散結(jié)消癭顆粒對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎大鼠氧化應(yīng)激的干預(yù)作用研究

張杰，余躍，俞璐，楊濤濤，胡靜波，李藝萱

自身免疫性甲狀腺炎（EAT）又稱橋本甲狀腺炎（HT），是以甲狀腺特異性自身抗體為特征的一種最常見(jiàn)的自身免疫性疾病[1]，屬中醫(yī)癭病范疇。散結(jié)消癭顆粒是依據(jù)明代陳實(shí)功《外科正宗》“海藻玉壺湯”，經(jīng)臨床辨證施治加減而成的有效驗(yàn)方，保留了原方中主要藥味（海藻、半夏、川芎、夏枯草），具有化痰軟堅(jiān)、理氣散結(jié)的功效。前期試驗(yàn)進(jìn)行了散結(jié)消癭顆粒提取工藝的優(yōu)化[2]和體外抗氧化評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)散結(jié)消癭顆粒能有效抑制大鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化和紅細(xì)胞溶血，對(duì)鐵離子有較好的還原能力及羥自由基清除能力[3]。為進(jìn)一步探究散結(jié)消癭顆粒治療EAT的體內(nèi)氧化/抗氧化平衡調(diào)控機(jī)制，本研究構(gòu)建EAT大鼠模型，觀察散結(jié)消癭顆粒對(duì)NADPH氧化酶亞基p22phox、gp91phox基因和蛋白表達(dá)、超氧化物歧化酶（SOD）/丙二醛（MDA）水平的干預(yù)作用，以期闡明散結(jié)消癭顆粒治療EAT的潛在作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠（200±10）g 32只，雌雄各半，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)及試驗(yàn)均在寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（SYXK[浙]2019-0005）進(jìn)行和完成。藥品：散結(jié)消癭顆粒（浸膏）制備[2]：海藻、半夏、夏枯草藥材按處方比例提取2次，第一次加水12倍量，第二次加水10倍量，提取時(shí)間均為1.5 h，濾過(guò)，合并濾液，濃縮，備用；川芎按處方比例乙醇回流提取，60%乙醇8倍量，提取3次，每次2 h，濾過(guò)，合并濾液，濃縮，與上述藥物濃縮液混合，并濃縮至含生藥材2.7 g/ml。試劑和來(lái)源：豬甲狀腺球蛋白（PTg，酷爾化學(xué)科技有限公司），完全弗氏佐劑（CFA，Sigma公司），不完全弗氏佐劑（IFA，Sigma公司），TgAb酶聯(lián)免疫試劑盒（Thermo公司），TPOAb酶聯(lián)免疫試劑盒（Thermo公司），Anti-Gp91phox抗體（Abcam公司），Anti-P22phox抗體（GeneTex公司），Anti-GAPDH抗體（Proteintech公司），HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體（碧云天生物技術(shù)有限公司），MDA和SOD測(cè)定試劑盒（均為南京建成生物工程研究所有限公司），Trizol（Invitrogen公司），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），PVDF轉(zhuǎn)印膜（Millipore公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 小型垂直電泳系統(tǒng)（Bio-Rad），多功能酶標(biāo)（SpectraMax iD5），多樣品組織研磨儀（凈信，Tissuelyser-24），冷凍離心機(jī)（Eppendorf，5424R），超靈敏多功能成像儀（GE，Amersham Imager 680UV）。

1.3 方法

1.3.1 EAT大鼠模型的建立[4]32只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除8只留作正常組外其余大鼠造模，PTg用0.9氯化鈉注射液溶解，含量為2 mg/ml，與CFA按體積比1∶1混合，乳化成油包水乳劑，每只大鼠100g乳化的PTg多點(diǎn)皮下注射進(jìn)行初次免疫，上述PTg溶液與IFA按體積比1∶1混合后于第2周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，以后每周加強(qiáng)免疫1次，共加強(qiáng)免疫4次。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥 正常組給予蒸餾水10ml/kg；模型組給予蒸餾水10 ml/kg；SJXY低劑量組給予散結(jié)消癭顆粒浸膏（相當(dāng)于1倍處方量）4.9 g/kg；SJXY高劑量組給予散結(jié)消癭顆粒浸膏（相當(dāng)于8倍處方量）39.2 g/kg。以上各組大鼠均在相同條件下飼養(yǎng)，從造模完成的24 h后按照上述劑量給藥，連續(xù)給藥5周。

1.3.3 標(biāo)本采集 于實(shí)驗(yàn)?zāi)┐谓o藥6 h后，所有大鼠麻醉后心臟取血，用于檢測(cè)血清SOD活性、MDA含量，然后處死大鼠，解剖并迅速取出甲狀腺，pH 7.4 PBS研磨制備組織勻漿液，用于檢測(cè)甲狀腺組織p22phox、gp91phox基因和蛋白表達(dá)。

1.3.4 血液指標(biāo)檢測(cè) 大鼠心臟取血，按照試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定各組血清SOD活性和MDA含量。

1.3.5 RT-PCR按照試劑盒說(shuō)明書提取各組大鼠甲狀腺組織總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列：gp91phox上游引物5’-ACAAGGTTTATGACGATGAGCCTA-3’，下游引物5’-CACTGGCAGCAAGATCAGCA-3’，p22phox上 游 引 物5’-CTCTATTGTTGCAGGAGTGC-3’，下 游 引 物5’-TCAATGGGAGTCCACTGCTCAC-3’。

1.3.6 Western blot取大鼠雙側(cè)部分甲狀腺組織，加入RIPA裂解液勻漿，提取總蛋白，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜后分別加Anti-Gp91phox抗體（1∶2000）和Anti-P22phox抗體（1∶1000），4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗3次、每次10 min，加入HRP標(biāo)記二抗（1∶1 000）、室溫1 h，ECL顯影、曝光，ImageJ灰度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TgAb、TPOAb水平比較 模型組TgAb、TPOAb水平均高于正常組（均＜0.01），SJXY低劑量、高劑量組TgAb、TPOAb水平均低于模型組（均＜0.05）。SJXY高劑量組與低劑量組相比，TgAb、TPOAb水平均呈下降趨勢(shì)（均＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各實(shí)驗(yàn)組TgAb、TPOAb水平比較

2.2 SOD及MDA水平比較 模型組SOD活性降低，MDA含量升高，SOD/MDA水平低于正常組（＜0.01），SJXY高劑量組與模型組相比，SOD活性升高，MDA含量降低，SOD/MDA水平升高（均＜0.05），而SJXY低劑量組與模型組相比，SOD活性升高，MDA含量降低，SOD/MDA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各實(shí)驗(yàn)組SOD/MDA水平比較

2.3 p22phox及gp91phox基因水平比較 模型組p22phox、gp91phox基因水平均高于正常組（均＜0.01）。SJXY低劑量、高劑量組p22phox、gp91phox基因水平均低于模型組（均＜0.05）。SJXY高劑量組與低劑量組相比，p22phox、gp91phox基因水平均呈下降趨勢(shì)（均＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各實(shí)驗(yàn)組p22phox、gp91phox基因水平比較

2.4 p22phox及gp91phox蛋白表達(dá)比較 模型組p22phox、gp91phox蛋白表達(dá)均高于正常組（均＜0.01）。SJXY低劑量、高劑量組p22phox、gp91phox蛋白表達(dá)均低于模型組（均＜0.05）。SJXY高劑量組與低劑量組相比，p22phox、gp91phox蛋白表達(dá)均呈下降趨勢(shì)。見(jiàn)圖1。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組p22phox、gp91phox蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

EAT發(fā)病機(jī)制涉及體液免疫和細(xì)胞免疫，但導(dǎo)致甲狀腺組織破壞的具體機(jī)制目前仍未闡明[5]，氧化應(yīng)激在EAT發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。TgAb、TPOAb作為破壞性抗體，引起甲狀腺組織損傷，活化的B和T細(xì)胞對(duì)抗TgAb、TPOAb在EAT中的作用，并通過(guò)NADPH氧化酶產(chǎn)生過(guò)量的活性氧，過(guò)多的活性氧引起氧化應(yīng)激，進(jìn)一步損傷甲狀腺組織[6-7]。另一方面，EAT患者后期出現(xiàn)甲狀腺功能減退，甲狀腺激素分泌減少，使EAT患者的抗氧化酶（如SOD）活性降低，抗氧化能力減弱[8]。也有研究報(bào)道EAT患者中脂質(zhì)過(guò)氧化程度增加，MDA含量增高[9]。本研究中以TgAb、TPOAb作為甲狀腺組織損傷的重要標(biāo)志物[10]，用來(lái)判斷EAT造模是否成功，SOD/MDA比值變化用來(lái)評(píng)價(jià)機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)[11]。本研究結(jié)果顯示模型組TgAb、TPOAb水平均升高，表明造模成功，模型組中SOD含量下降，MDA含量升高，SOD/MDA顯著降低；這提示EAT大鼠外周血中存在明顯的氧化/抗氧化失衡。給予SJXY低劑量、高劑量干預(yù)后，TgAb、TPOAb水平均降低，且SJXY高劑量給藥還能顯著提升SOD/MDA水平，表明散結(jié)消癭顆粒能改善EAT大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)。

NADPH氧化酶是體內(nèi)活性氧的主要來(lái)源，有同源物NOX1-5和DUOX1-2，被統(tǒng)稱為NOX家族，gp91phox、p22phox為其共同的亞基，DUOX1-2主要分布在甲狀腺中，參與甲狀腺激素的合成[12]。多項(xiàng)研究表明，上調(diào)NADPH氧化酶，產(chǎn)生過(guò)多的活性氧，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，不僅會(huì)造成甲狀腺損傷[7]，還與體內(nèi)多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[13-14]。最近也有研究報(bào)道NOX4介導(dǎo)的活性氧釋放參與甲狀腺癌變過(guò)程[15-16]。那么下調(diào)NADPH氧化酶活性，減少活性氧釋放，很可能成為減輕氧化應(yīng)激損傷的有效干預(yù)手段。本研究中發(fā)現(xiàn)模型組大鼠甲狀腺p22phox、gp91phox基因和蛋白表達(dá)均顯著升高，這表明EAT大鼠甲狀腺組織中NADPH氧化酶活性增高，SJXY低劑量、高劑量干預(yù)后，兩組中p22phox、gp91phox基因和蛋白表達(dá)均明顯降低；這表明散結(jié)消癭顆粒能下調(diào)NADPH氧化酶活性，減少過(guò)多的活性氧產(chǎn)生，提示對(duì)NADPH氧化酶的活性調(diào)控很可能是散結(jié)消癭顆粒發(fā)揮藥效的靶點(diǎn)所在。

綜上所述，EAT大鼠體內(nèi)存在明顯的氧化應(yīng)激紊亂，散結(jié)消癭顆粒能通過(guò)下調(diào)甲狀腺組織NADPH氧化酶亞基p22phox、gp91phox基因和蛋白表達(dá)，減少活性氧產(chǎn)生，增加SOD/MDA水平，提升抗氧化能力，同時(shí)降低TgAb和TPOAb水平，減少甲狀腺組織損傷，起到很好的治療作用。