UCNPs和AuNPs通過AFB1抗原、抗體組裝在一起時(shí)，發(fā)生FRET過程，導(dǎo)致UCNPs熒光猝滅。當(dāng)AFB1存在時(shí)，會(huì)與AFB1抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體，抑制了FRET過程。反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度與AFB1濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，基于此，該方法實(shí)現(xiàn)對(duì)AFB1的快速定量檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六水合氯化釔(YCl3·6H2O)、1-十八烯(1-ODE)、六水合氯化鐿(YbCl3·6H2O)、油酸(oleic acid,OA)、六水合物氯化鉺(ErCl3·6H2O)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(1-(3-dimethylaminopropy)-3-ethylcarbodiimide hydro chloride,EDC)、聚丙烯酸(acrylicacid acid polymers,PAA)、硫代羥基琥珀酰亞胺(suflo-NHS)、NaOH、氟化銨、檸檬酸三鈉、氯金酸、十二水合磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉、無水乙醇、無水甲醇、環(huán)己烷、三氯甲烷、濃HCl、硼酸、牛血清白蛋白(borine serum albumin,BSA)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；AFB1標(biāo)準(zhǔn)品、交鏈孢酚單甲醚(alternariol monomethyl ether, AME)標(biāo)準(zhǔn)品、赭曲霉毒素A (ochratoxin A, OTA)標(biāo)準(zhǔn)品、雜色曲霉毒素(sterigmatocystin, ST)標(biāo)準(zhǔn)品、交鏈孢酚(alternaria, AOH)標(biāo)準(zhǔn)品，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；AFB1抗原、AFB1抗體，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

F96PRO型熒光分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；MDL-Ⅲ-980-2W型激光發(fā)射器，中國(guó)長(zhǎng)春新產(chǎn)品光電技術(shù)有限公司；UV-1800型紫外可見光分光光度計(jì)，日本島津公司；JEOLJEM-2100型透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；Zetasizer nano型激光粒度散射儀，英國(guó)Malvern公司。

1.3 試驗(yàn)原理

基于抗原修飾的UCNPs與抗體修飾的AuNPs之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移構(gòu)建免疫檢測(cè)平臺(tái)。如圖1所示，UCNPs和AuNPs分別和AFB1抗原、AFB1抗體偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)功能化。當(dāng)檢測(cè)體系中不存在AFB1時(shí)，AFB1抗原和抗體的免疫結(jié)合拉近了UCNPs和AuNPs的距離(1～10 nm)，發(fā)生FRET過程，引起UCNPs熒光猝滅；當(dāng)檢測(cè)體系中存在AFB1時(shí)，AFB1與UCNPs-抗原競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合AuNPs-抗體，從而抑制了FRET過程。以980 nm激發(fā)光激發(fā)，體系的熒光信號(hào)值隨著AFB1含量增加而增加。因此，可根據(jù)體系543 nm處熒光值與AFB1的質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)對(duì)AFB1的定量分析。

圖1 免疫傳感器檢測(cè)黃曲霉毒素B1原理圖

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 水溶性UCNPs的制備

油溶性UCNPs的制備：根據(jù)LI等[19]采用的高溫?zé)岱纸夥ㄖ苽溆腿苄訳CNPs。

水溶性UCNPs的制備：OA-UCNPs在水中的分散性極差，需要對(duì)材料表面進(jìn)行PAA修飾轉(zhuǎn)換成水溶性UCNPs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[13]。根據(jù)DAI等[20]報(bào)道的方法將OA-UCNPs轉(zhuǎn)為PAA-UCNPs。

1.4.2 AuNPs的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[21]采用檸檬酸鈉還原法制備AuNPs。

1.4.3 能量供體探針的制備

用AFB1抗原對(duì)UCNPs進(jìn)行功能化修飾制備能量供體探針：取0.2 mg UCNPs和EDC(0.75 mg/mL)混合，然后加入sulfo-NHS(0.5 mg/mL)搖床2 h對(duì)材料進(jìn)行活化。離心后用PBS緩沖液(0.01 mol/L，pH=7.4)復(fù)溶沉淀。加入含4 μg抗原的PBS緩沖液，搖床2 h后加入1 mL BSA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的PBS緩沖液封閉30 min。離心收集沉淀重懸于PBS緩沖液中，4 ℃避光儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 能量受體探針的制備

用AFB1抗體對(duì)AuNPs進(jìn)行功能化修飾制備能量受體探針：取1 mL AuNPs溶液加入6 μL K2CO3溶液(0.1 mol/L)，然后加入6 μg抗體，搖床1 h。加入50 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的BSA溶液封閉2 h。9 000 r/min離心25 min，用BSA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的硼酸鹽緩沖液(borate buffer，BB)溶液(2 mmol/L，pH=8.2)清洗1次，重懸于1 mL海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的BB溶液。

1.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取100 μL不同質(zhì)量濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05、0.1、0.5、1、5、10、20 ng/mL)，分別與450 μL UCNPs-抗原混合，室溫下混勻。分別加入450 μL AuNPs-抗體，室溫?fù)u床混合2 h。熒光分光光度計(jì)測(cè)定體系在543 nm處的熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度和AFB1質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并確定檢測(cè)范圍和最低檢出限(3σ/S，其中σ為空白多次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為方法的靈敏度，即校準(zhǔn)曲線的斜率)。

1.4.6 特異性實(shí)驗(yàn)

分別配制質(zhì)量濃度為20 ng/mL的AFB1、AME、OTA、ST、AOH標(biāo)準(zhǔn)品溶液。利用上述免疫檢測(cè)方法測(cè)定熒光強(qiáng)度，通過比較評(píng)價(jià)該AFB1免疫傳感器的特異性。

1.4.7 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

對(duì)自來水、花生油樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)?；ㄉ徒?jīng)適當(dāng)?shù)那疤幚恚喝? g花生油樣于10 mL離心管中，加入4 mL甲醇-水溶液(體積比7∶3)，漩渦振蕩混勻后再置于搖床中孵育20 min，6 000 r/min離心10 min，取上清液備用。將質(zhì)量濃度為0.1、1、10 ng/mL AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加到提取液中，得到待測(cè)樣品溶液。利用上述免疫傳感器檢測(cè)AFB1的質(zhì)量濃度，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能化AuNPs和功能化UCNPs的表征

材料的分散性會(huì)影響到納米材料的功能化修飾和特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，若材料粒徑過大會(huì)容易導(dǎo)致聚沉，無法滿足檢測(cè)要求[13]。如圖2-a所示，功能化AuNPs呈球形，這種納米材料的尺寸相對(duì)均勻、一致，平均粒徑為17 nm；如圖2-b所示，功能化UCNPs呈現(xiàn)正六邊形，在水中的分散性良好，平均粒徑為180 nm；如圖2-c所示，當(dāng)體系中不存在目標(biāo)物時(shí)，功能化UCNPs和功能化AuNPs通過抗原-抗體特異性識(shí)別發(fā)生免疫結(jié)合形成AuNPs-UCNPs復(fù)合物，平均粒徑為200 nm。AuNPs與UCNPs的距離(1～10 nm)滿足形成FRET體系的條件。

a-功能化AuNPs;b-功能化UCNPs;c-AuNPs-UCNPs復(fù)合物圖2 功能化AuNPs、功能化UCNPs、AuNPs-UCNPs復(fù)合物的透射電鏡圖

動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering，DLS)測(cè)得的結(jié)果是流體動(dòng)力學(xué)直徑，通常測(cè)得的粒子尺寸比透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)測(cè)得結(jié)果要略大，但仍可用來定性表征粒子的尺寸變化[22]。如圖3所示，功能化AuNPs、功能化UCNPs、AuNPs-UCNPs復(fù)合材料的粒徑分布均接近正態(tài)分布，表明這幾種材料均呈現(xiàn)良好的分散性，平均水合粒徑分別為80、210、295 nm，再次證明功能化AuNPs和功能化UCNPs通過免疫結(jié)合形成了AuNPs-UCNPs復(fù)合物。

2.2 UCNPs與AuNPs的能量轉(zhuǎn)移

如圖4所示，UCNPs在980 nm激發(fā)光照射下的熒光發(fā)射光譜在525，543和659 nm附近有3個(gè)吸收峰，分別對(duì)應(yīng)摻雜Er3+離子2H11/2→4I15/2(綠光區(qū))，4S3/2→4I15/2(綠光區(qū))和4F9/2→4I15/2(紅光區(qū))的能級(jí)躍遷[14]。突出的綠色發(fā)射表明UCNPs可作為FRET體系中的能量供體。AuNPs在520 nm附近顯示出強(qiáng)而寬的吸收帶，因此AuNPs可作為潛在的能量受體或猝滅劑。此外，AuNPs的紫外-可見光吸收光譜與UCNPs的熒光發(fā)射光譜有較好的重疊，這使得UCNPs和AuNPs之間發(fā)生FRET過程成為可能。

a-功能化AuNPs;b-功能化UCNPs;c-AuNPs-UCNPs復(fù)合物圖3 功能化AuNPs，功能化UCNPs，AuNPs-UCNPs復(fù)合物的水合粒徑圖

1-UCNPs的熒光發(fā)射光譜;2-AuNPs的紫外-可見吸收光譜圖4 UCNPs的熒光發(fā)射光譜與AuNPs的紫外-可見吸收光譜圖

2.3 工作曲線與檢出限

通過AFB1與UCNPs-抗原競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合AuNPs-抗體，抑制FRET過程，考察不同質(zhì)量濃度AFB1對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。由圖5可知，隨著AFB1質(zhì)量濃度的增加，543 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸提高，熒光強(qiáng)度與AFB1質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。熒光強(qiáng)度與AFB1質(zhì)量濃度在0.05～20 ng/mL存在線性關(guān)系：y=2.084 ln(x) + 57.278(R2=0.990 9)，最低檢出限為0.02 ng/mL(3σ/S)。如表1所示，與檢測(cè)AFB1的其他方法作比較，發(fā)現(xiàn)該方法的檢測(cè)限較低，檢測(cè)范圍較寬，優(yōu)勢(shì)明顯。

表1 幾種檢測(cè)AFB1的方法比較

圖5 不同AFB1質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的熒光發(fā)射光譜圖

2.4 特異性分析

選用AME、OTA、ST、AOH作為常見的可能存在的共存毒素進(jìn)行特異性測(cè)試和抗干擾能力檢測(cè)[27-28]。如圖6所示，當(dāng)檢測(cè)物為AFB1時(shí)，AFB1與特異性抗體高效結(jié)合，反應(yīng)體系熒光響應(yīng)值較高；當(dāng)檢測(cè)干擾毒素時(shí)，反應(yīng)體系的熒光響應(yīng)值不足AFB1信號(hào)值的1/30，說明這些干擾毒素不能起到恢復(fù)反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度的作用，該AFB1免疫檢測(cè)方法特異性良好。抗體的特異性識(shí)別作用保證了該檢測(cè)方法的特異性，該檢測(cè)方法受環(huán)境影響較小。

圖6 檢測(cè)不同毒素時(shí)反應(yīng)體系在543 nm處的熒光信號(hào)強(qiáng)度

2.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步檢驗(yàn)該檢測(cè)體系的可靠性與實(shí)用性，分別對(duì)油相(花生油)和水相(自來水)樣品進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，利用傳感器檢測(cè)花生油和自來水的加標(biāo)回收率分別在107%～112%和106%～110%，這說明所建立的方法可用于真實(shí)復(fù)雜樣品中AFB1的測(cè)定，準(zhǔn)確可靠。

表2 樣品中AFB1的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(n=3)

3 結(jié)論

本研究制備UCNPs能量供體探針和AuNPs能量受體探針，構(gòu)建了一種基于FRET的免疫傳感器用于檢測(cè)AFB1。體系中的熒光強(qiáng)度信號(hào)值與AFB1質(zhì)量濃度在0.05～20 ng/mL呈線性正相關(guān)：y=2.084 ln(x)+57.278(R2=0.990 9)，檢測(cè)限為0.02 ng/mL。將該方法用于實(shí)際樣品分析時(shí)可獲得較好的回收率，可用于食品中AFB1的快速定量檢測(cè)，為開發(fā)靈敏、快速、高選擇性的食品安全生物傳感器開辟了新的路徑。