miR-1231通過(guò)靶向EGFR/PI3K/AKT通路抑制腦膜瘤細(xì)胞增殖研究

陳 波， 郭玉濤

(1.陜西省商洛市中心醫(yī)院神經(jīng)外科， 陜西 商洛 726000 2.延安大學(xué)咸陽(yáng)醫(yī)院超聲科， 陜西 咸陽(yáng) 712000)

腦膜瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，占所有原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤病例的三分之一以上，可引起顱神經(jīng)麻痹、癲癇和腦干受壓，最后可能導(dǎo)致癱瘓、吸入性肺炎和死亡。目前腦膜瘤的治療主要以外科手術(shù)和放療為主，盡管如此，腦膜瘤復(fù)發(fā)率仍然較高[1]。miRNA是一種長(zhǎng)度為18-25個(gè)核苷酸的小RNA，可通過(guò)與靶基因3'-UTR結(jié)合調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA的失調(diào)與癌癥和腫瘤微環(huán)境緊密相關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-1231在膠質(zhì)瘤中低表達(dá)，提示預(yù)后不良；細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明miR-1231具有抑制膠質(zhì)瘤的功能[3]。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)參與調(diào)控細(xì)胞增殖和動(dòng)物發(fā)育，其失調(diào)與多種癌癥的惡性轉(zhuǎn)化和進(jìn)展密切相關(guān)[4]。Dunn J S對(duì)腦膜瘤組織進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，EGFR表達(dá)上調(diào)，且PI3K/AKT /mTOR途徑異常激活。本研究旨在探究miR-1231通過(guò)靶向EGFR/PI3K/AKT通路對(duì)腦膜瘤細(xì)胞增殖的影響，以期為腦膜瘤發(fā)病機(jī)制的闡明和開(kāi)發(fā)更為有效的治療策略奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料:人腦膜瘤細(xì)胞系BEN-MEN-1購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司；原代正常人腦膜細(xì)胞和HEK-293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清(FBS)、Opti-MEM購(gòu)自Gibco公司；青鏈霉素混合液(100×)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京全式金公司；EGFR、p-PI3K、PI3K抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；p-AKT、AKT抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體和HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自武漢三鷹；miR-1231 mimic(miR-1231)、miR-1231 mimic陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-1231 inhibitor(anti- miR-1231)、miR-1231 inhibitor陰性對(duì)照(anti-miR-NC)、pcDNA3.1-EGFR(EGFR)和pcDNA3.1(EGFR-NC)均購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司。

1.2方 法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):BEN-MEN-1細(xì)胞、原代正常人腦膜細(xì)胞和HEK-293T細(xì)胞均用DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS、2mM L-谷氨酰胺、100IU/mL青霉素和100μg/ mL鏈霉素)，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染:BEN-MEN-1細(xì)胞或293T細(xì)胞接種于6孔板(4×105個(gè)/孔)，待細(xì)胞密度達(dá)到60～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Opti-MEM分別稀釋轉(zhuǎn)染混合物(miR-1231、miR-NC、anti-miR-1231、anti-miR-NC終濃度均為50nM，EGFR-NC和EGFR轉(zhuǎn)染量為4μg)和10μL Lipofectamine2000，總體積均為250μL，混合均勻，室溫孵育5min后，將兩者混合均勻，室溫孵育20min，隨后滴加于6孔板內(nèi)，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)48h。

1.2.3熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):針對(duì)EGFR 3'-UTR端序列構(gòu)建野生型(WT)和突變型(MUT)報(bào)告基因質(zhì)粒。參照1.2.2步驟，將EGFR-WT和EGFR-MUT分別與miR-NC、miR-1231共同轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞中，48h后檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.4RT-PCR:收集轉(zhuǎn)染后的BEN-MEN-1細(xì)胞(293T細(xì)胞)，Trizol法提取樣品中的總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)條件：95℃、30s；95℃、5s，58℃、30s，40個(gè)循環(huán)；95℃、15s；58℃、30s；95℃、15s。miR-1231以U6為內(nèi)參，EGFR以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-1231表達(dá)和EGFR mRNA的表達(dá)。所需引物序列見(jiàn)表1。

1.2.5Western blot:收集轉(zhuǎn)染后的BEN-MEN-1細(xì)胞或293T細(xì)胞，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，取30μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。10%脫脂奶粉室溫封閉3h，加入EGFR(1∶1500)、p-PI3K(1∶1000)、PI3K(1∶2000)、p-AKT(1∶2000)、AKT(1∶1000)和GAPDH(1∶2000)，4℃過(guò)夜孵育。HRP標(biāo)記二抗(1∶2500稀釋)室溫孵育1h后，ECL發(fā)光、曝光。Image J分析條帶灰度值，以目的條帶與GAPDH比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-PCR所需引物

1.2.6CCK-8:BEN-MEN-1細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，用DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，向96孔板中每孔加入100μL細(xì)胞懸液(5×104個(gè)/mL)。37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)12h、24h、48h、72h后，向每孔內(nèi)加入10μL CCK-8溶液，37℃、5%CO2條件下孵育3h。酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450nm處的光密度(OD)值。

1.2.7集落形成實(shí)驗(yàn):BEN-MEN-1細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，用DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1×103個(gè)/孔密度接種于6孔板，37℃、5%CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)2周。PBS清洗細(xì)胞，4%多聚甲醇固定30min，1%結(jié)晶紫染色10min。PBS洗滌細(xì)胞，晾干，拍照并計(jì)數(shù)。

1.2.8EdU實(shí)驗(yàn):BEN-MEN-1細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞量接種于96孔板，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h。DMEM培養(yǎng)基以1000∶1比例稀釋EdU溶液，終濃度為50μm。每孔加入100μL EdU培養(yǎng)基37℃孵育2h后，移除培養(yǎng)基。PBS清洗細(xì)胞后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.5%Triton X-100通透，隨后EdU Alexa-Fluor 594進(jìn)行熒光標(biāo)記，Hoechst 33342染核。PBS清洗細(xì)胞后，置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1BEN-MEN-1細(xì)胞中miR-1231表達(dá)下調(diào)，EGFR表達(dá)上調(diào):RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常人腦膜細(xì)胞相比，BEN-MEN-1細(xì)胞中miR-1231表達(dá)顯著下調(diào)(圖1A，P<0.05)，EGFR mRNA和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(圖1A、B，P<0.05)。

圖1 BEN-MEN-1細(xì)胞中miR-1231和EGFR的表達(dá)

2.2miR-1231抑制BEN-MEN-1細(xì)胞增殖:由CCK-8、集落形成實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與miR-NC組相比，miR-1231組細(xì)胞活力顯著下調(diào)(圖2A，P<0.05)，細(xì)胞克隆數(shù)和EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著下調(diào)(圖2B、C，P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-1231組細(xì)胞活力顯著上調(diào)(圖2A，P<0.05)，細(xì)胞克隆數(shù)和EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著上調(diào)(圖2B、C，P<0.05)。

2.3miR-1231靶向抑制EGFR/PI3K/AKT通路:miR-1231與EGFR 3'-UTR結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖3A。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-1231可顯著降低野生型EGFR 3'-UTR報(bào)告基因的相對(duì)熒光素酶活性(圖3B，P<0.05)，而對(duì)突變型EGFR 3'-UTR報(bào)告基因的相對(duì)熒光素酶活性無(wú)顯著影響(圖3B，P>0.05)。miR-1231顯著下調(diào)BEN-MEN-1細(xì)胞中EGFR、p-PI3K和p-AKT表達(dá)(圖3C，P<0.05)；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-1231顯著上調(diào)BEN-MEN-1細(xì)胞中EGFR蛋白表達(dá)、PI3K和AKT磷酸化水平(圖3C，P<0.05)。

圖3 miR-1231靶向抑制EGFR / PI3K / AKT通路

2.4miR-1231通過(guò)抑制EGFR/PI3K/AKT通路抑制BEN-MEN-1細(xì)胞增殖:由Western blot、CCK-8、集落形成實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與miR-NC+EGFR-NC組相比，miR-1231+EGFR-NC組細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)、PI3K和AKT磷酸化水平均顯著下調(diào)(圖4A，P<0.05)，細(xì)胞活力和增殖能力均顯著下調(diào)(圖4B、C、D，P<0.05)；與miR-NC+EGFR-NC組相比，miR-NC+EGFR組細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)、PI3K和AKT磷酸化水平均顯著上調(diào)(圖4A，P<0.05)，細(xì)胞活力和增殖能力均顯著上調(diào)(圖4B、C、D，P<0.05)；與miR-1231+EGFR-NC組相比，miR-1231+EGFR組細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)、PI3K 和AKT磷酸化水平均顯著上調(diào)(圖4A，P<0.05)，細(xì)胞活力和增殖能力均顯著上調(diào)(圖4B、C、D，P<0.05)。

圖4 miR-1231通過(guò)抑制EGFR/PI3K/AKT通路抑制BEN-MEN-1細(xì)胞增殖

3 討 論

腦膜瘤是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一，也是迄今為止最常見(jiàn)的軸外腫瘤[5]。手術(shù)切除是治療腦膜瘤的主要方式之一。然而，由于解剖學(xué)上的復(fù)雜性和與附近關(guān)鍵結(jié)構(gòu)的接近性，僅有約50%的病例實(shí)現(xiàn)了腫瘤的完全切除[6]。已有研究證明多種miRNA與腦膜瘤的發(fā)展密切相關(guān)[7]。miR-1231在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和前列腺癌中低表達(dá)且與其預(yù)后相關(guān)[3]。然而，miR-1231在腦膜瘤中的作用還尚未可知。

miR-1231是miRNA家族成員之一，miR-1231在胰腺癌患者血漿和胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)[8]。已有研究證明，過(guò)表達(dá)miR-1231抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和BALB/C裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)[9]。本研究結(jié)果顯示，腦膜瘤細(xì)胞中miR-1231表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-1231抑制腦膜瘤細(xì)胞增殖，干擾miR-1231后則促進(jìn)腦膜瘤細(xì)胞增殖。這些結(jié)果提示，miR-1231具有腫瘤抑制因子的作用。

EGFR在腫瘤細(xì)胞增殖、分化和抗凋亡中起調(diào)節(jié)作用，它的異常表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、粘附、轉(zhuǎn)移和侵襲。由本研究結(jié)果可知，腦膜瘤細(xì)胞中EGFR表達(dá)上調(diào)，提示EGFR可能在腦膜瘤中發(fā)揮促腫瘤作用。研究表明，過(guò)表達(dá)miR-1231通過(guò)靶向EGFR抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[8]。本研究結(jié)果顯示，miR-1231靶向調(diào)控EGFR抑制腦膜瘤細(xì)胞的增殖。

EGFR與相關(guān)配體的結(jié)合可以激活PI3K/AKT信號(hào)通路[10]。本研究結(jié)果顯示，在腦膜瘤細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)EGFR可活化PI3K/AKT信號(hào)通路。研究證明，PI3K/AKT信號(hào)通路的異常與腫瘤的生長(zhǎng)、維持和化學(xué)抗性有關(guān)[11]。激活EGFR/PI3K/Akt/mTOR通路可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性特征[12]。由本研究結(jié)果可知，miR-1231通過(guò)靶向EGFR抑制PI3K/AKT通路活化，從而抑制腦膜瘤細(xì)胞增殖，過(guò)表達(dá)EGFR則可逆轉(zhuǎn)miR-1231對(duì)PI3K/AKT通路及腦膜瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。

綜上所述，miR-1231通過(guò)靶向EGFR抑制PI3K/AKT通路活化，從而抑制腦膜瘤細(xì)胞增殖。該研究有利于進(jìn)一步揭示腦膜瘤的致病機(jī)制，為腦膜瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)。miR-1231通過(guò)靶向EGFR調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路對(duì)腦膜瘤凋亡、自噬等其他生物學(xué)進(jìn)程的影響還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。