Leptin過表達(dá)對豬前脂肪細(xì)胞脂滴形成的研究

胡瀕月 胡楊 成文敏 趙素梅 趙紅業(yè)，4 魏紅江

（1. 云南省動物基因編輯與體細(xì)胞克隆技術(shù)重點實驗室，昆明 650201；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；4. 云南生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室，昆明 650201）

在全球范圍內(nèi)，肥胖癥患者呈逐年上升的趨勢，已嚴(yán)重危害著人類健康。肥胖是世界范圍內(nèi)共同關(guān)注的社會性健康問題，也是世界各國致力解決的重大難點問題［1］。肥胖發(fā)生的直接原因是由于脂肪組織的過度沉積造成的。人和動物體內(nèi)脂肪的沉積過程類似，一方面是脂肪組織細(xì)胞內(nèi)脂肪不斷合成、蓄積的過程；另一方面是脂肪組織中脂肪細(xì)胞的不斷分化過程，這兩個過程的協(xié)調(diào)統(tǒng)一是脂肪組織形成的基礎(chǔ)，而脂肪組織的主要功能是為機體蓄積能量，但脂肪組織的過度增殖和脂肪的過度蓄積可導(dǎo)致人類肥胖和體脂的過度沉積［2-3］。當(dāng)前，關(guān)于脂肪組織的沉積代謝規(guī)律的研究多使用3T3-L1前脂肪細(xì)胞系、大鼠原代脂肪細(xì)胞及肥胖鼠模型的原代脂肪細(xì)胞或脂肪組織、豬血管基質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞為材料［4-5］。豬可作為理想的人類疾病動物模型，但迄今為止，以轉(zhuǎn)入目的基因的方式構(gòu)建人類肥胖動物疾病模型來研究脂肪組織或細(xì)胞的沉積代謝規(guī)律及其相關(guān)功能基因的調(diào)控機制研究還未見報道。

Leptin又名瘦素、瘦蛋白、抗肥胖因子、苗條素，是由肥胖基因編碼、脂肪細(xì)胞分泌的一種激素樣蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)動物攝食行為、增加能量消耗、抑制脂肪合成、促進(jìn)脂肪分解和降低采食量的作用［5］，并能維持正常的脂類代謝和機體的能量平衡［6］，其作為一種脂肪細(xì)胞分泌的激素蛋白，在維持脂肪組織質(zhì)量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。有大量研究證實，Leptin可提高脂肪細(xì)胞的脂肪分解［7-9］。也有人報道，Leptin可通過下丘腦利用組織特異性方式調(diào)節(jié)外周組織中葡萄糖和脂質(zhì)代謝［10］。體內(nèi)Leptin的濃度與體脂儲存的多少有關(guān)，且影響著脂肪細(xì)胞的大?。?1-13］。Leptin受體蛋白可在包括脂肪細(xì)胞在內(nèi)的多種組織中大量表達(dá)，表明Leptin可能通過自分泌的受體信號來調(diào)節(jié)脂肪組織代謝活動［14］。在體外，Leptin可降低組織中脂肪細(xì)胞的生成，增加甘油三酯水解，促進(jìn)脂肪酸的氧化［15］。Leptin表達(dá)水平的增加能促進(jìn)棕色脂肪組織［16］和白色脂肪組織［7］的交感神經(jīng)傳出脂肪酸的分解信號，從而可促進(jìn)脂肪分解［8-9］。Shimabukuro等［17］的研究報道，在脂肪組織和成熟的脂肪細(xì)胞中，Leptin可促進(jìn)甘油三酯分解。也有報道，脂肪細(xì)胞內(nèi)Leptin基因的表達(dá)量與細(xì)胞內(nèi)脂類的含量和脂肪細(xì)胞的大小密切相關(guān)［18］。攜帶有低水平Leptin表達(dá)的ob/ob鼠盡管其血漿瘦蛋白含量可維持在正常水平，但仍可導(dǎo)致ob/ob鼠產(chǎn)生肥胖［19］，這表明降低脂肪組織內(nèi)的Leptin基因表達(dá)可導(dǎo)致動物發(fā)生肥胖癥?；谇叭说倪@些相關(guān)報道，Leptin與脂質(zhì)代謝的相關(guān)機制仍不清楚，尤其在利用過表達(dá)Leptin基因的方式構(gòu)建豬等大動物模型來研究Leptin與脂質(zhì)代謝相關(guān)的功能基因的調(diào)控機制也尚未被報道。

動物機體攝入過多的能量后，肝臟能將多余的能量通過形成脂肪或以中性甘油三酸酯（Triacylglycerol，TAG）的形式有效地沉積在脂肪組織中，前脂肪細(xì)胞是動物體內(nèi)終生存在的一類具有增殖和脂肪細(xì)胞定向分化能力的特異化前體細(xì)胞［20］，中性TAGs在脂肪細(xì)胞中的不斷積累造成脂滴不斷增大，而脂肪細(xì)胞通過分泌Leptin能夠有效抑制甘油三酯的合成。動物機體脂肪的代謝還受脂質(zhì)代謝通路相關(guān)基因的調(diào)控。有報道，PPARγ與脂肪代謝和脂滴形成密切相關(guān)，是PPARs家族成脂能力最強的亞型［21］。SREBPs裂解激活蛋白SCAP（SREBPs cleavage-activating protein，SCAP）用來控制SREBPs的激活。SCAP是處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種膜蛋白，同時SCAP能與SREBPs在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成復(fù)合物，參與甘油三酯的合成［22-24］。TAG合成涉及酰基轉(zhuǎn)移酶將?；舅徂D(zhuǎn)移至活化的甘油主鏈，?；D(zhuǎn)移酶包括3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶（GPAM），1-?；视?3-磷酸O-酰基轉(zhuǎn)移酶6（AGPAT6）［25］。另外，PLIN2基因在多種組織中廣泛表達(dá)，是形成細(xì)胞脂滴的結(jié)構(gòu)蛋白，能夠刺激脂質(zhì)的聚集和脂滴的形成［26］。本研究基于實驗室前期Leptin過表達(dá)豬的研究基礎(chǔ)［27］，通過分離培養(yǎng)Leptin過表達(dá)豬和野生型豬前脂肪細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并誘導(dǎo)分化形成脂滴，通過油紅O及Bodipy染色觀察脂滴的形態(tài)，統(tǒng)計分析脂滴形成的數(shù)量及脂質(zhì)含量，進(jìn)一步利用Q-PCR檢測分析脂質(zhì)合成代謝相關(guān)基因mRNA的表達(dá)情況，旨為進(jìn)一步闡明人類肥胖發(fā)生發(fā)展的分子機理研究奠定一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用Leptin過表達(dá)和野生型豬皮下前脂肪細(xì)胞均與實驗室已發(fā)表文章［27］中的豬為同一個體。

1.2 方法

1.2.1 豬前脂肪細(xì)胞分離和傳代培養(yǎng) 通過外科手術(shù)法從成年的Leptin過表達(dá)豬（Leptin）和野生型豬（control）皮下獲取脂肪組織，立即將其浸入含有5%青霉素-鏈霉素溶液（PS）溶液中，置于碎冰中運送到實驗室。用無菌PBS（含5%PS）洗滌3次，用不含PS的PBS洗滌，然后用眼科剪將脂肪組織充分剪碎并轉(zhuǎn)移到加有2 mL膠原酶I的T-25瓶中，置于38℃二氧化碳培養(yǎng)箱中消化約1.5 h，室溫1 500 r/min、3 min離心3次，收集細(xì)胞沉淀，用10%FBS、1%PS的DMEM完全培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)移到35 mm培養(yǎng)皿中，置于38℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，2 d更換一次完全培養(yǎng)基。按照標(biāo)準(zhǔn)方案［28］誘導(dǎo)第3至第5代的豬前脂肪細(xì)胞進(jìn)行分化，具體將豬前脂肪細(xì)胞傳代接種在35 mm培養(yǎng)皿中并增殖至匯合度達(dá)50%-60%時，使用分化液（含有10%胎牛血清，0.87 μmol/L胰島素，1 μmol/L地塞米松，0.25 mmol/L IBMX、1 μmol/L羅格列酮）誘導(dǎo)分化，此時記為0 d，誘導(dǎo)2 d后，將分化液替換為維持培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清，0.87 μmol/L胰島素，1 μmol/L地塞米松和1 μmol/L羅格列酮的DMEM培養(yǎng)基）促使其繼續(xù)分化，此后每2 d更換一次新鮮的維持培養(yǎng)基，分別在誘導(dǎo)分化后第0、4、6、8、10和14天時收集細(xì)胞用于后續(xù)相關(guān)實驗。

1.2.2 脂滴Bodipy染色 將前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)第0、4、6、8、10和14天進(jìn)行脂滴Bodipy染色，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞1次，并用含4%多聚甲醛的PBS溶液在室溫下固定30 min，用PBS洗滌3次，滴加600 μL Bodipy工作液（將1 mg/mL儲存液按1∶1 000用PBS稀釋，工作液需避光4℃保存）。室溫染色15 min后用PBS洗滌細(xì)胞3次，立即在熒光顯微鏡下觀察并拍照，用ImageJ統(tǒng)計分析脂滴面積。

1.2.3 脂滴的油紅O染色和脂質(zhì)含量測定 分別選取誘導(dǎo)分化第0、4、6、8、10和14天的前脂肪細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞1次，加入4%多聚甲醛在室溫下孵育30 min，接著用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入油紅O工作液（將3.5 mg/mL的貯存液按6∶4用H2O稀釋），室溫下染色30 min，用PBS洗滌細(xì)胞3次，在顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。每個培養(yǎng)皿中加入等體積的異丙醇及4%NP-40進(jìn)行萃取，并在充分混合后使用全波長酶標(biāo)儀測量520 nm處的吸光度值。

1.2.4 RNA提取及Q-PCR檢測相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平 用TRIzol提取總RNA，使用Prime-Script RT試劑盒從總RNA合成cDNA，用Q-PCR評估脂滴分化及脂質(zhì)合成代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。Q-PCR實驗使用的PCR引物（表1）由Primer 5.0軟件設(shè)計，并由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。20 μL Q -PCR反應(yīng)體系：2×SYBR Green Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL，10 μmol Forward primer 1 μL，10 μmol Reverse primer 1 μL，cDNA 1 μL。Q -PCR特異產(chǎn)物通過溶解曲線分析，相對Ct值法即X = 2-ΔΔCt測定相對基因表達(dá)變化。

表1 Q-PCR所用引物序列表

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 本研究中所有的實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（x-±s 表示，采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，#，*P＜0.05為差異顯著；##，**P＜0.01為差異極顯著），作圖采用GraphPad Prism 7軟件。

2 結(jié)果

2.1 Leptin過表達(dá)對豬前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成脂滴的影響

誘導(dǎo)分化后，Leptin過表達(dá)豬前脂肪細(xì)胞和野生型豬前脂肪細(xì)胞的分化進(jìn)程存在差異（圖1）。0 d時均呈現(xiàn)梭型，2 d后細(xì)胞開始膨脹，從原始的梭形逐漸形成球形，呈現(xiàn)出“環(huán)狀”。第4天野生型細(xì)胞內(nèi)生成的微小脂滴已匯集成多個小脂滴，而Leptin過表達(dá)細(xì)胞僅出現(xiàn)微小脂滴。直到第14天，Leptin過表達(dá)豬前脂肪細(xì)胞脂滴的生長才與野生型趨于一致，表明Leptin過表達(dá)豬前脂肪細(xì)胞分化形成脂滴的進(jìn)程慢于野生型豬前脂肪細(xì)胞。

2.2 Leptin過表達(dá)對豬前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中脂質(zhì)合成的影響

根據(jù)Bodipy染色結(jié)果（圖2-A，2-D），第4天時，野生型豬前脂肪細(xì)胞中的熒光強度明顯高于Leptin過表達(dá)豬前脂肪細(xì)胞。之后第6天時兩者細(xì)胞表達(dá)量仍然存在差異，直到14 d時，Leptin過表達(dá)的豬脂肪細(xì)胞與野生型豬脂肪細(xì)胞表達(dá)量也不相同。進(jìn)一步，用油紅O染色觀察后再用異丙醇和NP-40萃取脂肪細(xì)胞中的甘油三酯進(jìn)行吸光度測定（圖2-B，2-C），結(jié)果與熒光強度值相符。從4-10 d，Leptin過表達(dá)豬前脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)形成顯著低于野生型豬前脂肪細(xì)胞（P＜0.05），直到誘導(dǎo)分化后第14天，Leptin過表達(dá)豬前脂肪細(xì)胞甘油三酯的含量與野生型豬的前脂肪細(xì)胞甘油三酯的含量趨于一致（P＞0.05）。

2.3 Leptin過表達(dá)對豬前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成脂滴過程中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響

圖1 Leptin過表達(dá)豬前脂肪細(xì)胞與野生型豬前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成脂滴的情況

圖2 Leptin過表達(dá)與野生型豬前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中脂質(zhì)合成含量測定結(jié)果

Q-PCR結(jié)果顯示，Leptin過表達(dá)豬前脂肪細(xì)胞中Leptin的表達(dá)量顯著高于野生型豬前脂肪細(xì)胞（P＜0.05）（圖3-A）。進(jìn)一步利用Q-PCR檢測了誘導(dǎo)0 d和4 d后的豬前脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)情況。經(jīng)過4 d誘導(dǎo)后，在3個脂質(zhì)代謝相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子，PPARγ和SREBP1的表達(dá)在野生型豬前脂肪細(xì)胞中極顯著升高（P＜0.01），SCAP的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；而在Leptin過表達(dá)豬前脂肪細(xì)胞中PPARγ的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），SREBP1和SCAP的表達(dá)無明顯變化（P＞0.05）。與野生型相比，開始誘導(dǎo)時，Leptin過表達(dá)豬前脂肪細(xì)胞中PPARγ基因的表達(dá)呈現(xiàn)極顯著低的水平（P＜0.01）；誘導(dǎo)4 d后，在Leptin過表達(dá)豬脂肪細(xì)胞中，以上3個基因的表達(dá)均極顯著降低（P＜0.01）（圖3-B）。這些結(jié)果表明，Leptin過表達(dá)抑制了脂質(zhì)代謝通路中轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因的表達(dá)。同時，誘導(dǎo)4 d后，脂肪酸轉(zhuǎn)位酶FAT-CD36和脂蛋白酯酶LPL的表達(dá)水平在野生型和Leptin過表達(dá)豬前脂肪細(xì)胞中均極顯著升高（P＜0.01）。與野生型組相比，開始誘導(dǎo)時，在Leptin過表達(dá)豬脂肪細(xì)胞中FAT-CD36基因的表達(dá)均呈現(xiàn)極顯著低的水平（P＜0.01）；誘導(dǎo)4 d后，在Leptin過表達(dá)豬前脂肪細(xì)胞中，F(xiàn)AT-CD36的表達(dá)仍顯著低于野生型（P＜0.05），LPL的表達(dá)極顯著低于野生型（P＜0.01）（圖3-C）。

在誘導(dǎo)第4天時，3個TAG合成的相關(guān)基因AGPAT6、GPAM和PLIN2的表達(dá)水平在野生型豬前脂肪細(xì)胞均極顯著升高（P＜0.01），而在Leptin過表達(dá)豬前脂肪細(xì)胞中AGPAT6和PLIN2的表達(dá)水平極顯著升高（P＜0.01），GPAM的表達(dá)水平無顯著變化。與野生型相比，開始誘導(dǎo)時，在Leptin過表達(dá)豬前脂肪細(xì)胞中的上述3個基因的表達(dá)均無顯著變化（P＞0.05）；誘導(dǎo)4 d后，在Leptin過表達(dá)豬前脂肪細(xì)胞中以上3個基因的表達(dá)均呈現(xiàn)極顯著降低的水平（P＜0.01）（圖3-D）。這些結(jié)果表明，Leptin過表達(dá)抑制了脂質(zhì)合成轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因、TAG合成相關(guān)基因以及長鏈脂肪酸攝取相關(guān)基因的表達(dá)。

3 討論

Leptin是由脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，對脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)具有重要的作用［5］。因缺少理想的肥胖實驗動物模型，肥胖及體脂過度沉積發(fā)生的分子機制研究主要通過添加外源性Leptin的前脂肪細(xì)胞系體外分化進(jìn)行研究。肥胖型ob/ob鼠是目前常用的肥胖實驗動物模型，該鼠是由于OB基因缺陷而引起的先天性肥胖，但嚙齒類動物和人在基因組和機體代謝上存在較大差異，其作為研究人肥胖的動物模型存在缺陷，因此需更理想的動物模型來研究人肥胖發(fā)生的分子機制。豬與人在解剖和生理代謝特點方面非常相似，對豬、人、鼠OB基因的研究表明，豬與人OB基因的同源性為88.5%［31］，鼠與人OB基因的同源性為83%［32］，本實驗室前期已成功構(gòu)建了過表達(dá)Leptin基因的豬模型，體外實驗結(jié)果表明，6月齡野生型豬體重約為轉(zhuǎn)Leptin基因豬體重的2.5-3.3倍，ELASA檢測轉(zhuǎn)Leptin基因豬血清中的Leptin水平顯著高于野生型（P＜0.05）［27］。Ke等［33］的研究表明低脂肪率與脂肪細(xì)胞中甘油三酯的合成與儲存減少有關(guān)。因此，基于豬與人同源性高的優(yōu)點，我們選擇豬構(gòu)建人類疾病的肥胖模型，并進(jìn)一步成功構(gòu)建了過表達(dá)Leptin基因豬模型，將更好地模擬人類肥胖疾病的發(fā)生，進(jìn)而為揭示肥胖疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的甘油三酯等代謝機制研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

在3T3-L1細(xì)胞系培養(yǎng)基中添加5-500 ng/mL外源性Leptin，可抑制脂質(zhì)積累［34］，提示Leptin在一定程度上能影響動物機體脂質(zhì)的積累和脂肪細(xì)胞中TAG的積累。脂肪細(xì)胞的生成和分化還受激素、細(xì)胞間、細(xì)胞與間質(zhì)間相互作用的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控［35-37］，如PPAR、SREBP1c等［38-42］。PPARγ主要在脂肪組織中參與脂肪細(xì)胞的分化，是誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪細(xì)胞分化過程中，表達(dá)水平不斷上升，對脂肪細(xì)胞的分化起著重要作用［43-44］。Kim等［45］研究發(fā)現(xiàn)SREBP1能促進(jìn)小鼠脂肪細(xì)胞系3T3LI前脂肪細(xì)胞脂滴的積累，加速前體脂肪細(xì)胞的分化進(jìn)程。Cabrero等［46］通過重組人Leptin處理原代培養(yǎng)人源單核巨噬細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)PPARγmRNA表達(dá)下調(diào)。本實驗研究結(jié)果表明，過表達(dá)Leptin可抑制脂滴數(shù)量增加，在一定程度上致使甘油三酯的合成速率降低，并可促進(jìn)PPARγ、SREBP1、SCAP基因的下調(diào)，這與前人所報道的結(jié)果一致，Leptin可抑制脂肪細(xì)胞分化和增殖，其機制可能是通過下調(diào)PPARγ、SREBP1、SCAP基因的表達(dá)來抑制脂肪細(xì)胞的分化和代謝。

脂肪細(xì)胞的分化過程在激素誘導(dǎo)的培養(yǎng)體系中4 d內(nèi)完成，在分化的早期階段進(jìn)入細(xì)胞周期，經(jīng)1-2次有絲分裂之后永久地退出細(xì)胞周期，開始蓄積脂滴，經(jīng)過終末分化階段分化為成熟脂肪細(xì)胞［47-48］。脂肪酸是合成甘油三酯的重要原料，有研究表明，F(xiàn)AT/CD36可將LCFA運輸?shù)街炯?xì)胞中［15］，過表達(dá)FAT/CD36可增強脂肪酸的轉(zhuǎn)運，而LPL是脂肪細(xì)胞早期分化的標(biāo)志［49］。本實驗研究結(jié)果表明，Leptin過表達(dá)豬前脂肪細(xì)胞中LPL和FAT/CD36基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低，與上述所報道的研究結(jié)果一致，表明Leptin在一定程度上可通過下調(diào)FAT/CD36、LPL基因的表達(dá)進(jìn)而抑制LCFA的運輸和脂肪細(xì)胞的分化。也有研究報道，在脂肪細(xì)胞分化的初期階段，Leptin可抑制脂肪細(xì)胞脂肪酸的合成，從而減少脂肪沉積，PLIN2（Adipophilin）位于脂滴表面，還與脂滴的儲存密切相關(guān)［50-51］。外源性添加10 ng/mL Leptin可有效減少大鼠脂肪細(xì)胞TAG的積累［15］。PPARγ特異性激活劑羅格列酮（Ros）與Leptin聯(lián)合處理大鼠脂肪細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能有效減弱Leptin對PPARγ、PLIN2的mRNA表達(dá)的下調(diào)作用［6］。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)Leptin豬前脂肪細(xì)胞TAG合成的相關(guān)基因（GPAM，AGPAT6）與脂滴儲存相關(guān)基因PLIN2的mRNA表達(dá)水平均下調(diào)，與前人所報道的結(jié)果相一致，表明Leptin可通過下調(diào)TAG合成相關(guān)基因的表達(dá)及PLIN2基因的mRNA下調(diào)來抑制脂質(zhì)的儲存和積累。

圖3 Leptin過表達(dá)豬前脂肪細(xì)胞和野生型豬前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成脂滴過程中脂質(zhì)合成代謝相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平

4 結(jié)論

在豬前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成脂滴的過程中，Leptin可通過下調(diào)脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)水平來抑制前脂肪細(xì)胞分化形成脂滴的進(jìn)程，降低脂肪細(xì)胞中甘油三酯的合成，從而在一定程度上降低動物機體內(nèi)脂質(zhì)合成的速率，進(jìn)而降低動物機體內(nèi)脂質(zhì)的沉積，將為研究人類肥胖的發(fā)生發(fā)展過程及機制奠定理論基礎(chǔ)。