滇楊性別相關(guān)的SRAP 分子標(biāo)記

雷 瀚 ，劉 成 ，唐軍榮 ，瞿紹宏 ，董章宏 ，李顯煌 ，李 斌 ，常曉勇，辛培堯

（1. 西南林業(yè)大學(xué) a. 西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b. 國家林業(yè)和草原局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 科技發(fā)展中心，北京 100122；3. 畢節(jié)市林業(yè)科學(xué)研究所，貴州 畢節(jié) 551700；4. 昆明市?？诹謭?，云南 昆明 650114）

滇楊Populus yunnanensisDode，是楊柳科Salicaceae 楊屬Populus青楊派樹種，別名攀枝樹、云南白楊，屬落葉喬木，雌雄異株樹種[1-2]，多分布于云南中部和北部、貴州西部和四川西南部，垂直分布海拔800 ～3 200 m。滇楊是全國乃至世界范圍內(nèi)少有的生長于低緯度高海拔地區(qū)的寶貴楊樹資源[3-4]，為西南片區(qū)中高峽谷的河谷地帶主要的栽植樹種，對于維持河流兩岸生態(tài)平衡及涵養(yǎng)水源起到重要作用。因?yàn)榫哂休^高的觀賞價(jià)值，所以常被用于園林綠化和城市綠化當(dāng)中[5]。但是，在長期的滇楊遺傳改良工作中發(fā)現(xiàn)，滇楊群體現(xiàn)存雌株稀缺，大多為雄株。而且滇楊成年雌株樹下及其附近極少發(fā)現(xiàn)幼樹。這種現(xiàn)狀導(dǎo)致滇楊遺傳基礎(chǔ)狹窄，不利于滇楊遺傳改良工作的進(jìn)行。滇楊幼苗是否存在雌雄比例嚴(yán)重不平衡，或者幼年雌株由于對環(huán)境的不適過早夭亡，從而導(dǎo)致雌株瀕危，不得而知。此外，雌雄異株植物在生產(chǎn)上的分別利用，也是近年來研究者關(guān)注的重要問題之一。例如：在園林綠化中，銀杏雄株相較雌株來說，是更好的選擇[6]。以纖維做為收獲物的大麻來講，雄株纖維質(zhì)量更好，但是雌株的成熟期比雄株更長，如果混合種植，會(huì)給生產(chǎn)帶來很大的困難[7]；而軟棗獼猴桃是一種有很大經(jīng)濟(jì)效益的果樹，雌株的經(jīng)濟(jì)效益明顯高于雄株，這就要求我們要多種雌株以此來提高經(jīng)濟(jì)效益[8]。滇楊雌雄株具有不同的特點(diǎn)，在生產(chǎn)上區(qū)別種植，才能充分發(fā)揮不同性別植株各自的生產(chǎn)潛力。然而，如同大多數(shù)雌雄異株植物一樣，滇楊直到開花前，其性別不可辨別，極大的阻礙了對其性別相關(guān)內(nèi)容的研究進(jìn)程。因此，急需找到一種能快速且準(zhǔn)確的方法來鑒別早期滇楊性別。

目前，采用傳統(tǒng)方法針對成年植物個(gè)體進(jìn)行性別鑒定的方法有外部形態(tài)、生理代謝、同工酶、特異蛋白的差異等[9-12]。相關(guān)研究為雌雄異株植物的早期選擇提供了一定的理論基礎(chǔ)與實(shí)踐指導(dǎo)。但是，相關(guān)方法大多缺乏在植物苗期的性別鑒定，且由于鑒定環(huán)境的不同，會(huì)出現(xiàn)穩(wěn)定性和重復(fù)性方面的局限性。近年來，分子標(biāo)記技術(shù)廣泛地應(yīng)用于鑒別雌雄異株植物的研究當(dāng)中。在番木瓜[12]、蛇皮果[13]、銀杏[14]、蘆筍[15]、羅漢果[16]、山楊[17]等植物中都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與性別相關(guān)的特異性條帶。其中，SRAP 標(biāo)記由于多態(tài)性強(qiáng)、標(biāo)記分布均勻、重復(fù)性強(qiáng)、引物合成費(fèi)用較低的特點(diǎn)，廣泛地應(yīng)用于遺傳多樣性分析、物種鑒定以及遺傳圖譜構(gòu)建等方面[18-19]，尤其是在植物的性別鑒定中更加受到研究者的青睞。吳文珊等[20]首次利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于植物性別鑒定的研究當(dāng)中，在薛荔Ficus pumilaLinn 雌株中擴(kuò)增出1 條多態(tài)性的片段，能夠鑒定薛荔苗期的性別。王延禹等[21]利用SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)，在高山紅景天雌雄株中發(fā)掘特異性的SRAP 標(biāo)記，在228 個(gè)引物組合中找到了1 個(gè)引物組合可以在雌株中擴(kuò)增出特異性的片段。鄧傳良等[22]在256 對SRAP 引物組合中篩選出50 對可以穩(wěn)定擴(kuò)增出特異性條帶的引物組合，共擴(kuò)增出671 條帶，多態(tài)率36.81%，對這一研究中獲得的性別相關(guān)的特異性條帶，可以進(jìn)行克隆及基因測序，對于葎草Humulus scandens(Lour.) Merr性染色體的演化機(jī)制有著很大的幫助。鄭翠芳[23]利用SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)鑒別了愛玉子Ficus pumilaLinn. var.awkeotsang(Makino) Corner雌雄株的性別。而有關(guān)滇楊SRAP 分子標(biāo)記鑒定性別的文獻(xiàn)國內(nèi)外未見報(bào)道。

本研究以已知性別的滇楊雌雄株為材料，利用SRAP 標(biāo)記技術(shù)，尋找與滇楊性別相關(guān)的分子標(biāo)記，并將所獲得的SRAP 標(biāo)記聯(lián)合運(yùn)用，對未知性別滇楊幼苗進(jìn)行性別鑒定，以檢驗(yàn)鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度。研究結(jié)果有望對滇楊雌株瀕危機(jī)制的進(jìn)一步完善和保護(hù)滇楊這一物種的完整性提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)，同時(shí)也可以為滇楊遺傳改良及合理利用提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)材料共計(jì)90 份，60 份已知性別滇楊植株，分別采自云南省昆明市、香格里拉市、大理市、祿勸縣（表1）。采樣時(shí)，選取無病蟲害的當(dāng)年生滇楊枝條，將枝條采回后水培。待枝條長出新鮮葉片后，直接提取新鮮葉片DNA。雄株采集30 個(gè)樣品，記作X1 ～X30，雌株采取30 個(gè)樣品，記作C1 ～C30。30 株未知性別滇楊幼苗隨機(jī)采自云南大理市。

表1 滇楊個(gè)體地理位置信息Table 1 individual geographic location information of Populus yunnanensis Dode

1.2 方 法

1.2.1 DNA 的提取及檢測

采用Ezup 柱式植物基因組DNA 抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取其基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠對DNA 進(jìn)行電泳檢測質(zhì)量，用超微量紫外分光光度計(jì)測量其濃度。最后稀釋至50 ng/μL 保存在-20 ℃的冰箱中，備用。

1.2.2 SRAP-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系與程序

滇楊PCR 反應(yīng)體系：總體積為25 μL，其中Forward Primers（ 正向引物）、Reverse Primers（反向引物）、模版 DNA 各為 1 μL，9.5 μL 的ddH2O，12.5 μL 的 2×Taq Master Mix。其反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，37 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，5 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ～54 ℃（因引物而異）退火1 min，72 ℃延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 8 min，于4 ℃保存。

1.2.3 引物篩選

查閱有關(guān)植物進(jìn)行性別鑒定的相關(guān)文獻(xiàn)，挑選出符合條件的20 對SRAP[6,22,24-25]標(biāo)記（表2）（上海生工生物工程有限公司合成），采用1.2.2 中反應(yīng)體系和程序進(jìn)行SRAP 引物的初篩和復(fù)篩。

初篩時(shí)，選取滇楊雌雄植株各10 株（其中，香格里拉市雌雄各4 株，其他地點(diǎn)雌雄各2 株），以其DNA 作為模版DNA，以PCR 擴(kuò)增后在1%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測。選擇可以擴(kuò)增出條帶并且清晰明亮的SRAP引物作為復(fù)篩引物。復(fù)篩時(shí)，以上述60 株已知性別滇楊DNA 為模板，以PCR擴(kuò)增后，在8%的變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行引物的復(fù)篩，找到可在所有雌雄株中擴(kuò)增出特異性條帶的SRAP 引物，即滇楊性別相關(guān)的SRAP 標(biāo)記。

1.2.4 滇楊苗期鑒定

利用上述所篩選的SRAP 標(biāo)記對30 株滇楊幼苗性別進(jìn)行鑒定，比對鑒定結(jié)果的一致性程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇楊DNA 提取

DNA 提取以后，使用0.8%的瓊脂糖凝膠可以直觀地顯示DNA 提取結(jié)果，提取質(zhì)量優(yōu)質(zhì)的DNA 在凝膠成像系統(tǒng)下顯示的圖像是明亮、無拖帶的亮帶（圖1）。

2.2 SRAP 引物的初篩

由20 對SRAP 引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步結(jié)果檢測，結(jié)果顯示：在20對引物中，有3 對引物能夠在PCR 中成功的擴(kuò)增出產(chǎn)物。3 對引物分別是Me1、Me10 和Me12（圖2 ～ 3）。

2.3 SRAP 引物的復(fù)篩

將瓊脂糖檢測篩選出來的3 對引物使用變性的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示，引物Me1 在60 株滇楊雌雄樣品間擴(kuò)增出明顯的差異條帶，根據(jù)DNA Maker 所提供的信息，這條特異性的條帶均為雄性滇楊所特有，大小在1 600 bp左右。部分結(jié)果見圖4。

此外，引物Me12 未在所有雌雄株間擴(kuò)增出差異條帶。最終在20 對SRAP 引物中找到2 對引物，可以對60 株已知性別的滇楊進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，分別是 ME1、ME10。

表2 滇楊20 對SAPR 引物序列信息Table 2 Sequence information of the 20SRAP primers for Populus yunnanensis Dode

圖1 部分DNA 質(zhì)量檢測Fig. 1 Partial image of DNA quality detection

2.4 未知性別苗期滇楊鑒定結(jié)果

用篩選到的2 對SRAP 分子標(biāo)記對檢測了30株滇楊幼苗的DNA，結(jié)果表明，所獲得的2 對SRAP 標(biāo)記對未知性別滇楊的性別鑒定結(jié)果完全一致，且雌雄比例均為2:13（圖6 ～7）。初步認(rèn)為，所獲得的引物可以對未知性別的苗期滇楊進(jìn)行早期性別鑒定。

同樣，引物Me10 也在所有雄性樣品中出現(xiàn)特異條帶，約在710 bp 左右。部分結(jié)果如圖5 所示。

圖2 SRAP 引物Me1 和Me10 瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果Fig. 2 Agarose gel test result of SRAP primer Me1 and Me10

圖3 SRAP 引物Me12 瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果Fig. 3 Agarose gel test result of SRAP primer Me12

圖4 Me1 與部分樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的變性聚丙烯酰胺凝膠Fig. 4 Modified polyacrylamide gel image of partial amplification product on Me1

圖5 Me10 部分?jǐn)U增產(chǎn)物的變性聚丙烯酰胺凝膠圖像Fig. 5 Modified polyacrylamide gel image of partial amplification product on Me10

圖6 Me1 檢測未知性別滇楊結(jié)果圖像Fig. 6 Result image of unknown gender detection of Populus yunnanensis Dode on Me1

圖7 Me10 檢測未知性別滇楊結(jié)果Fig. 7 Result of unknown gender detection of Populus yunnanensis Dode on Me10

3 討 論

利用分子標(biāo)記對植物進(jìn)行性別鑒定，一直是近年來的研究熱點(diǎn)問題之一。

王洪梅等[17]對96 個(gè)山楊個(gè)體（雌雄各48 個(gè)）在26 對SSR 引物中進(jìn)行特異性的引物篩選，最終引物BPCA90 可以成功鑒別山楊的性別，進(jìn)行PCR 反應(yīng)如果檢測到長度為550 bp 的單一片段則為雄性，反之若未出現(xiàn)，則為雌性。侯萬偉等[26]利用RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)篩選與毛白楊性別相關(guān)的分子標(biāo)記，在88 條隨機(jī)引物中找到1 條引物S60 可以在雄株中擴(kuò)增出一條1 800 bp 左右的特異性條帶，表明了毛白楊雌雄株之間存在基因水平上面的差異。有國外學(xué)者用來自多個(gè)國家的68 個(gè)白楊P.tomentosa個(gè)體（37 個(gè)雄株，31 個(gè)雌株）作為材料，選擇其中34 個(gè)白楊個(gè)體進(jìn)行混合測序，發(fā)現(xiàn)了楊樹同源物具有雄性特異性，通過PCR 和RT-PCR 的分析，找到了TOZ19 這個(gè)特異性的標(biāo)記，這個(gè)特異性的標(biāo)記可以在山楊未開花之前確定山楊幼苗的性別[27]。Geraldes 等[28]研究了52 株黑楊P. nigra和 34 株鉆天楊P. nigravar. italica(Moench)Koehne 已知性別的植株，通過SNP 分子標(biāo)記方法，發(fā)現(xiàn)了其中650 個(gè)SNP 的位點(diǎn)和它們的性別具有關(guān)系。相關(guān)研究人員通過RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合BSA 技術(shù)，確定了與雌雄異株毛白楊的性別決定相關(guān)的標(biāo)記[29]。本研究所用SRAP 分子標(biāo)記引物分別參考了對植物進(jìn)行性別鑒定的相關(guān)文獻(xiàn)[6,22,24-25]，從中篩選到20 對SRAP 引物。經(jīng)過初篩和復(fù)篩，最終篩選到2 對可以與滇楊雄株擴(kuò)增出特異性片段的引物（Me1 和Me10）。研究表明，利用Me1 這1 對引物對苦瓜雌雄進(jìn)行性別鑒定，可在雄株中可以擴(kuò)增出一條特異性片段[25]；而利用Me10 這1 對引物組合，同樣可在葎草雄株中可以擴(kuò)增出4 條雄性特異性條帶[22]。相同SRAP 標(biāo)記引物可在不同植物間找到與性別相關(guān)的差異條帶，這表明了與植物性別相關(guān)的SRAP 引物在不同植物當(dāng)中存在著一定的通用性。可見，SRAP 標(biāo)記為植物的性別早期鑒定提供了一種可靠、經(jīng)濟(jì)又便捷的新途徑。

通常情況下，自然界中植物的性別比例一般為雌:雄=1:1。然而，受植物自身內(nèi)外環(huán)境的影響，其性別往往表現(xiàn)出一定的偏倚，有時(shí)這種偏倚相當(dāng)明顯，甚至導(dǎo)致某一性別植物瀕臨滅絕。Grant等[30]通過研究發(fā)現(xiàn)在科羅拉多州的美洲山楊的雌雄比例會(huì)隨著海拔的變化而發(fā)生變化，隨著海拔的升高，雌性個(gè)體的數(shù)量會(huì)減少。Zhang 等[31]對青楊P. cathayanaRehd 幼苗進(jìn)行低溫處理，發(fā)現(xiàn)低溫脅迫會(huì)引起葉綠體的降解，雌株中葉綠體降解的更加嚴(yán)重。此外，溫度的降低也會(huì)引起雌株中POD 活性的降低，導(dǎo)致雌株存活率降低。對美國猶他州5 個(gè)屬的5 種雌雄異株植物調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，在干旱的地方，雄株存活率更高，而在當(dāng)?shù)氐臐駶櫟貐^(qū)雌株更多。一般來說，在濕潤及養(yǎng)分充足的地方，雌株較多，而在干旱、生存環(huán)境差的條件下，雄株往往比雌株具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力[32]。滇楊現(xiàn)有群體大多數(shù)以雄株組成，罕見雌株。有可能由于雌株對外界環(huán)境的變化反應(yīng)比較敏感，致使其在生長過程中，逐漸夭亡。這一觀點(diǎn)目前也只是一種推測。本研究篩選出的2 對SRAP 引物都可以在滇楊雄株上產(chǎn)生特異標(biāo)記。在后期試驗(yàn)的檢測過程中，還利用已篩選獲得的與滇楊性別相關(guān)的SSR 標(biāo)記引物，對30 株幼苗進(jìn)行了鑒定，結(jié)果與SRAP 引物鑒定結(jié)果完全一致?？梢?，本研究所得的2 對SRAP 標(biāo)記對滇楊性別進(jìn)行鑒定是可行且準(zhǔn)確的。另外，30 株未知性別滇楊幼苗的雌雄株比例的鑒定結(jié)果均為2:13，表現(xiàn)出雌株明顯少于雄株。

由于滇楊雌株的稀缺，滇楊幼苗很難找到。因此，本研究僅對30 株滇楊幼苗進(jìn)行了早期鑒定。此外，2 種鑒定結(jié)果均表明雌株明顯少于雄株，這一現(xiàn)象是否與滇楊雌株瀕危的原因有關(guān)，有待更多試驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果的進(jìn)一步闡明。

4 結(jié) 論

利用SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)，以60 株已知性別滇楊雌雄株為材料，在20 對SRAP 引物中篩選出2 對引物具有雄性特異性條帶。其中，1 對引物可在1 600 bp 處擴(kuò)增出條帶，另1 對擴(kuò)增條帶則在710 bp 處。利用這2 對雄性相關(guān)的SRAP 標(biāo)記引物，對30 株滇楊幼苗進(jìn)行性別鑒定和結(jié)果一致性比較發(fā)現(xiàn)，2 對引物均能對30 株幼苗的性別進(jìn)行鑒定，且鑒定結(jié)果均為雌:雄=2:13，鑒定結(jié)果完全一致。可以認(rèn)為，試驗(yàn)所篩選出的2 對SRAP 分子標(biāo)記引物，可以準(zhǔn)確對滇楊早期性別進(jìn)行鑒定。研究結(jié)果可為滇楊不同性別植株的分別利用提供早期選擇，也可為雌株瀕危的原因提供理論參考。