具有拮抗葡萄灰霉菌的生防酵母菌分離與篩選

張棟園，王曉妍，李 寧*，潘巨忠

(1.天津農學院 園藝園林學院，天津 300384；2.寧波市鄞州賽弗兌食品科技有限公司，浙江 寧波 315100)

葡萄灰霉病(graymold)是由灰葡萄孢(Botrytiscrnerea)引起的一種比較常見的并且危害非常嚴重病害，目前全球范圍內發(fā)生較多且危害比較嚴重的病害,在生長期及貯藏期均可發(fā)生[1-2]。目前防治葡萄灰霉病主要以化學藥物防治為主，但由于化學防治的種種弊端，葡萄灰霉病害的生物防治研究已經受到廣大研究者的普遍關注。拮抗酵母菌作為采后生物防治的新方法，具有保護環(huán)境、安全的特點，可以替代化學殺菌劑[3-5]。酵母菌不產生毒素，代謝產物天然、易分解，對人體不會構成威脅，并且大量存在于水果、蔬菜的表面，且許多酵母菌已經成為食品工業(yè)中重要的添加劑，具有較好的應用基礎[6-7]。近年來，雖然拮抗酵母菌在多種果實采后病害防治上取得一定的進展[9]。但是，真正應用于葡萄采后病害防治的報道還很少見。為提高葡萄采后的生物防治效果，筆者從不同食材(蘋果、葡萄、梨、香蕉、石榴、芒果、楊桃，木瓜中分離篩選出21株酵母菌并通過采用對峙培養(yǎng)，平皿對扣培養(yǎng)，孢子萌發(fā)法和果實活體接種篩選出1 株對葡萄采后灰霉菌具有生防潛力的拮抗酵母菌，旨在為葡萄采后的生物防治提供理論基礎和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

從王頂堤批發(fā)市場購買大小一致，成熟度8～9成的蘋果(品種紅富士)、葡萄(品種紅提)、梨(蘋果梨)、香蕉(仙人蕉)、石榴(品種黃里石榴)、芒果(小臺農芒)、楊桃(七根松楊桃)，木瓜等無病蟲和機械傷口的果實用于酵母菌的分離與篩選。

1.2 供試酵母菌

從供試材料的果皮和果肉分離中分離得到。

1.3 供試灰霉菌

葡萄灰霉菌(BotrytiscinereaPers)：由天津農學院植物病理實驗室提供。

1.4 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基， PDB培養(yǎng)基，YEPD培養(yǎng)基：采用常規(guī)方法制備。

2 實驗方法

2.1 酵母菌的分離與純化

材料中酵母菌的分離與篩選：分別取不同水果的果皮和果肉5 g，加入50 mL無菌水研磨成漿，然后進行梯度稀釋，最后分別用1×10-3，1×10-4，1×10-5進行平板涂布，封口膜封口置于28℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待長出單菌落后及時進行轉入新的培養(yǎng)基上進行純化。

2.2 不同酵母菌的離體抑菌效果測定

將已經配置好的馬鈴薯培養(yǎng)基加熱至融化，加入100 μL的72%鏈霉素(防治細菌污染),然后倒平板，待平板中的培養(yǎng)基凝固后在培養(yǎng)皿背面劃中線，在中線一側接入純化好的酵母菌，在中線另一側接上葡萄灰霉病菌餅，用封口膜密封培養(yǎng)，放入培養(yǎng)箱中進行平皿對峙培養(yǎng)，重復3次，并以無菌水作為對照，48 h后，測量葡萄灰霉菌菌落的長直徑和短直徑，通過公式計算抑制率。

抑制率=(處理皿菌落長直徑-處理皿菌落短直徑)/處理皿菌落長直徑×100%

2.3 不同酵母菌的產揮發(fā)性物質抑菌效果測定

采用雙皿對扣法測定不同酵母菌對葡萄灰霉病抑菌效果測定。向滅好菌的培養(yǎng)皿底加入15 mL的培養(yǎng)基，在一個培養(yǎng)皿底中接入酵母菌，在另一個培養(yǎng)皿底中央接入葡萄灰霉病菌餅，然后將接有灰霉病菌餅的平板和接入酵母菌的平板對扣，酵母菌在下，菌餅在上，用封口膜密封，每一個處理重復3次，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在對照組中，將涂了無菌水的平板和接入菌病的平板對扣，72 h后，測量葡萄灰霉病菌餅的直徑。測量方法：接種72 h后測量菌餅直徑，測量完畢之后利用公式計算出各種酵母菌對葡萄灰霉病的抑制率。

抑制率=(對照皿菌落直徑-處理皿菌落直徑)/對照皿菌落直徑×100%

2.4 數據處理

計算所得試驗數據的平均值，用SPSS Statistics處理數據并進行統(tǒng)計分析。

3 結果與分析

3.1 不同材料中酵母菌分離純化結果及抑菌效果初篩

通過對各種水果食材中酵母菌的分離得到21株酵母菌并編號，并對其抑制效果進行測定(見表1)：其中以下10株酵母菌具有明顯的抑菌效果：L-4，PG-2，SL-1，YT-1，MuG-1，MaG-2，XJ-1， HJ，NN，TZ-1，其抑制效果均超過50.00%，并且各處理之間差異顯著(p<0.05)，其中菌株SL-1抑菌效果最顯著，達到77.26%，顯著高于其它處理。

表1 初步篩選純化后的酵母菌

3.2 不同酵母菌對葡萄灰霉菌生長的影響

對初篩得到的10株酵母菌進行復篩。結果見表2(處理5 d后結果)，10株酵母菌對葡萄灰霉菌均有一定的抑制作用。但是對草莓灰霉菌抑制效果超過50%的5株，分別為：SL-1、XJ-1、 L-4、HJ 和MaG-2五株酵母菌，其中SL-1和L-4的抑制效果最顯著，分別為66.04%和63.63%，顯著高于其它幾個處理(p<0.05)其次酵母菌株MaG-2的抑菌效果也比較顯著，達到了60.62%；顯著低于菌株SL-1和L-4的抑菌效果(p>0.05)，顯著高于其余處理(p<0.05)。由此可以看出，從不同材料上得到的酵母菌，抑菌效果差異還是比較大。所以，從更多材料上來分離和篩選有拮抗?jié)摿Φ慕湍妇瞧渌黜椦芯亢蛻玫幕A。

表2 不同酵母菌對葡萄灰霉菌抑制率測定

3.3 不同酵母菌菌株產揮發(fā)性物質對葡萄灰霉菌生長的影響

由于酵母菌還可以產生具有揮發(fā)性的物質[10]，因此本研究專門對篩選出既有較好抑制效果的8株酵母菌進行了揮發(fā)性物質抑菌效果測定，結果見表3。

表3 酵母菌產生揮發(fā)性物質對葡萄灰霉菌生長的影響

從表3可以看出：10株酵母菌株均可以產生揮發(fā)性物質且對葡萄灰霉菌有不同程度的抑制效果。其中酵母菌株SL-1和PG-2對葡萄灰霉菌的抑制效果最佳，達到71.56%和68.80%，與其它處理相比，差異顯著(p<0.05)。其次為酵母菌菌株XJ-1，對葡萄灰霉菌的抑制率也達到了61.40%。由此可以推測從不同材料上分離得到的酵母菌株均可產生具有抑菌作用的揮發(fā)性物質，但是抑制作用差異比較大，這可能不同食材營養(yǎng)物質或者生長環(huán)境不同導致在其上生長繁殖的酵母菌株也有所不同，因而產生的揮發(fā)性物質的種類和數量也會有較大的差異。

4 結論與討論

在本研究中，通過對峙培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)酵母菌株SL-1和L-4的對葡萄灰霉菌菌絲體的抑制效果最顯著，分別為66.04%和63.63%；從不同酵母菌菌株產揮發(fā)性物質對葡萄灰霉菌生長的影響的實驗中發(fā)現(xiàn)酵母菌株SL-1和PG-2對葡萄灰霉菌的抑制效果最佳，達到71.56%和68.80%，綜合兩項實驗結果，我們可以得出結論酵母菌株酵母菌株SL-1和PG-2對葡萄采后灰霉菌具有良好的抑制效果，其中以酵母菌株SL-1效果最顯著，其次為酵母菌株PG-2。所以，對這兩株酵母菌需要進行更深入的研究，例如對生防酵母菌進行鑒定，對其生防機理進行深入研究，對其防治效果進行研究等一系列研究需要開展，通過深入研究有望進一步研究開發(fā)成新型生防酵母菌用于葡萄及其它果蔬采后病害的生物防治。