磺胺二甲嘧啶對稻田土壤微生物的中長期效應(yīng)

徐佳迎，周金蓉，吳杰，王玨，程粟裕，趙鴿，蔣靜艷

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京210095）

磺胺類藥物是使用最廣泛的獸用抗生素品種之一[1]。其進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)并不能被動(dòng)物體吸收代謝完全，約有50%～90%以母體化合物或其代謝產(chǎn)物的形式經(jīng)由動(dòng)物糞尿排出體外，再隨畜禽糞便的施用進(jìn)入環(huán)境[2]。有報(bào)道指出豬糞中磺胺類藥物的含量為20～40 mg·kg-1[3]，Ji 等[4]也指出施用過豬糞的農(nóng)田土壤中磺胺類藥物含量范圍可高達(dá)4.54～24.66 mg·kg-1?；前奉愃幬锸菑V譜抑菌抗生素，可抑制葉酸途徑中二氫蝶酸合成，進(jìn)而抑制細(xì)菌的繁殖。因此，當(dāng)磺胺類抗生素進(jìn)入土壤后，土壤中的微生物種群數(shù)量和結(jié)構(gòu)組成都會(huì)受到影響[5-6]。目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了磺胺二甲嘧啶（SMZ）施入土壤后短期內(nèi)對土壤微生物活性和群落多樣性有抑制作用，如刁曉平等[7]采用室內(nèi)培養(yǎng)法，研究了10、100 mg·kg-1和500 mg·kg-1磺胺二甲嘧啶培養(yǎng)24 h 和48 h 后對不同土壤微生物種群數(shù)量的影響，結(jié)果表明磺胺二甲嘧啶短期培養(yǎng)后對所測的4 種土壤中的細(xì)菌均具有抑制作用，且這種抑制作用隨濃度的降低而出現(xiàn)下降的趨勢。張敏等[8]采用Biolog 法，研究了磺胺二甲嘧啶對沼氣發(fā)酵過程中微生物群落的影響，結(jié)果表明在沼氣發(fā)酵第6 d，20、60 mg·kg-1和120 mg·kg-1磺胺二甲嘧啶對微生物群落功能多樣性和物種豐富度均有抑制作用，且濃度越高抑制作用越顯著?；前奉惪股卦谕寥乐械慕到馐且粋€(gè)先快后慢的過程，在光照條件下磺胺類抗生素在江西紅壤中降解半衰期為20～58.5 d，在太湖水稻土和東北黑土中降解半衰期為5.3～16.5 d，90%降解率所需時(shí)長均大于180 d[9]。目前關(guān)于磺胺二甲嘧啶對土壤微生物影響的研究多圍繞其輸入后的短期效應(yīng)，缺乏其輸入后對土壤微生物中長期影響的研究，關(guān)于磺胺二甲嘧啶降解產(chǎn)物的研究也多集中在水體中，對其在土壤中降解產(chǎn)物的研究較為鮮見。因此，結(jié)合磺胺二甲嘧啶在土壤中降解半衰期，有必要開展其對土壤微生物中長期效應(yīng)的研究。

本課題組前期工作表明在稻田試驗(yàn)中輸入30 mg·kg-1磺胺二甲嘧啶47 d 和61 d 后，磺胺二甲嘧啶對稻田N2O（由硝化或反硝化作用產(chǎn)生）排放仍具有顯著促進(jìn)作用（P＜0.05），但是磺胺二甲嘧啶殘留率僅為1.8%～5.2%[10]。該階段磺胺二甲嘧啶在土壤中的降解轉(zhuǎn)化及其對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響值得深入探索，故本文結(jié)合HPLC-MS 分析和Illumina Miseq測序兩種技術(shù)研究磺胺二甲嘧啶母體及其降解產(chǎn)物對土壤微生物的影響，以期深入了解磺胺二甲嘧啶輸入土壤后的中長期效應(yīng)，為了解其環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)位于江蘇省南京市江寧區(qū)典型稻麥輪作區(qū)（118°59′E，31°57′N），試驗(yàn)田土壤有機(jī)碳含量為29.39 g·kg-1，全氮含量為1.93 g·kg-1，pH 為7.67，土壤容重為1.30 g·cm-3。供試抗生素為上海麥克林公司生產(chǎn)的磺胺二甲嘧啶試劑。供試豬糞為經(jīng)堆置的從未接觸過任何抗生素的家豬排泄物，全氮含量為8.82 g·kg-1，有機(jī)質(zhì)為752.03 g·kg-1。試驗(yàn)處理設(shè)置為：以豬糞（M）為基肥，尿素為追肥，有無30 mg·kg-1磺胺二甲嘧啶（M 和M+SMZ）和以復(fù)合肥（F）為基肥，尿素為追肥，有無30 mg·kg-1磺胺二甲嘧啶（F 和F+SMZ）。本試驗(yàn)供試水稻品種為南粳55 號，水稻于2017年6月4日播種，2017年11月11日收獲。4個(gè)處理施氮總量（以N 計(jì)）均為220 kg·hm-2，按基肥∶追肥=1∶1 比例撒施，磺胺二甲嘧啶隨基肥一次性施入，追肥時(shí)不再添加?；贩蕰r(shí)間分別為2017 年6 月4日和2017 年7 月29 日。試驗(yàn)田采用微區(qū)設(shè)計(jì)，小區(qū)面積為3 m×2 m，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，隨機(jī)排列。各小區(qū)之間設(shè)有80 cm 寬、30 cm 高的田埂，田埂用塑料薄膜覆蓋，且每個(gè)小區(qū)都有各自獨(dú)立的灌排水系統(tǒng)，以防止水肥串流。整個(gè)水稻生育期N∶P2O5∶K2O施肥比例為2∶1∶1。豬糞處理不足的磷鉀以過磷酸鈣（P2O5，12%）和氯化鉀（K2O，60%）補(bǔ)充。除肥料外，試驗(yàn)田按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)措施進(jìn)行水藥管理。采集磺胺二甲嘧啶輸入稻田47 d和61 d后的4個(gè)處理表層（0～20 cm）土壤樣品，用于磺胺二甲嘧啶及其降解產(chǎn)物殘留測定、DNA的提取和測序分析。

在田間試驗(yàn)結(jié)果明確了降解產(chǎn)物為2-氨基-4，6-二甲基嘧啶（ADPD）和4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺（AN）的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步明確磺胺二甲嘧啶輸入土壤47 d 和61 d 后是否是其降解產(chǎn)物在土壤中起主導(dǎo)作用，本文進(jìn)行了室內(nèi)模擬驗(yàn)證培養(yǎng)試驗(yàn)。處理設(shè)置同田間試驗(yàn)，將1 mg·kg-1ADPD（上海麥克林生化科技有限公司，97%）分別與豬糞（M）或復(fù)合肥（F）（N，50 mg·kg-1干土）同步添加于土壤中（M+ADPD 和F+ADPD），同時(shí)做無ADPD 對照（M 和F），每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，在恒溫恒濕（25 ℃、95%水分）條件下進(jìn)行室內(nèi)模擬培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后采集土樣，進(jìn)行DNA 的提取和測序分析。因無4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺化學(xué)純品銷售，故未能進(jìn)行此降解產(chǎn)物驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2 分析方法

1.2.1 磺胺二甲嘧啶殘留和降解產(chǎn)物提取測定

用HPLC（美國Agilent）進(jìn)行磺胺二甲嘧啶殘留檢測?；前范奏奏ぬ崛》椒▍⒖嘉墨I(xiàn)[11]，HPLC參數(shù)為流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液∶乙腈=83∶17；紫外檢測器：270 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流速0.8 mL·min-1，色譜柱：C18柱?；前范奏奏そ到猱a(chǎn)物提取方法同磺胺二甲嘧啶提取方法[11]，利用HPLC-MS（美國Agilent，1200-6410B 三重串聯(lián)四極桿液質(zhì)連用儀）進(jìn)行降解產(chǎn)物鑒別。流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液∶乙腈=83∶17；紫外檢測器：270 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；正離子模式（ESI+）；噴霧器壓力為30 psi（1 psi=6.895 kPa）；拉伸電壓：125 V；掃描范圍：m/z50～500。通過外標(biāo)法利用HPLC-MS 對磺胺二甲嘧啶降解產(chǎn)物2-氨基-4，6-二甲基嘧啶進(jìn)行定量分析，外標(biāo)物為0.01 mg·mL-12-氨基-4，6-二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液。由于沒有4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺標(biāo)品，所以4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺濃度是其質(zhì)譜中離子豐度與0.01 mg·mL-12-氨基-4，6-二甲基嘧啶離子豐度換算得到的相對值。

1.2.2 土樣DNA的提取與檢測

DNA的提取步驟根據(jù)E.Z.N.A.?土壤DNA試劑盒（OMEGA）操作，完成基因組DNA 抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。

1.2.3 PCR擴(kuò)增和測序

以土樣提取的DNA 為模板，使用細(xì)菌通用引物341F 和806R 擴(kuò)增樣品中16S rRNA 基因。PCR 擴(kuò)增體系是20 μL：4 μL 5×FastPfu 緩沖液、2 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1）、0.8 μL Forward Primer（5 μmol·L-1）、0.8 μL Reverse Primer（5 μmol·L-1）、0.4 μL FastPfu 聚合酶、10 ng DNA 模板，補(bǔ)滅菌水至20μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，27個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），最后72 ℃延伸10 min，每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù)。將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司）切膠回收PCR 產(chǎn)物，用Tris_HCl 洗脫，最后再用2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega 公司）進(jìn)行檢測定量，按照每個(gè)樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。之后構(gòu)建Illumina PE250文庫，使用Illumina PE250平臺(tái)進(jìn)行高通量測序，測序工作由上海凌恩生物科技有限公司完成。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

Illumina PE250 測序序列：根據(jù)barcode 得到所有樣品的有效序列，然后對reads的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過濾，再根據(jù)PE reads 之間的overlap 關(guān)系，將成對的reads拼接成一條序列，最后按照barcode 和引物序列拆分得到每個(gè)樣本的優(yōu)質(zhì)序列，并在過程中根據(jù)正反barcode 和引物方向校正序列方向以及去除嵌合體。利用Usearch 平臺(tái)，根據(jù)97%相似性對非重復(fù)序列進(jìn)行OTU 聚類，采用RDP classifier 貝葉斯算法對OTU 代表序列進(jìn)行物種分類分析，比對采用Silva[12]數(shù)據(jù)庫。利用R 語言進(jìn)行Alpha 多樣性指數(shù)分析，Origin 軟件進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 磺胺二甲嘧啶降解產(chǎn)物定性與定量

利用HPLC-MS對磺胺二甲嘧啶在土壤中的降解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，全掃描模式下化合物的總離子流如圖1所示。與對照M或F處理對比，M+SMZ或F+SMZ處理在兩個(gè)采樣時(shí)間的m/z124 峰值和m/z215 峰值均有明顯增加。由此可知，磺胺二甲嘧啶在土壤中降解產(chǎn)生了m/z124 和m/z215 兩種物質(zhì)。采用MS-MS 模式對這兩種降解產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果與水溶液中磺胺二甲嘧啶降解產(chǎn)物的研究比較，得到這兩種降解產(chǎn)物的裂解途徑和分子結(jié)構(gòu)（圖2）[13-14]。說明磺胺二甲嘧啶輸入稻田47 d和61 d后，均降解產(chǎn)生了2-氨基-4，6-二甲基嘧啶和4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺[15-16]。定量分析結(jié)果（圖3）表明，磺胺二甲嘧啶含量隨輸入土壤時(shí)間的延長而逐漸降低，2-氨基-4，6-二甲基嘧啶和4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺含量則呈現(xiàn)先增后減趨勢，且2-氨基-4，6-二甲基嘧啶是磺胺二甲嘧啶的主要降解產(chǎn)物。

2.2 土壤微生物群落多樣性

2.2.1 Alpha多樣性

稀釋曲線是采用隨機(jī)抽樣的方法，以抽取到的序列數(shù)和它們所代表的OTU 數(shù)目來構(gòu)建曲線，它可以用來比較各樣本間物種的豐富度，也可以用來說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否合理。由圖4 可知，當(dāng)隨機(jī)抽取的序列數(shù)達(dá)到30 000條時(shí)，稀釋曲線增加趨勢均趨于平緩，并且樣本覆蓋度（Coverage）均在95%以上，說明樣品測序數(shù)據(jù)量足夠大，能夠有效反映樣品中絕大多數(shù)微生物物種的信息。

圖1 SMZ輸入稻田后47 d和61 d的總離子流圖Figure 1 Total ion chromatogram（TIC）of SMZ input into the rice fields after 47 d and 61 d

圖2 TIC圖中m/z 124和m/z 215二級質(zhì)譜圖Figure 2 Mass spectra of the degradation products of m/z 124 and m/z 215 in TIC

基于OUT聚類分析結(jié)果，對OUT進(jìn)行Alpha多樣性分析。表1 是各處理Alpha 多樣性指數(shù)，與同種肥源對照相比，除ADPD 處理Shannon 和ACE 指數(shù)有顯著差異（P＜0.05）外，其他處理OTU、Shannon 和ACE指數(shù)均差異不顯著（P＞0.05），表明無論基肥是豬糞還是復(fù)合肥，2-氨基-4，6-二甲基嘧啶對土壤微生物群落豐富度和多樣性均有顯著影響，而磺胺二甲嘧啶對土壤微生物群落豐富度和多樣性影響差異不顯著。

2.2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

圖3 不同處理SMZ、ADPD和AN含量變化Figure 3 Variation of SMZ，ADPD and AN content in different treatments

圖5 是各處理在門水平上有顯著差異變化的優(yōu)勢細(xì)菌（放線菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門和硝化螺旋菌門）的平均相對豐度?；前范奏奏ぽ斎氲咎?7 d后M+SMZ 與M 處理比較，芽單胞菌門相對豐度顯著降低了0.81%（P＜0.05），表明該階段M+SMZ處理對芽單胞菌門有顯著抑制作用。F+SMZ與F處理比較，放線菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門和硝化螺旋菌門相對豐度變化均無顯著差異（P＞0.05）?；前范奏奏ぽ斎氲咎?1 d后M+SMZ與M處理對比，放線菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門和硝化螺旋菌門相對豐度也均表現(xiàn)出不同程度的增加，其中放線菌門和厚壁菌門顯著增加2.66%和0.71%（P＜0.05），表明此時(shí)M+SMZ 處理對放線菌門和厚壁菌門均有顯著促進(jìn)作用。F+SMZ 與F 處理相比，4 個(gè)菌門相對豐度則均呈現(xiàn)出下降的趨勢，降幅為0.09%～1.95%，硝化螺旋菌門相對豐度降低達(dá)顯著水平（P＜0.05）。ADPD 培養(yǎng)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與磺胺二甲嘧啶輸入稻田47 d 后的田間試驗(yàn)結(jié)果一致，也表明了ADPD 與豬糞同步輸入土壤后對芽單胞菌門有顯著抑制作用（P＜0.05）。

圖4 不同處理稀釋曲線Figure 4 Dilution curves of different treatments

表1 不同處理Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha diversity index for different treatments

圖5 不同處理放線菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門和硝化螺旋菌門相對豐度Figure 5 Relative abundance of Actinobacteria，Gemmatimonadetes，F(xiàn)irmicutes and Nitrospirae of different treatments

圖6 是各處理在屬水平上有顯著差異變化的優(yōu)勢細(xì)菌（Subgroup6_norank、芽單胞菌屬、熱脫硫桿菌屬和伯克氏菌屬）的平均相對豐度。磺胺二甲嘧啶輸入稻田47 d后M+SMZ和M處理比較，Subgroup6_norank菌屬相對豐度顯著增加0.54%（P＜0.05），芽單胞菌屬、熱脫硫桿菌屬和伯克氏菌屬相對豐度均有所下降，其中芽單胞菌屬顯著降低0.70%（P＜0.05），表明此時(shí)M+SMZ 處理對Subgroup6_norank菌屬有顯著促進(jìn)作用，對芽單胞菌屬起顯著抑制作用。F+SMZ 和F處理比較，芽單胞菌屬和熱脫硫桿菌屬相對豐度增加0.13%和0.12%，Subgroup6_norank和伯克氏菌屬相對豐度則分別下降1.50%和0.04%，增加和降低均不顯著（P＞0.05）?；前范奏奏ぽ斎氲咎?1 d 后M+SMZ 與M 處理相比，伯克氏菌屬相對豐度極顯著增加0.25%（P＜0.01）。該時(shí)段F+SMZ與F處理相比，熱脫硫桿菌屬相對豐度顯著降低0.43%（P＜0.05），表明以豬糞或復(fù)合肥為基肥時(shí)，磺胺二甲嘧啶對土壤微生物菌屬的中長期效應(yīng)不同。此外，ADPD 培養(yǎng)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了ADPD 與豬糞同步輸入土壤后對Subgroup6_norank有顯著促進(jìn)作用（P＜0.05），與復(fù)合肥同步輸入土壤后與豬糞趨勢一致，但未達(dá)顯著作用水平（P＞0.05）。

圖6 不同處理Subgroup6_norank、芽單胞菌屬、熱脫硫桿菌屬和伯克氏菌屬的相對豐度Figure 6 Relative abundance of Subgroup6_norank，Gemmatimonadaceae，Thermodesulfovibrionia and Burkholderiaceae of different treatments

3 討論

3.1 磺胺二甲嘧啶降解轉(zhuǎn)化途徑

磺胺類抗生素在氧化過程中，其分子結(jié)構(gòu)中的磺酰胺鍵容易發(fā)生斷裂生成小分子化合物[17]。在本研究中，磺胺二甲嘧啶磺酰胺鍵斷裂產(chǎn)生了2-氨基-4，6-二甲基嘧啶，且與標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行比較得到了證實(shí)，這與水中活性氧作用下磺胺二甲嘧啶的降解產(chǎn)物一致，也與磺胺二甲嘧啶光解過程中的降解產(chǎn)物一致[18-19]。磺胺二甲嘧啶在水中化學(xué)降解和光降解得到的產(chǎn)物與土壤中生物降解的相同，說明磺胺二甲嘧啶的非生物降解和生物降解遵循一定的規(guī)律[20]。在本研究中，磺胺二甲嘧啶降解還產(chǎn)生了4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺，這與Gao 等[21]在紫外光作用下過硫酸鹽氧化磺胺二甲嘧啶的研究結(jié)果一致?；前范奏奏し肿由系谋桨被軌蜣D(zhuǎn)化為苯氨基陽離子，苯胺基陽離子對位遭受分子間嘧啶氮親核作用而發(fā)生分子間重排，導(dǎo)致脫除，生成4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺[22-24]。由于缺少4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺標(biāo)準(zhǔn)樣品，所以本試驗(yàn)未對其進(jìn)行確切驗(yàn)證和深入研究?；前范奏奏ち硗庖粋€(gè)重要的轉(zhuǎn)化途徑是其苯胺部分逐步氧化，生成N4-OH-SMZ、4-NO2-SMZ 和N-（4，6-二甲基嘧啶-2-基）苯磺酰胺等中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物可進(jìn)一步降解，最終分解為二氧化碳和水[14-15，25]。目前本研究只鑒定到了2-氨基-4，6-二甲基嘧啶和4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺兩種降解產(chǎn)物，磺胺二甲嘧啶其他降解產(chǎn)物還需進(jìn)一步研究。

3.2 磺胺二甲嘧啶及其降解產(chǎn)物對土壤微生物的影響

磺胺類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于對氨基苯甲酸，能與對氨基苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶，阻斷細(xì)菌中二氫葉酸的合成，抑制以二氫葉酸為底物的四氫葉酸的合成，進(jìn)而影響細(xì)胞中嘌呤和嘧啶的合成，抑制細(xì)菌的正常生長和繁殖[26]。表2 是牛糞（CM）和53.60 mg·kg-1磺胺二甲嘧啶單一和復(fù)合添加至T（[意大利]圖拉）和S（[意大利]薩薩里）兩種土壤中，短期培養(yǎng)7 d，期間土壤微生物多樣性的變化結(jié)果[27]。由此可知短期培養(yǎng)期間，磺胺二甲嘧啶對添加牛糞的T 土壤處理微生物活性和豐富度有促進(jìn)作用，對未添加牛糞的T 土壤處理微生物活性和豐富度起先抑后促作用；在S 土壤中，磺胺二甲嘧啶對各處理微生物活性和豐富度均有抑制作用。這與本文磺胺二甲嘧啶對土壤微生物群落多樣性和豐富度的中長期效應(yīng)結(jié)果不一致。究其原因，是在本研究中磺胺二甲嘧啶已經(jīng)降低至較低水平，此時(shí)2-氨基-4，6-二甲基嘧啶和4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺等中間產(chǎn)物在土壤中起主要作用，中間產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與母體不同，不具備類似對氨基苯甲酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)，所以其對微生物的生態(tài)毒性要比母體低。Zessel等[28]研究表明磺胺二甲嘧啶光解過程中降解產(chǎn)物對細(xì)胞增殖的影響低于母體。García-Galán 等[29]利用單細(xì)胞綠藻檢測磺胺二甲嘧啶及其降解產(chǎn)物的毒性，結(jié)果證明磺胺二甲嘧啶的中間產(chǎn)物毒性均低于母體。因此，在本研究中磺胺二甲嘧啶及其降解產(chǎn)物對土壤細(xì)菌群落影響要小于初期磺胺二甲嘧啶對土壤微生物的影響。抗生素在土壤中的長期殘留還會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的抗生素耐藥微生物及抗性基因，進(jìn)一步導(dǎo)致磺胺二甲嘧啶及其降解產(chǎn)物對土壤細(xì)菌群落的影響無顯著差異，Zhang等[30]研究表明四環(huán)素在土壤中長期積累能夠促進(jìn)四環(huán)素抗性基因產(chǎn)生和傳播，Xi等[31]研究表明水產(chǎn)養(yǎng)殖場沉積泥中微生物群落對抗生素長期殘留能夠產(chǎn)生適應(yīng)性。

本研究中，放線菌門、厚壁菌門、硝化螺旋菌門（硝化細(xì)菌）、Subgroup6_norank和伯克氏菌屬均具有一定生物降解作用。Lan 等[32]最新研究指出Subgroup6_norank菌屬能夠?qū)?fù)雜的有機(jī)物發(fā)酵成為酸，Gu 等[33]研究指出厚壁菌門中大部分細(xì)菌能夠通過發(fā)酵作用將多種碳源降解轉(zhuǎn)化為乳酸、丙酮、丁醇和乙醇等小分子物質(zhì)，蔣悅秋等[34]對農(nóng)藥毒死蜱降解菌研究表明伯克氏菌屬CD5 和CD7 菌株均能高效降解土壤中的毒死蜱，吳凡等[35]的研究表明硝化細(xì)菌能夠有效促進(jìn)土壤中碘普羅胺降解。這些具有降解作用的細(xì)菌相對豐度顯著增加，說明土壤微生物的功能性發(fā)生變化，這與磺胺二甲嘧啶在土壤中的降解轉(zhuǎn)化有著密切的聯(lián)系。而芽單胞菌門能夠?qū)⒏鞣N糖分子轉(zhuǎn)化為維生素，熱脫硫桿菌屬在土壤中起反硫化作用，兩者相對豐度顯著降低的原因還有待進(jìn)一步研究。

本研究中，2-氨基-4，6-二甲基嘧啶對土壤微生物群落豐富度和多樣性均有顯著影響，而磺胺二甲嘧啶對土壤微生物群落豐富度和多樣性影響差異不顯著。降解產(chǎn)物2-氨基-4，6-二甲基嘧啶反而比母體磺胺二甲嘧啶對土壤微生物結(jié)構(gòu)與功能的影響更大，其原因有待進(jìn)一步研究。在磺胺二甲嘧啶輸入稻田47 d 后，M+SMZ 處理對芽單胞菌門有顯著抑制作用，對Subgroup6_norank菌屬有顯著促進(jìn)作用，這與培養(yǎng)試驗(yàn)中ADPD、豬糞同步輸入土壤后，對芽單胞菌門相對豐度有顯著抑制作用和對Subgroup6_norank菌屬相對豐度有顯著促進(jìn)作用結(jié)果一致。此時(shí)磺胺二甲嘧啶基本已經(jīng)降解為2-氨基-4，6-二甲基嘧啶和4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺等中間產(chǎn)物，其中2-氨基-4，6-二甲基嘧啶質(zhì)譜信號最強(qiáng)，含量最高，且培養(yǎng)驗(yàn)證試驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了2-氨基-4，6-二甲基嘧啶在此階段對土壤微生物起主要影響作用。此外，M+SMZ 處理中的放線菌門、厚壁菌門和伯克氏菌屬相對豐度變化趨勢與M+ADPD 處理一致，F(xiàn)+SMZ 處理中的放線菌門、硝化螺旋菌門、芽單胞菌屬和熱脫硫桿菌屬相對豐度變化趨勢與F+ADPD 處理吻合，也說明了此時(shí)2-氨基-4，6-二甲基嘧啶作為磺胺二甲嘧啶的主要降解產(chǎn)物在土壤中對微生物起主要影響作用。而磺胺二甲嘧啶輸入稻田61 d 后，M+SMZ 處理對放線菌門和厚壁菌門有顯著促進(jìn)作用，對伯克氏菌屬有極顯著促進(jìn)作用，F(xiàn)+SMZ處理對熱脫硫桿菌屬有顯著抑制作用，各處理間其他細(xì)菌相對豐度變化趨勢也與ADPD 處理不一致?？赡苁且?yàn)?-氨基-4，6-二甲基嘧啶和4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺轉(zhuǎn)化為其他降解產(chǎn)物，其含量降低，新的降解產(chǎn)物在土壤中對微生物起主要作用。Ana等[18]研究表明2-氨基-4，6-二甲基嘧啶可以進(jìn)一步羥基化為4，6-二甲基-2，5-二氫嘧啶-2，5-二醇。Fan 等[14]研究指出4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基）]苯胺能繼續(xù)氧化為亞硝基衍生物和羥基化亞硝基衍生物。Dong 等[13]研究表明磺胺二甲嘧啶中間降解產(chǎn)物會(huì)隨時(shí)間變化而變化。土壤中磺胺二甲嘧啶降解產(chǎn)物不同，其對土壤微生物的生態(tài)毒性也不同。肖華花[19]研究發(fā)現(xiàn)磺胺二甲嘧啶光解過程中母體與降解產(chǎn)物對明亮發(fā)光桿菌的毒性隨反應(yīng)時(shí)間的變化而變化。魏子艷[36]研究發(fā)現(xiàn)抗生素對土壤微生物的影響隨染毒時(shí)間的延長而變化。因此，磺胺二甲嘧啶降解產(chǎn)物的變化及其對微生物的生態(tài)效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。

表2 不同土壤牛糞和磺胺二甲嘧啶單一和復(fù)合處理培養(yǎng)7 d期間土壤微生物活性和豐富度變化[27]Table 2 Changes of soil microbial activity and richness during 7 d of single and combination treatment of cow manure and SMZ for different soils[27]

本文試驗(yàn)結(jié)果還表明以豬糞和復(fù)合肥作基肥時(shí)，磺胺二甲嘧啶對土壤微生物菌屬的中長期效應(yīng)不同。這可能是由于糞肥的添加增加了土壤中有機(jī)質(zhì)含量，有機(jī)質(zhì)中含有大量帶負(fù)電荷的官能團(tuán)，這些官能團(tuán)能夠吸附帶正電荷的獸用抗生素及其降解產(chǎn)物離子，或通過氫鍵和富電子基團(tuán)的親核加成作用與獸用抗生素及其降解產(chǎn)物結(jié)合，進(jìn)而影響土壤中獸用抗生素及其降解產(chǎn)物的生態(tài)毒性[37]。因此，需進(jìn)一步探明不同施肥處理對獸用抗生素及其降解產(chǎn)物的影響機(jī)制，為降低其環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供助力。

4 結(jié)論

無論基肥是豬糞還是復(fù)合肥，磺胺二甲嘧啶輸入土壤47 d 和61 d 后都降解產(chǎn)生了2-氨基-4，6-二甲基嘧啶和4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺，其中2-氨基-4，6-二甲基嘧啶為主要降解產(chǎn)物。在本研究中，磺胺二甲嘧啶對土壤微生物群落多樣性和豐富度變化均無顯著影響，但在微生物優(yōu)勢群落組成上，磺胺二甲嘧啶與豬糞同步輸入土壤47 d后對芽單胞菌門和芽單胞菌屬有顯著抑制作用，對Subgroup6_norank菌屬有顯著促進(jìn)作用，輸入土壤61 d 后對放線菌門和厚壁菌門有顯著促進(jìn)作用，對伯克氏菌屬有極顯著促進(jìn)作用，而磺胺二甲嘧啶與復(fù)合肥同步輸入土壤僅在61 d 后對熱脫硫桿菌屬有顯著抑制作用，原因在于該時(shí)段土壤中磺胺二甲嘧啶已降至較低水平，2-氨基-4，6-二甲基嘧啶等中間產(chǎn)物起主要作用。