溫度、鹽度和照度對菌藻聯(lián)合體氨氮吸收的影響

王培明，李長玲，黃翔鵠，李 峰，李 豫，陳怡卉

溫度、鹽度和照度對菌藻聯(lián)合體氨氮吸收的影響

王培明1,2,3，李長玲1,2,3，黃翔鵠1,2,3，李 峰1,2,3，李 豫1,3，陳怡卉1,3

（1. 廣東海洋大學水產(chǎn)學院，廣東 湛江 524088；2. 廣東海洋大學深圳研究院，廣東 深圳 518000；3. 廣東省藻類養(yǎng)殖及應用工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524025）

【】探究溫度、鹽度和照度對側(cè)孢短芽孢桿菌（）和威氏海鏈藻（）聯(lián)合體系氨氮吸收的影響。利用穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)測定側(cè)孢芽孢桿菌和威氏海鏈藻對氨氮的吸收速率，分析不同環(huán)境因子水平下側(cè)孢短芽孢桿菌和威氏海鏈藻聯(lián)合體系對氨氮吸收的規(guī)律。單因子實驗結(jié)果顯示溫度、鹽度和照度對菌藻聯(lián)合體氨氮吸收速率影響顯著（< 0.05），當溫度25 ~ 35 ℃，鹽度20和照度8 000 lx時菌藻聯(lián)合體氨氮吸收速率較高；正交實驗結(jié)果顯示，溫度25 ℃，鹽度25和光照4 000 lx是菌藻聯(lián)合體氨氮吸收的最優(yōu)組合條件，鹽度是影響其吸收速率的主要因子，其次是溫度和照度；威氏海鏈藻在菌藻聯(lián)合體系氨氮吸收中占主要貢獻。側(cè)孢短芽孢桿菌和威氏海鏈藻所構(gòu)建的聯(lián)合體系可在高溫、高鹽和強光環(huán)境下實現(xiàn)對對蝦池塘中過量氨氮的有效吸收，在改善我國華南地區(qū)對蝦養(yǎng)殖池塘的水質(zhì)方面具有廣闊的應用前景。

菌藻聯(lián)合體系; 側(cè)孢短芽孢桿菌; 威氏海鏈藻; 氨氮; 環(huán)境因子

水體富營養(yǎng)化是對蝦養(yǎng)殖水體環(huán)境面臨的主要污染問題，而過量氮源輸入是引起水體富營養(yǎng)化的主要原因之一[1-3]。因此，如何有效處理養(yǎng)殖水體中過量氮源以維持健康水質(zhì)環(huán)境已經(jīng)成為對蝦養(yǎng)殖行業(yè)需要攻克的主要課題。

微藻和細菌是對蝦養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中重要組成部分，在維持養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)動態(tài)平衡、加速物質(zhì)循環(huán)、凈化養(yǎng)殖水質(zhì)中扮演著重要角色。一方面，作為能量和物質(zhì)的轉(zhuǎn)化主體，細菌和微藻可有效吸收利用對蝦養(yǎng)殖池溏中過量溶解態(tài)氮，減輕水體富營養(yǎng)化程度，對維持健康水質(zhì)環(huán)境具有重要作用[1, 4]。另一方面，細菌降解有機質(zhì)產(chǎn)生的二氧化碳可為藻類提供碳源，而藻類光合作用釋放的氧氣又可促進細菌呼吸代謝，二者相輔相成。已有研究表明利用藻菌共生系統(tǒng)可以有效處理養(yǎng)殖廢水中的氨氮[5-7]。因此，科學構(gòu)建藻菌聯(lián)合體系有可能成為改善對蝦養(yǎng)殖水質(zhì)環(huán)境，發(fā)展綠色健康養(yǎng)殖的新策略。

側(cè)孢短芽孢桿菌（）是一種刺激植物生長的激素類試劑，具有增強植物新陳代謝和光合作用、降解有機物以及防控藍藻等功能[8-10]，已廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)。威氏海鏈藻（）是對蝦養(yǎng)殖池溏中一種常見硅藻，是優(yōu)良的開口餌料[11]。為改善對蝦養(yǎng)殖水質(zhì)環(huán)境，構(gòu)建對蝦綠色、生態(tài)、健康養(yǎng)殖的養(yǎng)殖模式，本研究選取威氏海鏈藻和側(cè)孢短芽孢桿菌為主要研究對象，利用15N穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)，探究威氏海鏈藻和側(cè)孢短芽孢桿菌對氮吸收速率及貢獻率，以期為開展科學構(gòu)建蝦塘藻菌聯(lián)合體系改善養(yǎng)殖水體環(huán)境提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

側(cè)孢短芽孢桿菌和威氏海鏈藻由廣東海洋大學藻類資源開發(fā)與養(yǎng)殖環(huán)境生態(tài)修復實驗室提供。細菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，微藻培養(yǎng)基為人工海水配制的f/2改良培養(yǎng)基，改良之處在于添加1.5倍的氮、磷并去除維生素和生物素。GF/D膜處理：實驗開始前將GF/D膜在450 ℃煅燒4 h，稱重、記錄數(shù)據(jù)后，分置于干燥皿中備用。實驗藥品：同位素示蹤劑為氯化銨（15N-NH4Cl，98 % atom）。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計 溫度梯度為15、20、25、30、35 ℃；在照度2 000 lx，鹽度30的條件下培養(yǎng)。照度梯度為500、1 000、2 000、4 000、 8 000 lx；在溫度25 ℃和鹽度30的條件下培養(yǎng)。鹽度梯度為10、15、20、25、30；在溫度25 ℃和鹽度30的條件下培養(yǎng)。每個因子實驗設置3個平行組。

1.2.2 實驗方法 實驗前24 h取微藻母液離心 （3 000 r/min，10 min）去除上清液，收集藻體并用無氮人工海水培養(yǎng)1 d，進行氮饑餓處理。取細菌母液同樣方法離心去上清液，收集菌體。培養(yǎng)容器為250 mL的錐形瓶，培養(yǎng)體系為100 mL，將菌藻接種到培養(yǎng)基中，接種濃度分別為106cfu/mL和106cell/mL[12]，構(gòu)建菌藻比例為1∶1的聯(lián)合體系，每個實驗組，添加NH4Cl作為源，使其濃度為0.106 3 mmol/L[1]，其中10 %為15N-NH4Cl示蹤劑，即0.010 63 mmol/L，在恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，每隔1 h搖晃1次。實驗結(jié)束后，取50mL水樣用Whatman GF/D的玻璃纖維濾膜（預先煅燒）抽濾，藻體留在濾膜上，抽濾結(jié)束后添加10 mL雙蒸水再次抽濾，以洗脫吸附在藻細胞表面的示蹤劑。取50 mL濾液離心（5 000 r/min，16 min）去上清，添加10 mL雙蒸水沖洗菌體再次離心后，去上清液收集菌體。

1.2.3 樣品處理 藻體和細菌置于烘箱，在60 ℃條件下烘干至恒重（24 h），稱量樣品干質(zhì)量，研成粉末后取2 ~ 4 mg樣品用錫囊（Pressed Tin Capsules5×9 mm）包裝，送至廣東海洋大學海洋與氣象學院測定樣品的δ15N和總氮的質(zhì)量分數(shù)（%）。

1.2.4 正交法優(yōu)化菌藻聯(lián)合體系吸收氨氮的培養(yǎng)條件 以溫度、鹽度和光照為考察因素，選取3個水平，設計正交實驗，通過正交實驗得出菌藻聯(lián)合體對氨氮吸收速率最佳培養(yǎng)條件。實驗結(jié)束后，取50 mL濾液離心（5 000 r/min，6 min）去上清，添加10 mL雙蒸水沖洗菌體再次離心后，收集菌藻聯(lián)合體，按照1.2.3 進行樣品處理。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理分析 樣品中15Ns豐度(15Ns)計算方法：

式中，d15N為樣品中15N元素的穩(wěn)定同位素比值與標準物（大氣）的相應比值的千分偏差，standard為國際原子能機構(gòu)（IAEA）確定的標準物質(zhì)大氣氮中15N/14N豐度（0.003 65）。

吸收速率計算方法：

式中，為N絕對吸收速率（μg·g-1·h-1），(15Nn)為實驗樣品中15N的自然豐度，(15Ns)為培養(yǎng)結(jié)束時藻類體中的15N豐度，(15Nenr)為加入示蹤劑后培養(yǎng)介質(zhì)初始的15N豐度，PON為樣品的總氮量（μg·g-1），為培養(yǎng)時間h。

貢獻率計算方法[13]：

式中，為細菌或微藻對氮的吸收貢獻率，x為細菌或微藻對氮的吸收速率，u為菌藻聯(lián)合體對氮的吸收速率。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 數(shù)據(jù)使用Excel 2016軟件進行處理，吸收速率使用SPASS 19統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan多重比較，< 0.05表示具有顯著性差異。圖中凡含一個相同字母者表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 溫度對菌藻聯(lián)合體氨氮吸收速率和貢獻率影響

溫度對菌藻聯(lián)合體氨氮吸收速率影響顯著 （< 0.05），菌藻聯(lián)合體對氨氮的吸收速率隨溫度增加而增加，在25 ~ 35 ℃時吸收速率顯著高于其余組，為667.98 ~ 818.45 μg·g-1·h-1（圖1）。溫度對側(cè)孢短芽孢桿菌氨氮吸收速率影響顯著（< 0.05），在30 ℃時吸收速率最高，為111.40 μg·g-1·h-1，35 ℃時吸收速率出現(xiàn)下降，過低或過高溫度不利于其對氨氮的吸收（圖2）。溫度對于威氏海鏈藻氨氮的吸收速率影響顯著（< 0.05），在25 ~ 35 ℃時吸收速率顯著高于其余組，為618.43 ~ 707.04 μg·g-1·h-1（圖3），較高溫有利威氏海鏈藻吸收氨氮。25 ~ 35 ℃時藻-菌聯(lián)合體中側(cè)孢短芽孢桿菌和威氏海鏈藻對氨氮的吸收貢獻率分別為7 % ~ 14 %和86 % ~ 93 %；威氏海鏈藻在15 ℃時對氨氮吸收的貢獻率達97 %，是一種廣溫物種。側(cè)孢短芽孢桿菌對氨氮吸收率的貢獻率隨溫度升高而升高，30 ℃時最大值達14 %（圖4）。

圖1 溫度對菌藻聯(lián)合體氨氮吸收速率的影響

圖2 溫度對側(cè)孢短芽孢桿菌氨氮吸收速率的影響

圖3 溫度對威氏海鏈藻氨氮吸收速率的影響

圖4 溫度對菌藻氨氮吸收貢獻率的影響

2.2 鹽度對菌藻聯(lián)合體對氨氮吸收速率和貢獻率影響

鹽度對菌藻聯(lián)合體氨氮吸收速率影響顯著 （< 0.05），菌藻聯(lián)合體對氨氮的吸收速率呈“波浪式”趨勢，在鹽度20時吸收速率達最大值，為400.26 μg·g-1·h-1，顯著高于其余組（圖5）。鹽度對側(cè)孢短芽孢桿菌氨氮的吸收速率影響顯著（< 0.05），側(cè)孢短芽孢桿菌對氨氮的吸收速率呈先下降后上升趨勢，在鹽度15和20時吸收速率高于其余組，分別為81.40和76.42 μg·g-1·h-1（圖6），較低鹽度有利側(cè)孢短芽孢桿菌吸收氨氮。鹽度對威氏海鏈藻氨氮的吸收速率影響顯著（< 0.05），鹽度為20和30時的吸收速率高于其余組，分別為323.84和305.60 μg·g-1·h-1（圖7）。在鹽度20時藻-菌聯(lián)合體中側(cè)孢短芽孢桿菌和威氏海鏈藻對氨氮吸收貢獻率分別為19%和81%；低鹽度有利側(cè)孢短芽孢桿菌吸收氨氮，在鹽度15時吸收貢獻率最大達25%；威氏海鏈藻吸收氨氮在鹽度25時吸收貢獻率最大達84%（圖8）。

圖5 鹽度對菌藻聯(lián)合體氨氮吸收速率的影響

圖6 鹽度對側(cè)孢短芽孢桿菌氨氮吸收速率的影響

圖7 鹽度對威氏海鏈藻氨氮吸收速率的影響

圖8 鹽度對菌藻氨氮吸收貢獻率的影響

2.3 照度對菌藻聯(lián)合體對氨氮吸收速率和貢獻率的影響

照度對菌藻聯(lián)合體氨氮吸收速率影響顯著（< 0.05），在實驗照度范圍內(nèi)，菌藻聯(lián)合體對氨氮的吸收速率隨著照度增加而增加，在8 000 lx時吸收速率達到最大值，為562.15 μg·g-1·h-1，顯著高于其余組（圖9）。照度對側(cè)孢短芽孢桿菌吸收氨氮的影響差異顯著（< 0.05），對氨氮吸收速率隨照度增加呈先下降后升高的趨勢，在500 lx和8 000 lx的吸收速率高于其余組，分別為41.54和44.8 μg·g-1·h-1（圖10）。照度對威氏海鏈藻吸收氨氮的影響差異顯著（< 0.05），吸收速率與照度呈正相關(guān)關(guān)系，在實驗照度范圍內(nèi)，吸收速率隨照度的增加而增加，照度在8 000 lx時吸收速率達到最大值，為517.3 μg·g-1·h-1，顯著高于其余組（< 0.05），較強照度有利威氏海鏈藻吸收氨氮（圖11）。照度8 000 lx時藻-菌聯(lián)合體中側(cè)孢短芽孢桿菌和威氏海鏈藻對氨氮的吸收貢獻率分別為8 %和92 %；側(cè)孢短芽孢桿菌在500 lx吸收貢獻率最大值達14 %；在適宜照度范圍，增加照度有利于威氏海鏈藻進行光合作用，對氨氮吸收加快，在8 000 lx時對氨氮吸收貢獻率達92 %（圖12）。

圖9 光照對菌藻聯(lián)合體氨氮吸收速率的影響

圖10 照度對側(cè)孢短芽孢桿菌氨氮吸收速率的影響

圖11 照度對威氏海鏈藻氨氮吸收速率的影響

2.4 正交法優(yōu)化菌藻聯(lián)合體吸收氨氮的培養(yǎng)條件

菌藻聯(lián)合體氨氮吸收速率正交實驗結(jié)果進行直觀分析（表1，2），溫度、鹽度和照度在水平1分別為949.00、826.30和935.23 μg·g-1·h-1；水平2分別為911.89、1023.57和937.55 μg·g-1·h-1；水平3分別為914.83、925.85和902.94 μg·g-1·h-1；極差值分別為37.11、197.27和34.61 μg·g-1·h-1。鹽度是影響菌藻聯(lián)合體氨氮吸收速率的主要因子，其次是溫度和照度。菌藻聯(lián)合體吸收NH+ 4-N的最佳組合為溫度25 ℃，鹽度25，光照4 000 lx。

表1 菌藻聯(lián)合體氨氮吸收速率正交實驗L9（33）結(jié)果

表2 正交實驗方差分析

3 討論

3.1 溫度對菌藻聯(lián)合體氨氮吸收的影響

溫度可顯著影響菌藻對氨氮的吸收速率。在適宜溫度條件下，菌藻生長旺盛，代謝活動加快，有助于菌藻對氨氮吸收。當溫度過低或過高時，菌藻生命活動受到抑制，代謝活動變低，對氨氮吸收也會減慢[14-17]。不同菌藻體系對氮吸收的最適溫度范圍存在差異。Delgadillo等[18]研究了不同溫度下菌藻復合物對氨氮去除的影響，結(jié)果表明，在5 ℃時對氨氮沒有去除效果，15 ~ 25 ℃時有較高去除率。劉娥等[19]報道了在24 ℃時藻菌球?qū)︷B(yǎng)殖廢水中氨氮吸收效果最好。高敏[20]報道了固定化菌藻氨氮吸收的最適溫度為28 ℃。本研究中所構(gòu)建的菌藻聯(lián)合體系對氨氮吸收的適宜溫度為25 ~ 35 ℃，這與對蝦的適宜生長溫度（24~33 ℃）[1]一致，表明側(cè)孢短芽孢桿菌和威氏海鏈藻所構(gòu)建的菌藻聯(lián)合體比較適合應用于對蝦池養(yǎng)殖池塘中。

3.2 鹽度對菌藻聯(lián)合體氨氮吸收的影響

鹽度主要通過滲透壓脅迫、離子脅迫以及改變細胞膜對離子的通透性等方式影響生物對氨氮的吸收[21]。何義進[22]報道了在適宜鹽度范圍內(nèi)，光合細菌對養(yǎng)殖水體的氨氮具有很好降解效果。適宜鹽度還可以促進藻類光合作用及對營養(yǎng)物質(zhì)吸收[23]，因而促進對氮吸收。但在鹽脅迫條件下，會影響生物對氮吸收。有研究指出，高鹽可抑制厭氧氨化細菌活性，導致細菌對氨氮降解性能降低[24]。鹽脅迫下，藻類會產(chǎn)生活性氧破壞PS Ⅱ復合物，致使光合速率降低[25]，光合作用產(chǎn)物也隨之偏向脂質(zhì)而非蛋白質(zhì)[26-27]，從而減慢對氮的吸收。研究顯示菌藻聯(lián)合體在鹽度20對氨氮具有較好吸收效果，而對蝦養(yǎng)殖期間水體鹽度變化范圍為21.08 ~ 31.13，兩者鹽度范圍相近，表明本研究所用的菌藻聯(lián)合體適用于海水對蝦養(yǎng)殖水體中降解氨氮。

3.3 照度對菌藻聯(lián)合體氨氮吸收的影響

光照通過直接影響威氏海鏈藻的光合作用，來影響菌藻聯(lián)合體系對氨氮的吸收。藻是光合自養(yǎng)型生物，能將吸收的光能轉(zhuǎn)化為供自身生長的化學能。通常情況下，隨著照度增加，藻類的光合作用增強[28]。一旦超過光飽和點，就會對藻類產(chǎn)生光抑制效應，強光會產(chǎn)生光氧化脅迫，破壞藻類光合系統(tǒng)中的蛋白和色素，抑制藻類生長[29]，甚至會造成藻類死亡[30]。氮是藻類生長必不可少的元素，光照可以通過影響光合作用直接影響藻類對氮的吸收。而藻類通過光合作用產(chǎn)生氧供細菌呼吸代謝使用，因此光照對細菌吸收氮產(chǎn)生間接影響。羅龍皂等[31]研究發(fā)現(xiàn)光照強度在400 μmol·m-2·s-1時，藻-菌系統(tǒng)對豬場沼液中的氨氮去除率最高，增加照度并沒有提高去除效果。本研究中菌藻聯(lián)合體對氨氮速率隨著光照強度增加而增加，在8 000 lx吸收速率達最大值，較強光照有利菌藻聯(lián)合體氨氮的吸收；菌藻聯(lián)合體適用于日照時間長、陽光充足的養(yǎng)殖地區(qū)。

3.4 菌藻聯(lián)合體在水質(zhì)調(diào)控中的應用策略

通過調(diào)節(jié)菌藻的比例和環(huán)境因子可以改善菌藻聯(lián)合體水質(zhì)凈化能力。李永華[32]研究發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌和硝化細菌是菌藻體系中去除氨氮和硝氮的主要因素，月芽藻和四尾柵藻是去除硝氮的最主要因素；劉新宇[33]的研究發(fā)現(xiàn)在對蝦養(yǎng)殖的前期和中期，浮游微藻和細菌氮吸收的貢獻同等重要。Korth等[13]調(diào)查了波羅的海浮游植物與吸收對DON的吸收，細菌的DONalgal吸收貢獻率為11% ~ 61%。本研究中，藻-菌聯(lián)合體中側(cè)孢短芽孢桿菌和威氏海鏈藻對氨氮的吸收貢獻率平均分別為12.1%和87.9%，威氏海鏈藻對氨氮的吸收為主要貢獻者。側(cè)孢短芽孢桿菌氨氮吸收所占的貢獻率僅為3% ~ 25%，遠低于自然水體中菌類。這可能是因為自然水體中的菌落物種豐富，具有多種氮吸收策略；而本研究的菌藻聯(lián)合體系為單一菌種，對氨氮的吸收模式單一，缺少菌落互補作用。因此，在構(gòu)建菌藻聯(lián)合體系中，可以考慮復合菌與單藻，復合菌與復合藻等模式。本研究中溫度25 ℃、鹽度25，照度4 000 lx是菌藻聯(lián)合體氨氮吸收的最優(yōu)組合條件，鹽度是影響其吸收速率的主要因子，其次是溫度和照度；蝦塘鹽度主要來源于自然海區(qū)，而且是一個容易調(diào)控的生態(tài)因子，通過添加淡水就能改變鹽度，從而調(diào)節(jié)菌藻體系對氨氮吸收。

綜上所述，本研究所構(gòu)建的由側(cè)孢短芽孢桿菌和威氏海鏈藻組成的菌藻聯(lián)合體系對氨氮具有良好吸收效果，其適宜溫環(huán)境為25 ~ 35 ℃，鹽度為20，與海水對蝦養(yǎng)殖池塘中對蝦最適生長溫度及鹽度范圍基本一致；此外該菌藻聯(lián)合體系可耐受較高照度，在8 000 lx照度條件下仍可達到良好吸收效果。因此，對改善我國華南地區(qū)對蝦養(yǎng)殖池塘水質(zhì)具有廣闊的應用前景。

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Effects of Temperature, Salinity and Light on NH-N Absorption of Bacteria-Microalgae Consortia

WANG Pei-ming1,2,3，LI Chang-ling1,2,3，HUANG Xiang-hu1,2,3，LI Feng1,2,3，LI Yu1,3，CHEN Yi-hui1,3

（1.,,524088,2.,,518000,// 3.,524025,）

Effects of temperature, salinity, and light on NH+ 4-N uptake byandwere studied.Stable isotope tracer technology was used to measure the absorption rate of NH+ 4-N byand, which use to analyze the NH+ 4-N absorption by the combined system under different environmental factor levels.Temperature, salinity and illumination had significant effects on the NH+ 4-N absorption rate of bacteria-algae consortia (<0.05). The rate of NH+ 4-N absorption of the bacteria-algae consortia was higher from 25－35 ℃, salinity 20, and 8 000 lx. The best conditions for the absorption of NH+ 4-N by the bacteria-algae consortia were 25 ℃, salinity 25, and 4 000 lx. The microalgae played a major role in this system.The bacteria-algae consortia in our study can achieve effective absorption of excess NH+ 4-N in shrimp ponds under high temperature, high salinity, and strong light environment. Therefore, it may have a broad application prospects in improving the water quality of shrimp culture ponds in Southern China.

bacteria-algae consortia;;; ammonia nitrogen; environmental factor

X55

A

1673-9159（2020）03-0040-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.03.006

2020-01-08

深圳市大鵬新區(qū)產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項資金“活性微藻制品產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)的研究和示范”（KY20180112）

王培明（1993－），男，碩士研究生，研究方向為水域生態(tài)學。E-mail：731049393@qq.com

李長玲（1962－），女，教授，研究方向為水域生態(tài)學。E-mail：ybcl901@126.com

王培明，李長玲，黃翔鵠，等. 溫度、鹽度和照度對菌藻聯(lián)合體氨氮吸收的影響[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（3）：40-47.

（責任編輯：劉嶺）