叢枝菌根真菌對(duì)溶解態(tài)和膠體態(tài)Cd淋溶的影響

蘇琳，曹力，張金秀，秦麗，祖艷群，湛方棟*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，昆明650201；2.中國(guó)冶金地質(zhì)總局昆明地質(zhì)勘查院，昆明650203）

采礦、施肥和污灌等活動(dòng)導(dǎo)致我國(guó)許多農(nóng)田出現(xiàn)不同程度的Cd 污染[1]。根據(jù)《全國(guó)污染土壤調(diào)查公報(bào)》，Cd 的點(diǎn)位超標(biāo)率為7.0%，為重金屬之首[2]。Cd在土壤中具有毒性、持久性和環(huán)境遷移性，在表層累積會(huì)導(dǎo)致土壤肥力降低和農(nóng)作物減產(chǎn)[3-4]。由于降雨或灌溉作用造成的地表徑流和淋溶，使積累在土壤表層的Cd 會(huì)從上向下遷移進(jìn)而造成Cd 淋溶流失和污染擴(kuò)散，污染深層土壤和地下水[5]。淋溶遷移的Cd主要以溶解態(tài)、膠體態(tài)和懸浮態(tài)等形式存在。溶解態(tài)Cd 存在于溶液中，是吸附反應(yīng)的直接來源，其中Cd2+是主要賦存形式[6]，進(jìn)入膠體后和膠體共遷移[7]。

Cd 淋溶的影響因素很多，其中微生物對(duì)Cd 的遷移就有至關(guān)重要的影響。叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）在土壤中廣泛存在，能與陸地上80%的維管植物形成共生關(guān)系[8-9]。AMF 能促進(jìn)植物吸收養(yǎng)分并減少重金屬毒害，同時(shí)可改善土壤性質(zhì)和減少土壤養(yǎng)分流失[10-12]。AMF 在土壤中生長(zhǎng)形成密集的菌絲網(wǎng)絡(luò)，菌絲纏繞住土壤顆粒[13]，且菌絲上有結(jié)合位點(diǎn)可以吸附固定Cd，減少Cd的流失[14]；菌絲衰亡分解后會(huì)釋放多糖、蛋白質(zhì)等，這些有機(jī)組分被吸附后可改變土壤顆粒的表面化學(xué)性質(zhì)。此外，AMF釋放的球囊霉素相關(guān)土壤蛋白（Glomalin-related soil protein，GRSP）是能促進(jìn)土壤膠結(jié)、提高土壤團(tuán)聚體穩(wěn)定性的生物膠[15]，也能結(jié)合和穩(wěn)定Cd 離子[16]，增強(qiáng)土壤對(duì)Cd的吸附能力[17]。Wang等[18]在對(duì)沿海周圍土壤的研究中發(fā)現(xiàn)GRSP 給重金屬提供了孔隙和內(nèi)表面，促進(jìn)土壤吸附重金屬，且GRSP 固著的重金屬量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于重金屬釋放量，對(duì)水質(zhì)改善起著重要作用。然而，AMF 對(duì)Cd 淋溶的作用機(jī)制還需要深入探討。

土壤對(duì)Cd 有一定的吸附能力，但是土壤情況復(fù)雜，土壤任何性質(zhì)和組分的變化都會(huì)對(duì)Cd 吸附解吸和遷移有明顯的影響[19]，石英砂成分簡(jiǎn)單，可減少土壤中的干擾。本試驗(yàn)用石英砂作培養(yǎng)基質(zhì)，添加溶解態(tài)和膠體態(tài)Cd 溶液，在模擬降雨條件下研究接種AMF 對(duì)Cd 淋溶流失量和砂柱溶液Cd 濃度的影響以及AMF 菌絲對(duì)砂粒表面性質(zhì)與Cd 吸附-解吸特征的影響，豐富生物因素對(duì)土壤Cd 淋溶流失的影響及機(jī)理方面的理論與認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

石英砂（主要成分SiO2），粒徑為0.2 mm，用2%稀硝酸浸泡后用蒸餾水洗凈，在121 ℃下滅菌2 h。

玉米（Zea maysL.），品種為會(huì)單四號(hào)，種子用10%次氯酸鈉（浸泡2 min）和75%乙醇（浸泡1 min）進(jìn)行表面消毒后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽3 d，露白后播種。

摩西管柄囊霉（Funneliformis mosseae），由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所提供菌種（編號(hào)為BGC YN05 1511C0001BGCAM0013），經(jīng)實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)繁后獲得菌劑。

1.2 溶解態(tài)和膠體態(tài)Cd的制備

溶解態(tài)Cd配制：設(shè)置Cd離子的濃度為1 mg·L-1。稱取CdCl2·2.5H2O（分析純）10.2 mg 溶于1 L 蒸餾水中配制成溶解態(tài)Cd濃度為1 mg·L-1的溶液。

膠體態(tài)Cd 制備：按徐偉慧等[20]的方法，制備清潔膠體儲(chǔ)備液備用。取50 mL 清潔膠體儲(chǔ)備液和50 mL 濃度為50 mg·L-1的CdCl2溶液混合，往復(fù)振蕩24 h，4 000 r·min-1離心10 min，將上清液吸出，往離心管中加入50 mL 蒸餾水，超聲分散30 min，重新制備得膠體懸濁液，重復(fù)2 次。該溶液即為試驗(yàn)用的膠體態(tài)Cd 濃度為100 mg·L-1吸附Cd 的土壤膠體溶液，試驗(yàn)時(shí)再稀釋為1 mg·kg-1膠體態(tài)Cd溶液[21]。

1.3 砂柱制備與淋溶試驗(yàn)

制作高30 cm、直徑11 cm、頂端敞口的PVC 管，在管的底部鋪設(shè)尼龍布，并分別在10、20、30 cm 處設(shè)砂柱溶液取樣口，并安裝排水龍頭。石英砂滅菌后采用濕法[22]填入管中，砂柱高度30 cm。設(shè)置對(duì)照（CK）和接種AMF（AMF）兩個(gè)處理，每個(gè)處理8個(gè)平行。在AMF 處理砂柱表層鋪2 cm 的菌種，種植玉米后再覆蓋3 cm 的石英砂，對(duì)照則用滅菌石英砂裝填。每管種植3 株玉米，每隔3 d 每管砂柱澆Hoagland′s 營(yíng)養(yǎng)液100 mL 和去離子水200 mL。培養(yǎng)30 d 后，各處理取4 個(gè)平行加入溶解態(tài)Cd，另外4 個(gè)平行加入膠體態(tài)Cd 溶液，培養(yǎng)7 d 后用淋溶裝置淋溶，每管淋溶去離子水6 L。采用Rhizons提取器收集10、20、30 cm處砂柱溶液，管底部用塑料瓶收集淋溶液。

1.4 AMF相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

淋溶結(jié)束后收獲玉米，測(cè)定AMF 相關(guān)指標(biāo)：酸性品紅法測(cè)定菌根侵染率[23]；按照Thapa 等[24]的方法測(cè)定菌絲密度；采用濕篩-傾析法測(cè)定孢子數(shù)[25]；考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定球囊霉素土壤相關(guān)蛋白濃度[26]。

1.5 溶液Cd濃度測(cè)定與流失量計(jì)算

砂柱溶液和淋溶液收集于塑料瓶?jī)?nèi)保存，各取25 mL 采用HNO3-H2O2消解-石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定Cd濃度。

從淋溶管底部采集的淋溶液，測(cè)量淋溶液體積和Cd 濃度，由流失量=淋溶液Cd 濃度×淋溶液體積，得出石英砂柱Cd淋溶流失量。

1.6 砂粒比表面積測(cè)定

淋溶結(jié)束后收集石英砂，將石英砂風(fēng)干后采用BET法測(cè)定石英砂的比表面積[27]。

1.7 砂粒吸附量與吸附能力測(cè)定

砂粒吸附量測(cè)定：稱取1 g 砂柱各層的樣品于50 mL 塑料離心管中，加入0.1 mol·L-1的NaNO3溶液25 mL，解吸2 h，在恒溫振蕩箱（25 ℃）中于180 r·min-1的速度高速振蕩2 h 后，恒溫靜置過夜，4 000 r·min-1的速度高速離心10 min，取上清液過濾，用原子吸收光譜法測(cè)定金屬離子Cd的濃度即石英砂吸附量。平衡時(shí)單位石英砂解吸溶液中重金屬的量計(jì)算式為：

式中：Qd為解吸平衡時(shí)單位石英砂解吸的溶液中重金屬的量，mg·g-1；Cd為解吸平衡時(shí)溶液的重金屬離子的質(zhì)量濃度，mg·L-1；V為解吸溶液的體積，L；m為石英砂烘干質(zhì)量，g。

砂粒吸附能力測(cè)定：稱取石英砂和含AMF 石英砂1 g 于50 mL 的離心管中，加入1 mg·L-1的Cd2+溶液，置于恒溫（25 ℃）振蕩箱中以180 r·min-1速度離心振蕩2 h，靜置過夜，再以4 000 r·min-1的速度高速離心10 min，取上清液過濾，用石墨爐測(cè)定Cd2+，每個(gè)處理3 次重復(fù)[27]。用差減法計(jì)算石英砂對(duì)Cd2+的吸附量，即砂粒的吸附能力。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 整理，采用OriginPro 8 進(jìn)行圖表繪制。采用SPSS 23.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和整理，獨(dú)立樣本使用T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，并對(duì)各數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMF生長(zhǎng)指標(biāo)與砂粒比表面積

如表1 所示，接種AMF 處理玉米根系的AM 真菌侵染率為30%左右，菌絲密度為30 cm·g-1左右，孢子數(shù)為12 個(gè)·g-1左右，添加Cd 的形態(tài)對(duì)此沒有影響。石英砂的比表面積見表2，在添加溶解態(tài)Cd 條件下，對(duì)照為0.019 m2·g-1，接種處理為0.119 m2·g-1；在添加膠體態(tài)Cd 條件下，對(duì)照為0.076 m2·g-1，接種處理為0.336 m2·g-1?？梢?，接種AMF 增加了石英砂的比表面積。

表1 AMF生長(zhǎng)指標(biāo)Table 1 AMF growth indicator

表2 石英砂粒比表面積Table 2 Specific surface area of quartz sand grains

2.2 接種AMF砂柱中GRSP含量

如圖1 所示，溶解態(tài)Cd 處理下，砂柱中10、20、30 cm 處的GRSP 含量分別為17.09、20.13、18.95 g·kg-1，膠體態(tài)Cd 處理下，砂柱中10、20、30 cm 處的GRSP 含量分別為18.04、21.53、20.24 g·kg-1，Cd 的形態(tài)對(duì)GRSP的含量無顯著影響。

2.3 砂粒Cd吸附量與吸附能力

添加溶解態(tài)Cd，接種處理在10、20 cm 處極顯著增加石英砂的Cd 吸附量，均增加了55%；在30 cm 處吸附量顯著增加40%。添加膠體態(tài)Cd，接種處理在10、20 cm 處極顯著增加石英砂的Cd 吸附量，分別增加了75%和44%；在30 cm 處吸附量增加不顯著。由此可知，接種AMF 能增強(qiáng)石英砂對(duì)Cd 的吸附能力?？傮w來看，石英砂對(duì)溶解態(tài)Cd 的吸附能力為0.528 mg·kg-1，接種AMF 可提高至0.756 mg·kg-1，增幅為30%；石英砂對(duì)膠體態(tài)Cd 的吸附能力為0.600 mg·kg-1，接種AMF 可提高至0.790 mg·kg-1，增幅為24%。接種AMF 后石英砂的吸附量隨砂柱深度呈先增后減的趨勢(shì)，在20 cm處吸附量最大。

圖1 接種AMF砂柱中GRSP含量Figure 1 GRSP content in AMF sand column

圖2 石英砂對(duì)溶解態(tài)和膠體態(tài)Cd的吸附量和吸附能力Figure 2 Sorption amount and adsorption capacity of dissolved and colloidal Cd by quartz sand

2.4 砂柱溶液Cd濃度和流失量

添加溶解態(tài)Cd，接種AMF 處理10 cm 處砂柱溶液的Cd 濃度顯著減少了25%；添加膠體態(tài)Cd，接種AMF 處理10 cm 處砂柱溶液Cd 濃度極顯著減少了45%。由此可知，接種AMF 能顯著降低砂柱表層溶液中的Cd 濃度。從流失量來看，膠體態(tài)Cd 小于溶解態(tài)Cd。其中，添加溶解態(tài)Cd 條件下接種AMF 處理Cd 的流失量極顯著降低35%，添加膠體態(tài)Cd 條件下接種AMF處理Cd的流失量顯著降低13%。

圖3 砂柱溶液中溶解態(tài)和膠體態(tài)Cd濃度和流失量Figure 3 Concentrations and loss amount of dissolved and colloidal Cd in sand column solution

2.5 相關(guān)性分析

相關(guān)分析表明，AMF 接種情形下，砂柱3 個(gè)深度的GRSP 含量與砂粒Cd 吸附量（r=0.685，P＜0.05，n=24）呈顯著正相關(guān)，與砂柱溶液Cd 濃度（r=-0.434，P＜0.05，n=24）呈顯著負(fù)相關(guān)；且砂粒Cd 吸附量與砂柱溶液Cd濃度（r=-0.407，P＜0.05，n=24）呈顯著負(fù)相關(guān)。

如表3 所示，在接種AMF 處理下，砂柱20 cm 深度的砂粒Cd 吸附量與Cd 流失量呈顯著負(fù)相關(guān)，砂柱30 cm 深度的溶液Cd 濃度與Cd 流失量呈顯著正相關(guān)。表明接種AMF 增加砂粒對(duì)Cd 的吸附，有助于降低砂柱溶液Cd濃度和Cd的淋溶流失。

表3 砂柱Cd流失量與砂粒Cd吸附量、溶液Cd濃度的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of Cd loss in sand column with Cd adsorption of sand particles and concentration of solution Cd

3 討論

試驗(yàn)通過接種AMF 增大石英砂吸附量，降低砂柱溶液中Cd濃度，減少Cd的流失量。AMF 因減少土壤養(yǎng)分流失的生態(tài)功能而備受關(guān)注，AMF 的菌絲網(wǎng)絡(luò)吸收土壤養(yǎng)分并傳輸給寄主植物，使得土壤在高降雨強(qiáng)度下減少了40%的氮流失和50%磷流失[28]。Heijden 等[29]對(duì)3 種植物進(jìn)行AMF 的接種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論種植哪一種植物，AMF 都降低了滲濾液的體積。He 等[30]研究強(qiáng)降雨下AMF 對(duì)Cd 淋溶的影響發(fā)現(xiàn)AMF 使Cd 污染土壤中T-GRSP 含量和大團(tuán)聚體比例增加，降低了Cd 污染土壤中Cd 的回流和淋濾濃度，與本試驗(yàn)中接種AMF 減少Cd 的濃度和流失量的研究結(jié)果一致。此外菌絲上的結(jié)合位點(diǎn)將Cd吸附固定在植物的根部[31]，也能減少Cd 在溶液中的濃度。本試驗(yàn)相關(guān)性分析中，接種AMF處理中砂柱20 cm 深度的砂粒Cd 吸附量與Cd 流失量呈顯著負(fù)相關(guān)，砂柱30 cm 深度的溶液Cd 濃度與Cd 流失量呈顯著正相關(guān)。由此可見，AMF有降低Cd淋溶流失的能力。

有研究表明，AMF的分泌物有吸附Cd的作用，從而降低溶液中的Cd 濃度。GRSP 由專性生物營(yíng)養(yǎng)型AMF 的活菌絲產(chǎn)生[32]，具有膠狀、非水溶性和高比表面積的特性，GRSP黏合土壤顆粒，增加土壤中的微孔量使土壤的表面積增大[18，33]，這可能是石英砂比表面積增大的原因，AMF 對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響已被大量報(bào)道，但對(duì)石英砂比表面積等物理性質(zhì)影響的相關(guān)報(bào)道目前較少，需要大量試驗(yàn)驗(yàn)證。本試驗(yàn)相關(guān)性分析表明，砂柱中GRSP含量與砂粒Cd吸附量呈顯著正相關(guān)，與砂柱溶液Cd 濃度呈顯著正相關(guān)，說明了GRSP 可能增大石英砂吸附量，降低砂柱溶液中的Cd濃度，從而減少Cd 的流失。Wang 等[18]用GRSP 去除水中的Cd、Cu 試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，GRSP 能有效吸附76%的Cd 和95%的Cu，證實(shí)了GRSP 對(duì)Cd 的吸附作用。GRSP 吸附土壤中重金屬主要是因?yàn)镚RSP 上的羰基、羧基、羥基與重金屬有很高的配位性[34]，Cd 與這些官能團(tuán)形成配體后沉積在土壤中，降低了溶液中Cd 濃度[35]，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)GRSP 上基團(tuán)也能吸附土壤中的一些陽離子，和土壤中的重金屬形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，影響GRSP對(duì)Cd的吸附[36]。此外，AMF能分泌低分子量有機(jī)酸（LMWOAs），促進(jìn)重金屬的螯合和吸附，在土壤重金屬的固定中發(fā)揮著重要作用[37]。綜上所述，AMF 分泌的GRSP 對(duì)Cd 淋溶流失的減少有一定的貢獻(xiàn)，但AMF 分泌物對(duì)重金屬吸附的機(jī)理還不完善，應(yīng)做深入研究。

不同形態(tài)Cd的遷移能力不一樣。本試驗(yàn)中膠體態(tài)Cd 的流失量比溶解態(tài)Cd 的流失量小，主要原因是膠體態(tài)Cd 是土壤膠體吸附Cd2+，膠體的高表面積和反應(yīng)活性使其能夠吸附重金屬，同時(shí)膠體通過在基質(zhì)毛細(xì)管中的阻滯作用和在大孔壁上的共沉積作用，阻礙Cd在砂柱中的遷移[38-39]；但也有學(xué)者認(rèn)為膠體的存在會(huì)促進(jìn)Cd 遷移[40]。不同形態(tài)Cd 處理下，AMF 也會(huì)有不同的反應(yīng)機(jī)制。在溶解態(tài)Cd處理下，Cd2+優(yōu)先與帶負(fù)電荷的菌絲和根表面成分結(jié)合，AMF 菌絲的分泌物將溶解態(tài)Cd 由離子態(tài)向殘?jiān)鼞B(tài)轉(zhuǎn)變，并沉淀在砂柱中[36-37]；關(guān)于AMF 富集膠體態(tài)Cd 的報(bào)道較少，但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)AMF 會(huì)釋放羧酸溶解碳酸鹽巖和氧化物結(jié)合的重金屬，從較難溶解的形態(tài)中溶解重金屬[41]。有的微生物對(duì)溶解態(tài)Cd 的富集能力比膠體態(tài)Cd 強(qiáng)，因?yàn)榕c膠體結(jié)合的Cd 不能被微生物充分捕捉[42]。AMF對(duì)不同形態(tài)Cd響應(yīng)機(jī)制還要深入研究。

4 結(jié)論

（1）接種AMF 能增大石英砂比表面積，增加石英砂對(duì)Cd 的吸附能力，減少砂柱溶液中Cd 濃度，降低Cd的淋溶流失量。

（2）不同形態(tài)的Cd 對(duì)AMF 的生長(zhǎng)和GRSP 的含量沒有明顯的影響，但試驗(yàn)中膠體態(tài)Cd 的流失量小于溶解態(tài)Cd的流失量。

（3）接種AMF 砂柱中GRSP 濃度與石英砂Cd 吸附量呈顯著正相關(guān)，與砂柱溶液Cd 濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，石英砂Cd 吸附量與砂柱溶液Cd 濃度呈顯著負(fù)相關(guān)；且砂柱20 cm 處的砂粒Cd 吸附量與Cd 流失量呈顯著負(fù)相關(guān)，30 cm 處的溶液Cd 濃度與Cd 流失量呈顯著正相關(guān)。綜上所述AMF 菌絲及其分泌的GRSP對(duì)減少Cd的淋溶流失有一定的貢獻(xiàn)。