混菌發(fā)酵對杏鮑菇菌糠營養(yǎng)成分及其體外瘤胃發(fā)酵的影響

李成艦，蔣雪，楊大盛，譚支良，湯少勛*，黃春花

混菌發(fā)酵對杏鮑菇菌糠營養(yǎng)成分及其體外瘤胃發(fā)酵的影響

李成艦1,2,3,4,5，蔣雪3，楊大盛3，譚支良3，湯少勛3*，黃春花1,2

(1.邵陽學(xué)院藥學(xué)院，湖南 邵陽 422000；2.湘西南中藥開發(fā)利用湖南省工程研究中心，湖南 邵陽 422000；3.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長沙 410125；4.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥技術(shù)學(xué)院，湖南 衡陽 421005；5.永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，湖南 永州 425100)

為提高杏鮑菇菌糠的飼用營養(yǎng)品質(zhì)，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)，將長枝木霉(5×103、5×104、5×105cfu/g)、枯草芽孢桿菌(5×105、5×106、5×107cfu/g)、釀酒酵母(5×106、5×107、5×108cfu/g)和杰丁畢赤酵母(5×105、5×106、5×107cfu/g)進(jìn)行組合接種到杏鮑菇菌糠中，分別記為a、b、c、d、e、f、g、h、i，以不加菌為對照組，密封發(fā)酵144 h，檢測發(fā)酵菌糠的各營養(yǎng)指標(biāo)；然后以該發(fā)酵菌糠為底物，體外模擬瘤胃發(fā)酵48 h，檢測菌糠的瘤胃發(fā)酵特征指標(biāo)。結(jié)果表明：與對照組相比，混菌發(fā)酵顯著增加了a、c、d、f、g、h、i組的粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和a、b、c、d、f、h組的粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)；顯著減少了d組的中性洗滌纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)和a、d組的酸性洗滌纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)；4種微生物對混菌發(fā)酵都有一定的影響，其中枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、杰丁畢赤酵母的影響顯著；混菌發(fā)酵對杏鮑菇菌糠的瘤胃發(fā)酵特征指標(biāo)無顯著影響；菌種最優(yōu)組合配方為長枝木霉菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、杰丁畢赤酵母分別為5×104、5×105、5×107、5×107cfu/g。

杏鮑菇菌糠；混菌發(fā)酵；營養(yǎng)成分；山羊瘤胃液發(fā)酵

杏鮑菇菌糠是杏鮑菇子實(shí)體采收后廢棄的固體培養(yǎng)基，以棉籽殼、木屑、稻草、玉米芯等為主要原料。食用菌子實(shí)體采收后，菌糠中還殘留了菌類代謝產(chǎn)物、次生產(chǎn)物及栽培料分解代謝殘留物、未形成子實(shí)體的菌絲殘?bào)w等，這些殘留物中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、礦質(zhì)元素等營養(yǎng)物質(zhì)[1–2]。目前，菌糠主要堆積為肥料或焚燒，不僅浪費(fèi)資源，且污染環(huán)境；另一方面，隨著草食動(dòng)物產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展，對粗飼料的需求也日益增長；因此，開發(fā)食用菌菌糠飼料不僅具有良好的生態(tài)效應(yīng)，還能擴(kuò)大粗纖維飼料的來源，促進(jìn)食用菌產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明：杏鮑菇菌糠中的粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)13.61%，具有很好的飼用潛力；但中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)63.45%、48.47%，導(dǎo)致其飼用性能較差，影響動(dòng)物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收；因此，降低纖維素是杏鮑菇菌糠飼料化的關(guān)鍵要素。

目前，采用微生物發(fā)酵降解菌糠中的纖維素應(yīng)用廣泛[4–7]。長枝木霉能產(chǎn)生多種生物活性的酶，在飼料產(chǎn)業(yè)中常用來酶解粗飼料[8]?？莶菅挎邨U菌能產(chǎn)生多種酶，促進(jìn)纖維素、淀粉等營養(yǎng)素水解為糖類，常用于含有較多纖維素的飼料原料發(fā)酵[9–10]。楊榮玲等[11]采用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌、乳酸桿菌以3∶2∶1的接種量比例混合接種到雙孢菇菌糠中固態(tài)發(fā)酵，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)由原來的12.74%增加到22.05%，粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)由原來的8.88%增加到11.14%。徐淏等[12]用靈芝菌與釀酒酵母分2階段發(fā)酵杏鮑菇菌糠，產(chǎn)物中蛋白和粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別提高了68.54%和132.12%，釀酒酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生濃郁的酒香味，可以改善菌糠的適口性。杰丁畢赤酵母可利用纖維素水解液等生成蛋白質(zhì)，提升飼料產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值，是生產(chǎn)飼料用單細(xì)胞蛋白的優(yōu)良菌種[13]。

已有發(fā)酵菌糠作為飼料的少量報(bào)道[14–15]，但大多限于發(fā)酵工藝條件等方面的研究。菌糠作為飼料在養(yǎng)殖場也還只是嘗試應(yīng)用，大多數(shù)只是將菌糠作為原料的部分替代品；而作為反芻動(dòng)物飼料的杏鮑菇菌糠的混菌發(fā)酵研究尚且少見。根據(jù)已有文獻(xiàn)資料[8–10,13,16]、前期研究基礎(chǔ)[5–7]、菌種使用說明及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，本研究中，選擇長枝木霉、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、杰丁畢赤酵母作為混菌發(fā)酵的菌種，將這4種微生物接種到杏鮑菇菌糠中，探索這些菌種混合發(fā)酵菌糠時(shí)對菌糠營養(yǎng)成分的影響，及混菌發(fā)酵后的菌糠再進(jìn)行體外模擬瘤胃發(fā)酵的特征，優(yōu)選混菌發(fā)酵杏鮑菇菌糠的菌種配方，旨在為杏鮑菇菌糠作為反芻動(dòng)物飼料的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1杏鮑菇菌糠

鮮杏鮑菇菌糠由湖南某公司提供，含水量56%，其干物質(zhì)原料棉籽殼、木屑、稻草、玉米芯、麩皮、玉米粉、輕質(zhì)碳酸鈣、石膏粉、豆粕、其他成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%、20%、8%、18%、18%、4%、2%、1%、8%、1%。

1.1.2菌種

1.1.3供體動(dòng)物

參照楊大盛等[7]的研究，選用3頭成年去勢、體況良好并裝有永久性瘤胃瘺管的瀏陽黑山羊作為瘤胃液供體動(dòng)物。

1.1.4主要儀器設(shè)備

氣相色譜儀(7890A，Agilent)；高效液相色譜儀(1260，Agilent)；索氏抽提儀(Sox 402，桂寧(上海)實(shí)驗(yàn)器材有限公司)；全自動(dòng)纖維儀(Gerhardt FT–12，中國格哈特分析儀器有限公司)；高速氨基酸分析儀(L–8900，上海天美科學(xué)儀器有限公司)；pH計(jì)(REX，PHS–3C，上海儀器設(shè)備廠)。

1.2　試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1混菌發(fā)酵

試驗(yàn)于2017年3月到2018年12月在中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所完成。選擇長枝木霉?jié)舛?)、枯草芽孢桿菌濃度()、釀酒酵母濃度()、杰丁畢赤酵母濃度()進(jìn)行4因素3水平L9(34)的正交試驗(yàn)，9組分別記為a、b、c、d、e、f、g、h、i，因素水平列于表1。另設(shè)對照組(不加菌種，其余處理過程相同，CK)。共10組，每組重復(fù)4次。取新鮮杏鮑菇菌糠96 g，按照表1中濃度的100倍分別加入4種菌液各1 mL，充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆?，配制?00 g含水60%的發(fā)酵體系；置于30 ℃恒溫箱中密封靜態(tài)持續(xù)發(fā)酵144 h。發(fā)酵完成后，檢測干物質(zhì)(DM)、粗蛋白(CP)、粗脂肪(CF)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)及氨基酸(AA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表1　正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.2體外模擬瘤胃發(fā)酵

參照楊大盛等[7]的方法進(jìn)行體外模擬瘤胃發(fā)酵。將混菌發(fā)酵完成后的產(chǎn)物取出，于65 ℃烘干，并分別粉碎過孔徑0.425 mm的篩網(wǎng)，預(yù)留部分用于常規(guī)營養(yǎng)成分指標(biāo)測定，再精確稱取0.6 g作為發(fā)酵底物，并置于150 mL發(fā)酵瓶中。將配制好的2.4 L人工瘤胃緩沖液(含Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、MgSO4·2H2O、NaHCO3、NH4HCO3分別為8.168 4、3.516、0.340 8、19.92、2.28 g，于試驗(yàn)當(dāng)天再加入0.33 mL/L的0.1%刃天青)置于恒溫磁力攪拌器上加熱，使其溫度保持在39.5 ℃，通入二氧化碳并保持厭氧環(huán)境2 h以上。通過瘤胃瘺管采集晨飼前山羊的新鮮瘤胃液于保溫杯中，用6層紗布迅速過濾；量取600 mL濾液，加入到準(zhǔn)備好的2.4 L人工瘤胃緩沖液中，恒溫39.5 ℃下攪拌混合均勻。取60 mL混合溶液，加入到已預(yù)熱的發(fā)酵瓶(含發(fā)酵底物0.6 g)中，于恒溫39.5 ℃的振蕩水浴鍋(振蕩頻率50 r/min)中，體外模擬瘤胃厭氧持續(xù)發(fā)酵48 h。發(fā)酵完成后，檢測pH值、干物質(zhì)消失率、氨態(tài)氮及揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度。

1.3　指標(biāo)測定方法

參照文獻(xiàn)[17]中的常規(guī)測定方法檢測營養(yǎng)成分指標(biāo)。采用烘干法測定DM質(zhì)量分?jǐn)?shù)；采用凱氏定氮法測定CP質(zhì)量分?jǐn)?shù)；采用索氏抽提法測定CF質(zhì)量分?jǐn)?shù)；利用全自動(dòng)纖維素儀(濾袋法)測定NDF、ADF質(zhì)量分?jǐn)?shù)；利用高速氨基酸分析儀(樣品預(yù)處理參照GB/T18246— 2000)測定氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并計(jì)算總氨基酸(TAA)、必需氨基酸(EAA)、非必需氨基酸(NEAA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)及必需氨基酸與非必需氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比(EAA/NEAA)。

參照楊大盛等[7]的方法檢測瘤胃發(fā)酵特征指標(biāo)。體外模擬瘤胃發(fā)酵后，用pH計(jì)測定發(fā)酵瓶中發(fā)酵液的pH；發(fā)酵液經(jīng)紗布抽濾后，濾渣在105 ℃烘箱中烘8 h，測定干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并計(jì)算干物質(zhì)消失率；取2 mL發(fā)酵液離心10 min (12 000 r/min，4 ℃)，再取1 mL上清液，加入0.1 mL 25%偏磷酸固定，靜置15 min后于–20 ℃保存，用于測定VFA和氨態(tài)氮濃度。采用比色法[18]測定氨態(tài)氮濃度；參照WANG等[19]的方法測定VFA濃度，并計(jì)算總揮發(fā)性脂肪酸濃度及乙酸和丙酸的濃度比(以下簡稱乙丙比)。

1.4　數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2013整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用多指標(biāo)試驗(yàn)全概率評分法[20]進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分別對2個(gè)發(fā)酵階段的試驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)綜合評分，得到2個(gè)總的綜合評分值總1和總2；運(yùn)用SPSS 18.0進(jìn)行極差分析和方差分析，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，用Duncan法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1　混菌發(fā)酵對杏鮑菇菌糠營養(yǎng)成分的影響及菌種配方的優(yōu)化組合

2.1.1混菌發(fā)酵對杏鮑菇菌糠營養(yǎng)成分的影響

由表2可知，與CK相比，混菌發(fā)酵a、c、d、f、g、h、i組的CP質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加；d處理組的NDF質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著減少；a、b、c、d、f、h組的CF質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加；a、d組的ADF質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著減少；e、i組的TAA顯著減少；所有處理組的EAA/NEAA顯著減少。

表2　混菌發(fā)酵處理的杏鮑菇菌糠中營養(yǎng)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

同列數(shù)據(jù)后不同字母示組間差異顯著(＜0.05)。

2.1.2混菌發(fā)酵菌種配方的優(yōu)選

由表3可知，以總1作為評價(jià)指標(biāo)，表明、、對杏鮑菇菌糠發(fā)酵的影響依次降低；表明最優(yōu)組合為2123。由表4可知，(=0.004)與(=0.005)在杏鮑菇菌糠混菌發(fā)酵中具有極顯著意義；具有顯著意義(=0.021)；具有一定程度的影響(=0.062)。

表3　正交試驗(yàn)混菌發(fā)酵處理的杏鮑菇菌糠各營養(yǎng)成分含量的綜合評分及其分析結(jié)果

表4　杏鮑菇菌糠混菌發(fā)酵正交試驗(yàn)的方差分析

2.2　混菌發(fā)酵對體外模擬瘤胃發(fā)酵的影響

由表5可知，在體外模擬瘤胃發(fā)酵試驗(yàn)中，干物質(zhì)消失率、氨態(tài)氮、總揮發(fā)性脂肪酸濃度、乙丙比、pH值在各組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5　杏鮑菇菌糠模擬瘤胃發(fā)酵的特征指標(biāo)濃度

3　結(jié)論與討論

楊榮玲等[11]的研究結(jié)果顯示，混菌發(fā)酵后的雙孢菇菌糠的粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)由原來的12.74%增加到22.05%，其發(fā)酵產(chǎn)品烘干后即可用于飼料原料；李佳騰等[21]的研究結(jié)果表明，混菌發(fā)酵可增加粗蛋白和粗脂肪的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；陸亞珍等[22]研究表明，發(fā)酵后杏鮑菇菌糠的粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)13.41%，可替代50%常規(guī)飼料作羊的日糧。本研究中，混菌發(fā)酵能顯著增加大多數(shù)處理組的粗蛋白(b、e除外)和粗脂肪(e、g、i除外)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，顯著降低d組的中性洗滌纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)和a、d組的酸性洗滌纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)，這與前人的研究結(jié)果基本一致[11,21–22]。其原因一方面可能是微生物在發(fā)酵過程中迅速增殖，菌體蛋白增多；另一方面可能是杰丁畢赤酵母等微生物利用纖維素水解產(chǎn)生的糖類合成人畜可食用的蛋白質(zhì)[13]和脂肪[21]。

本研究中，混菌發(fā)酵顯著減少了e、i組中總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)和所有處理組的EAA/NEAA，這與李佳騰等[21]的研究結(jié)果(混菌發(fā)酵增加杏鮑菇菌糠中氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù))不同。本研究結(jié)果顯示，混菌發(fā)酵顯著增加了除b、e外的其他處理組中粗蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，故推測其原因可能是微生物利用這些氨基酸合成蛋白質(zhì)所致。

微生物分解飼料蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生乙酸、丙酸等揮發(fā)性脂肪酸成分，為微生物生長和宿主動(dòng)物提供所需的養(yǎng)分和能量；合成的菌體蛋白是反芻動(dòng)物所需的各種氨基酸的主要來源[13]。本研究中，混菌發(fā)酵對體外模擬瘤胃發(fā)酵特征各項(xiàng)指標(biāo)均未有顯著影響；乙丙比為2.86~3.36，表明產(chǎn)生乙酸的比例較高。李佳騰等[21]的研究結(jié)果顯示，體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生了較多的乳酸，導(dǎo)致pH值、揮發(fā)性脂肪酸等都小于對照組。本研究與前人的研究結(jié)果不同，其原因可能是菌種中未包含乳酸菌所致。

本研究體外模擬瘤胃發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明，所有組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明混菌發(fā)酵對杏鮑菇菌糠體外模擬瘤胃發(fā)酵特征無顯著影響，因此，菌種最優(yōu)組合配方應(yīng)由前一階段試驗(yàn)的結(jié)果決定。纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，影響反芻動(dòng)物對營養(yǎng)的消化吸收，降低原料中纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)是杏鮑菇菌糠飼料化的決定性因素。本研究混菌發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明，d組的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都最低，粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，粗蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)略次于h組，各個(gè)指標(biāo)的綜合評分最高；混菌發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果表明，最優(yōu)組合為2123，也正好是d組；因此，確定混菌發(fā)酵最優(yōu)組合的菌種配方為長枝木霉菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、杰丁畢赤酵母分別為5×104、5×105、5×107、5×107cfu/g。

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Effect of mixed culture fermentation on nutritional components and in vitro rumen fermentation ofresidue

LI Chengjian1,2,3,4,5, JIANG Xue3, YANG Dasheng3, TAN Zhiliang3, TANG Shaoxun3*, HUANG Chunhua1,2

(1.School of Pharmacy, Shaoyang University, Shaoyang, Hunan 422000, China; 2.Southwest Hunan Research Center of Engineering for Development and Utilization of Traditional Chinese Medicine, Shaoyang, Hunan 422000, China; 3.Institute of Subtropical Agriculture, the Chinese Academy of Sciences, Changsha, Hunan 410125, China; 4.College of Medicine & Technology, Hunan Polytechnic of Environment and Biology, Hengyang, Hunan 421005, China; 5.Department of Pharmacy, Yongzhou Vocational Technical College, Yongzhou, Hunan 425100, China)

Mixed culture fermentation were used in this experiment to investigate new methods for improving the quality of nutrition ofresidue as a feed. A L9(34) orthogonal design was used for this experiment:(5×103, 5×104, 5×105cfu/g),(5×105, 5×106, 5×107cfu/g),(5×106, 5×107, 5×108cfu/g), and(5×105, 5×106, 5×107cfu/g) were inoculated into theresidue, recorded as a, b, c, d, e, f, g, h, and i, respectively;and a control group(without microorganisms). The indicators of nutrients in theresidue were detected after 144 hours’ continuous fermentation in an anaerobic environment; then followed by a simulated rumen fermentation in vitro for 48 hours before the indexes collected. The result of the experiments had shown that, compared to the control group, the mixed culture fermentation increased significantly the crude protein mass fractions of the a, c, d, f, g, h, i treatment groups and the crude fat mass fractions of the a, b, c, d, f, h treatment groups; and reduced significantly the neutral detergent fiber mass fractions of the d treatment group and the acid detergent fiber mass fractions of the a, d treatment groups. The four microorganisms all played roles to affect the effects in the process,,andplayed significant roles especially. The mixed culture fermentation did not affect significantly the rumen fermentation ofresidue. According to the analysis, the optimum treatment was that the inoculation levels of,,andwere 5×104, 5×105, 5×107, 5×107cfu/g, respectively.

residue; mixed culture fermentation; nutritional components; goat’s rumen fluid fermentation

S816.6

A

1007-1032(2020)04-0443-06

10.13331/j.cnki.jhau.2020.04.010

李成艦，蔣雪，楊大盛，譚支良，湯少勛，黃春花．混菌發(fā)酵對杏鮑菇菌糠營養(yǎng)成分及其體外瘤胃發(fā)酵的影響[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2020，46(4)：443–448．

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http://xb.hunau.edu.cn

2020–04–13

2020–06–15

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018YFD0501604)；湖南省科技重大專項(xiàng)(2017NK1020)；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(12C1060)；永州市科技創(chuàng)新指導(dǎo)性計(jì)劃項(xiàng)目(2018ZD59)

李成艦(1974—)，男，湖南衡陽人，博士，副主任藥師，主要從事藥用植物功能成分研究，413874272@qq.com；

，湯少勛，博士，副研究員，主要從事反芻動(dòng)物營養(yǎng)研究，sxtang@isa.ac.cn

責(zé)任編輯：鄒慧玲

英文編輯：柳正