不同品種黃麻葉多糖的理化特征及抗氧化活性研究

馮湘沅，成莉鳳，謝純良，楊 琦，劉志遠(yuǎn)，鄭 科，段盛文，彭源德

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所，長(zhǎng)沙 410205

黃麻屬于一年生草本椴樹(shù)科植物，原產(chǎn)于東南亞，約有100多個(gè)品種[1]，其葉的形狀為卵圓狀披針形或披針形，含有黃麻甙、β-谷甾醇、β-谷甾醇D-葡萄糖甙、黃麻酮及單糖類(lèi)組分等化學(xué)成分。據(jù)《本草綱目拾遺》、《陸川本草》等記載：具有理氣止血、排膿生肌等功能[2]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者不斷地深入研究黃麻品種、營(yíng)養(yǎng)等，Li等[3]進(jìn)行了菜用黃麻嫩梢營(yíng)養(yǎng)與分析研究，Lin等[4]進(jìn)行了菜用黃麻新品種福農(nóng)1號(hào)的選育研究；Phuwapraisirisan等[5]研究了長(zhǎng)蒴黃麻苷A、B的降血糖作用，Yamazaki等[6]研究了長(zhǎng)蒴黃麻葉水提物的高粘性水膠體的成分等，但是，針對(duì)不同品種黃麻葉多糖的結(jié)構(gòu)、分子量以及抗氧化活性等系統(tǒng)研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

人體在生命活動(dòng)代謝過(guò)程中會(huì)不斷地產(chǎn)生自由基，而過(guò)量自由基與許多疾病的發(fā)生有著密不可分的聯(lián)系，如：羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基等異常過(guò)多能破壞細(xì)胞膜，干擾細(xì)胞的新陳代謝；加快肌體衰老，引發(fā)心腦血管疾??；侵蝕機(jī)體組織，導(dǎo)致各種非菌性炎癥等，對(duì)人體健康造成嚴(yán)重的影響[7,8]。多糖具有抗炎、抗衰老、抗凝血、抗?jié)?、抗腫瘤及促進(jìn)免疫等功效[9]。近些年來(lái)，隨著人們對(duì)身體健康保護(hù)意識(shí)逐漸增強(qiáng)，多糖作為保健品的主要成分備受人們青睞。

由于多糖具有大量的羥基，遇水容易溶出，而乙醇又能使多糖沉淀，實(shí)驗(yàn)安全且易操作，故本文采用熱水浸提-醇沉法提取不同品種黃麻葉中多糖，并針對(duì)多糖的含量、結(jié)構(gòu)、分子量、單糖組成及抗氧化活性進(jìn)行比較分析，旨在為黃麻的種植及功能性保健產(chǎn)品的綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：采摘于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所長(zhǎng)沙實(shí)驗(yàn)基地種植的不同品種黃麻葉(苗后天數(shù)均為28天)，分別為：1.圓果種黃麻葉(品系名稱(chēng)：英德深紅皮，特征為紅莖、綠葉、葉脈較稀、無(wú)光澤)；2.長(zhǎng)果種黃麻葉(品系名稱(chēng)：中黃麻4號(hào)，特征為綠莖、綠葉、葉脈較密、有光澤)。

1.2 主要儀器與試劑

儀器：高效液相色譜儀(Dionex Ultimate 3000)，色譜柱(Xtimate C184.6×200 mm，5 μm)，粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司，F(xiàn)Z102)，恒溫振蕩器(金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠，SHZ-82型)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)分析儀(Thermo Fisher，multiskan Go型)，凝膠滲透色譜儀(Agilent 1100，Agilent Technologies，USA)，Nicolet iS 10光譜儀(Thermo Fisher Scientific，USA)，離心機(jī)(SiGmA，3k15型)。

試劑：無(wú)水乙醇、FeSO4、H2O2、Tris、二苯代苦味酰肼自由基、水楊酸、鄰苯三酚、L-抗壞血酸(VC)、三氯甲烷(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，分析純)；甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、葡萄糖(美國(guó)Sigma公司)。

1.3 多糖樣品的制備[10]

將黃麻葉洗凈，50 ℃烘干，粉碎，過(guò)45目篩(平均粒徑為0.35±0.02 mm)；精確稱(chēng)取5.0 g黃麻葉粉末于500 mL三角瓶中，加150 mL超純水，于60 ℃、150 rpm恒溫水浴振蕩器加熱振蕩5 h后，冷卻至室溫；再移入離心管于8 000 rpm離心10 min，收集上清液，即得提取液。

取100 mL上清液加入400 mL無(wú)水乙醇，攪拌，靜置，棄溶液，收集黃色絮狀物，干燥得多糖固形物。

樣品：精確稱(chēng)取一定量的多糖固形物分別配制成所需不同濃度溶液。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 多糖含量測(cè)定

多糖含量參照Yu等[11]采用的硫酸-苯酚法測(cè)定進(jìn)行。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：精確稱(chēng)取100 mg葡萄糖(105 ℃干燥恒重)于100 mL容量瓶中溶解，定容至刻度，搖勻，即得濃度為1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，適度稀釋不同濃度溶液用作標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。

提取液多糖含量的測(cè)定方法同上述標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定。

多糖濃度(mg/mL)按葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程進(jìn)行計(jì)算；多糖質(zhì)量(mg)=多糖濃度×稀釋倍數(shù)×總體積；多糖含量(mg/g)=多糖質(zhì)量/粉末質(zhì)量。

1.4.2 FT-IR光譜分析

取1mg樣品與100 mg KBr(干燥)混合，放入瑪瑙研缽中研磨10 min后，壓入盤(pán)中，用Nicolet iS 10光譜儀在4 000～400 cm-1范圍進(jìn)行掃描。

1.4.3 單糖組成

1.4.3.1 HPLC檢測(cè)條件

1.4.3.2 衍生方法

標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制：精密稱(chēng)取適量甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖、葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖對(duì)照品，加水溶解稀釋至每1 mL中各含50 μg的混合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照溶液。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液衍生步驟：精確吸取250 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液到5 mL EP管中，加入250 μL NaOH(0.6 mol/L)，500 μL PMP(0.4 mol/L)-甲醇，70 ℃反應(yīng)1 h，冷卻10 min；加入500 μL HCl(0.3 mol/L)中和，再加入1 mL三氯甲烷漩渦1 min，3 000 rpm離心10 min，收集上清(萃取重復(fù)3次)，上清液用于HPLC分析。

樣品水解：精確稱(chēng)取適量樣品至5 mL安培瓶中，加入2.0 mL TFA(2 mol/L)于5 mL安瓿中，封管，110 ℃酸解8 h，取出揮干TFA，加2.0 mL水復(fù)溶。

樣品溶液衍生：參照標(biāo)準(zhǔn)品溶液衍生，將樣品溶液衍生后稀釋10倍用于HPLC分析。

1.4.4 多糖分子量的測(cè)定

使用PL aquagel-OH Mixed 8 mm凝膠滲透色譜儀測(cè)定多糖分子量。

隨著我國(guó)風(fēng)電等間歇性電源的大規(guī)模發(fā)展，電力系統(tǒng)調(diào)峰需求將逐漸增大。天然氣發(fā)電機(jī)組啟動(dòng)迅速，調(diào)節(jié)方便，具有較強(qiáng)的調(diào)峰能力，對(duì)電力系統(tǒng)的安全穩(wěn)定運(yùn)行可以起到重要的保障作用。

1.5 抗氧化活性測(cè)定

1.5.1 自由基清除率的測(cè)定

羥基自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基的清除率均分別參照Huang等[12]測(cè)定中采用的水楊酸法、二苯代苦味酰肼自由基、鄰苯三酚法法進(jìn)行，同時(shí)以VC(強(qiáng)抗氧化劑)作為對(duì)照。

1.5.2 EC50值

EC50值是指自由基清除率為50%時(shí)所需樣品的濃度，該值根據(jù)回歸方程計(jì)算得出。EC50值越低，抗氧化活性越高[13]。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均取平行3次測(cè)量值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，同時(shí)采用Excel軟件作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖的理化特征分析

2.1.1 多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法對(duì)不同濃度葡萄糖溶液測(cè)定(圖1)，以濃度(x)為橫坐標(biāo)和吸光度(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=11.511x+0.033 3，R2=0.996 6。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出的圓果種黃麻葉、長(zhǎng)果種黃麻葉提取液中多糖含量分別為80.92、60.77 mg/g，圓果種黃麻葉多糖含量高于長(zhǎng)果種黃麻葉多糖。

2.1.2 FT-IR光譜分析

如圖2所示，圓果種黃麻葉多糖、長(zhǎng)果種黃麻葉多糖分別在3 283 cm-1和3 264 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰是屬于多糖分子內(nèi)或分子間-OH的拉伸振動(dòng)特征，這主要是由多糖苷的延伸振動(dòng)引起的；兩者同時(shí)在1 403 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰表示為C-O伸縮振動(dòng)；分別在1 036 cm-1和1 026 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰，表示是由消旋引起的吡喃糖環(huán)的拉伸振動(dòng)[14]。這些吸收峰說(shuō)明兩種黃麻葉多糖通過(guò)FT-IR光譜在4 000～400 cm-1下測(cè)定具有非常相似的吸收帶，且含有葡聚糖的典型紅外光譜信號(hào)，均屬于多糖類(lèi)物質(zhì)的典型特征。

圖2 不同品種黃麻葉多糖的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of polysaccharides from jute leaves of different varieties 注：A.圓果種黃麻葉多糖；B.長(zhǎng)果種黃麻葉多糖。Note:A.Polysaccharides of C.capsularis;B.Polysaccharides of C.olitorius.

2.1.3 分子量測(cè)定

經(jīng)PL aquagel-OH Mixed 8 mm凝膠滲透色譜分析儀檢測(cè)獲得不同品種黃麻葉多糖GPC色譜圖見(jiàn)圖3，圓果種黃麻葉多糖出峰保留時(shí)間分別在9.791、12.842、15.618 min時(shí)，峰面積占比分別為1.88%、1.84%、96.28%；長(zhǎng)果種黃麻葉多糖出峰保留時(shí)間分別在9.784、12.823、15.650 min時(shí)，峰面積占比分別為3.55%、4.46%、91.99%，根據(jù)保留時(shí)間、峰面積換算，圓果種黃麻葉多糖、長(zhǎng)果種黃麻葉多糖的平均摩爾分子量分別為59.87 kDa和102.54 kDa。結(jié)果表明，兩種不同黃麻葉多糖樣品的出峰保留時(shí)間、峰面積占比存在著差異，說(shuō)明分子量有差別。

圖3 不同品種黃麻葉多糖的GPC色譜圖Fig.3 GPC chromatogram of polysaccharides from jute leaves of different varieties注：A.圓果種黃麻葉多糖；B.長(zhǎng)果種黃麻葉多糖。Note:A.Polysaccharides of C.capsularis;B.Polysaccharides of C.olitorius.

2.1.4 單糖組成分析

樣品經(jīng)水解衍生、HPLC法分析檢測(cè)，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品獲得水解產(chǎn)物的單糖組成色譜圖以及數(shù)據(jù)由圖4、表1可知：除氨基半乳糖外，兩種樣品多糖均含有甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖、巖藻糖等11種單糖成分。其中圓果種黃麻葉多糖中含量最多的為半乳糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27.06%)，其次甘露糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.48%)，但氨基半乳糖含量未檢測(cè)到；而長(zhǎng)果種黃麻葉多糖中含量最高的為葡萄糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.55%)，其次半乳糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.24%)，但出現(xiàn)有氨基半乳糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%)，含量最低；圓果種黃麻葉多糖中葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的含量分別較長(zhǎng)果種黃麻葉多糖高6.47%和0.50%。

圖4 不同品種黃麻葉多糖的單糖組成色譜圖Fig.4 Chromatogram of monosaccharide compositions of polysaccharides from jute leaves of different varieties注：A.圓果種黃麻葉多糖；B.長(zhǎng)果種黃麻葉多糖；S.標(biāo)準(zhǔn)品：1.甘露糖；2.核糖；3.鼠李糖；4.葡萄糖醛酸；5.半乳糖醛酸；6.氨基葡萄糖；7.葡萄糖；8.氨基半乳糖；9.半乳糖；10.木糖；11.阿拉伯糖；12.巖藻糖。Note:A.Polysaccharides of C.capsularis;B.Polysaccharides of C.olitorius;S.Standards:1.Mannose;2.Ribose;3.Rhamnose;4.Glucuronic acid;5.Galacturonic acid;6.Glucosamine;7.Glucose;8.Aminogalactose;9.Galactose;10.Xylose;11.Arabinose;12.Fucose.

表1 不同品種黃麻葉多糖的單糖組成測(cè)定

2.2 抗氧化活性測(cè)定

2.2.1 清除羥基自由基能力

由圖5可知，圓果種黃麻葉多糖、長(zhǎng)果種黃麻葉多糖對(duì)羥基自由基清除率均隨濃度的增加而增大，但圓果種黃麻葉多糖的羥基自由基清除率均高于長(zhǎng)果種黃麻葉多糖。如：當(dāng)多糖濃度為1 mg/mL時(shí)，圓果種黃麻葉多糖、長(zhǎng)果種黃麻葉多糖對(duì)羥基自由基清除率分別為46.23%、41.81%，圓果種黃麻葉多糖的清除率較長(zhǎng)果種黃麻葉多糖提高4.42%。

EC50值計(jì)算結(jié)果由表2可看出，圓果種黃麻葉多糖對(duì)羥基自由基清除能力的EC50值(1.14 mg/mL)小于長(zhǎng)果種黃麻葉多糖的EC50值(1.32 mg/mL)。從多糖濃度在0.2～1.4 mg/mL范圍來(lái)看，圓果種黃麻葉多糖對(duì)羥基自由基清除能力稍強(qiáng)于長(zhǎng)果種黃麻葉多糖，但兩者多糖其清除能力均較VC(強(qiáng)抗氧化劑)弱。

圖5 不同品種黃麻葉多糖和VC對(duì)羥基自由基清除能力Fig.5 The scavenging ability of polysaccharides from jute leaves of different varieties and VC on hydroxyl free radicals注：A.圓果種黃麻葉多糖；B.長(zhǎng)果種黃麻葉多糖。Note:A.Polysaccharides of C.capsularis;B.Polysaccharides of C.olitorius.

2.2.2 清除DPPH自由基能力

從圖6可得，圓果種黃麻葉多糖、長(zhǎng)果種黃麻葉多糖和VC對(duì)DPPH自由基清除率分別由0.2 mg/mL時(shí)36.18%、27.2%、88.58%增加到1mg/mL時(shí)67.30%、61.11%、93.25%，其清除率均與濃度呈正相關(guān)。從整體變化規(guī)律來(lái)看，其清除率都呈上升趨勢(shì)，但VC其清除率最高，圓果種黃麻葉多糖次之，長(zhǎng)果種黃麻葉多糖最低。

EC50值結(jié)果(表2)表明，圓果種黃麻葉多糖對(duì)DPPH自由基清除能力(EC50值0.43 mg/mL)較長(zhǎng)果種黃麻葉多糖(EC50值0.69 mg/mL)強(qiáng)。

2.2.3 清除超氧陰離子自由基能力

由圖7可看出，圓果種黃麻葉多糖、長(zhǎng)果種黃麻葉多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除率均隨濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，但VC其清除率增大趨勢(shì)較緩。當(dāng)濃度為1mg/mL時(shí)，圓果種黃麻葉多糖、長(zhǎng)果種黃麻葉多糖和VC對(duì)其清除率分別為75.02%、66.81%、90.11%。

圖6 不同品種黃麻葉多糖和VC對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.6 The scavenging ability of polysaccharides from jute leaves of different varieties and VC on DPPH free radicals 注：A.圓果種黃麻葉多糖；B.長(zhǎng)果種黃麻葉多糖。Note:A.Polysaccharides of C.capsularis;B.Polysaccharides of C.olitorius.

EC50值(表2)結(jié)果顯示，圓果種黃麻葉多糖、長(zhǎng)果種黃麻葉多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的EC50值分別為0.37、0.57 mg/mL，結(jié)果表明，圓果種黃麻葉多糖對(duì)超氧陰離子自由基清除能力明顯優(yōu)于長(zhǎng)果種黃麻葉多糖，但與VC對(duì)照相比，兩者多糖對(duì)其清除能力均較弱。

3 討論與結(jié)論

本研究是在固液比1∶30、溫度60 ℃、轉(zhuǎn)速150 rpm恒溫水浴振蕩器加熱振蕩5 h條件下，利用醇沉法對(duì)不同品種黃麻葉(苗后天數(shù)均為28天)提取多糖，采用硫酸-苯酚法測(cè)得圓果種黃麻葉多糖、長(zhǎng)果種黃麻葉多糖的含量分別為80.92、60.77 mg/g；凝膠滲透色譜檢測(cè)相應(yīng)平均摩爾分子量分別為59.87、102.54 kDa；紅外光譜顯示圓果種黃麻葉和長(zhǎng)果種黃麻葉的多糖結(jié)構(gòu)出現(xiàn)有極其相似的吸收峰，均具有多糖類(lèi)物質(zhì)的典型結(jié)構(gòu)；水解衍生-HPLC法測(cè)得圓果種黃麻葉多糖和長(zhǎng)果種黃麻葉多糖均含有半乳糖、甘露糖、核糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸等11種單糖，其中圓果種黃麻葉多糖是以半乳糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27.06%)、甘露糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.48%)為主要單糖成分；長(zhǎng)果種黃麻葉多糖則是以葡萄糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.55%)、半乳糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.24%)為主要單糖成分，但圓果種黃麻葉多糖中葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的含量分別較長(zhǎng)果種黃麻葉多糖高6.47%和0.50%。通過(guò)結(jié)果表明，圓果種黃麻葉多糖的含量高于長(zhǎng)果種黃麻葉多糖，兩種多糖理化特征存在著差異，這些差異的產(chǎn)生可能主要與原料品種有關(guān)，說(shuō)明不同品種黃麻葉中含有不同的多糖類(lèi)物質(zhì)。

多糖作為提取物，許多研究均表明多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性，如：Bi等[15]、Jiao等[16]及Ni等[17]分別研究報(bào)道了真菌多糖、甜茶葉多糖及黃芪多糖的抗氧化活性，在質(zhì)量濃度1mg/mL時(shí)，其相應(yīng)DPPH自由基清除率為55%、63.7%和72.9%。而本研究結(jié)果顯示，圓果種黃麻葉多糖和長(zhǎng)果種黃麻葉多糖在濃度1mg/mL時(shí)，其DPPH自由基清除率分別為67.30%和61.11%，與文獻(xiàn)[15,17]相比，圓果種葉多糖的DPPH自由基清除能力高于真菌多糖和甜茶葉多糖，但較黃芪多糖低。本研究中的抗氧化活性結(jié)果顯示，圓果種黃麻葉多糖、長(zhǎng)果種黃麻葉多糖均能對(duì)羥基自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基有著不同程度的清除效果，且清除率與多糖濃度劑量呈正相關(guān)，但圓果種黃麻葉多糖對(duì)自由基清除能力的EC50值均低于長(zhǎng)果種黃麻葉多糖。表明兩種黃麻葉多糖具有一定的抗氧化能力，是有待于開(kāi)發(fā)的抗氧化活性物質(zhì)。

在本研究條件下，圓果種黃麻葉多糖抗氧化活性較長(zhǎng)果種黃麻葉多糖強(qiáng)，可能與多糖的糖醛酸類(lèi)單糖含量高低以及分子量大小有關(guān)，這一結(jié)論與文獻(xiàn)[18,20]報(bào)道相吻合，可為黃麻葉多糖的深入研究和資源開(kāi)發(fā)提供一定的參考，但針對(duì)有效成分的最佳提取方法與種植最適采摘時(shí)間的關(guān)系等有待于進(jìn)一步探討。