HPLC法同時評價不同桑黃提取物中3種主要化合物的含量

張勇，左朋，周美琪，王晶，李福森，劉春明

（長春師范大學中心實驗室，吉林長春130032）

桑黃是一種珍貴的真菌，在我國分布比較廣泛，主要生長在桑樹、楊樹等闊葉樹的樹干上[1-2]。桑黃中含有多種化學成分，其中，多糖、黃酮、三萜和酚類物質(zhì)為主要的活性成分。桑黃在抗癌、降血糖、機體免疫調(diào)節(jié)、消炎止痛、血管疾病等方面有良好的藥理作用，近年來桑黃在抗癌及免疫調(diào)節(jié)方面受到了廣泛的關注[3-5]。由于我國天然桑黃數(shù)量稀少，近年來開采較多，造成了桑黃野生資源的數(shù)量銳減。因此，人工培養(yǎng)桑黃蓬勃發(fā)展起來，但是人工培養(yǎng)桑黃的品質(zhì)及化學成分與野生的相比有較大差異，桑黃有效成分含量差異也較大，故有必要對桑黃的質(zhì)量進行合理的控制，通過試驗找出適合桑黃培育的環(huán)境、培育優(yōu)質(zhì)人工桑黃的方法，為桑黃的研發(fā)提供基本保障[6-8]。目前，我國對桑黃的研究主要集中在對其化學成分和生物學特征以及藥理方面的研究，但對桑黃中單體化學成分的含量分析的報道較少。

近十年來，高效液相色譜法廣泛地應用于天然產(chǎn)物、醫(yī)藥和化工等科學領域，特別是在天然產(chǎn)物的分析和分離上應用廣泛[9-10]。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）具有高效、高靈敏度、速度快的特點，對桑黃進行檢測分析，根據(jù)高效液相色譜圖可以通過峰形、峰面積以及出峰時間直觀地比較不同來源桑黃中活性成分的區(qū)別[11-12]，對比不同地區(qū)不同生長條件下的桑黃中單體化學成分的含量，為桑黃的質(zhì)量控制提供一定的試驗依據(jù)[13-14]。

davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 為桑黃中含量較高的3種化合物[15]，見圖1。從結構上看，其屬于典型的多酚類成分，經(jīng)研究證實具有多種藥效作用，該文選取了多種不同來源的桑黃，包括不同生長年份的野生桑黃以及人工栽培的桑黃，考察不同桑黃提取物中3種化合物的含量，為桑黃資源的開發(fā)利用提供理論基礎。

圖1 3種化合物的化學結構Fig.1 Chemical structure of the three compounds

1 材料與方法

1.1 材料

桑黃A：杭州千島湖桑之寶農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；桑黃B：金寨縣永福桑黃菌種植專業(yè)合作社；桑黃C：山東黃河林道千年古桑林菇園桑黃研究所；桑黃D和桑黃E：浙江桑之路桑黃有限公司；野生桑黃F（約3年）：山東省菇園食用菌科技有限公司；野生桑黃H（約10年）、野生桑黃K（5年以上）：吉林延邊華廈有限公司；桑黃G（約3年）和桑黃I（約2年）：通化十月細潤生物科技有限公司；桑黃J：安徽藍溪生物科技有限公司，桑黃菌種資源為桑黃纖孔菌Inonotus sanghuang。

甲醇、醋酸（色譜純試劑）：加拿大Caledon Laboratories Ltd.公司；davallialactone、hypholomine B、inoscavin A（純度≥95%）：長春師范大學中心實驗室自制；其它試劑（均分析純）：北京精細化學品有限公司。

Thermo U3000高效液相色譜儀、配備DAD檢測器：美國賽默有限公司；Hei-VAP型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國Heidolph公司；FA1204A電子分析天平：德國桑塔瑞斯公司；FW-100型高速萬能粉碎機：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；YoungLin Istrument超純水制備器：韓國Younglin Istrument公司；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

精密稱取桑黃粉末（A：1.000 0 g、B：1.000 2 g、C：1.000 3 g、D：1.000 5 g、E：1.000 3 g、F：1.000 2 g、G：1.000 8 g、H：1.000 5 g、I：1.000 6 g、J：1.000 9 g、K：1.000 2 g），25 mL部80%乙醇為溶劑進行超聲輔助提取，時間為60 min，溫度為45℃，抽濾，減壓回收，去除殘渣，色譜甲醇定容至10 mL的容量瓶中，得到桑黃粗提物，4℃冰箱保存，待用，HPLC檢測前過0.45 μm 濾膜。

1.2.2 標準品溶液的配制

分別準確稱取 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 0.500 2、0.500 5、0.500 8 mg，色譜甲醇制成濃度為500 μg/mL的貯備液，過0.45 μm的濾膜，制得對照品溶液。

1.2.3 液相色譜條件

HPLC的分析條件：流動相為乙腈（A）和0.2%醋酸水溶液（B）；色譜柱為 Thermo U3000 C18（250 mm×4.6 mm，5 mm）。柱溫：25℃；檢測波長：395 nm；流速：0.5 mL/min；進樣量：5 μL。洗脫梯度如表1所示。在此條件下，對 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A標準溶液及不同桑黃提取物進行HPLC分析。

表1 HPLC洗脫梯度Table 1 HPLC elution gradient

2 結果與分析

2.1 標準曲線的線性關系與范圍

將 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 溶液濃度稀釋為 2.5、4、5、7.5、10 μg/mL，依次進入高效液相色譜中相同條件進行檢測，得到色譜圖。分別以質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標，峰面積（y，mAU）為縱坐標制作 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 標準曲線見圖2。

圖2 3種化合物的標準曲線Fig.2 Standard curves of the three compounds

3種化合物的線性回歸方程分別為：y=8.856 7x+0.171 4、y=100.63x+75.786、y=7.493 8x-13.284，相關系數(shù)分別為 r=0.998 9、0.998 1、0.999 9，結果表明，在 2.5 μg/mL～10 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度試驗

按照“1.2.2”對照品溶液和“1.2.3”的色譜條件，重復進樣5次，測定色譜峰面積，以峰面積考察精密度，davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 峰面積的相對標準偏差（relative standrd deviation，RSD）分別為0.49%、0.57%、0.75%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗

選取桑黃H同一樣品溶液，分別于制備后的0、2、8、12、18、24 h，按“1.2.3”色譜條件進行 HPLC 測定，桑黃樣品中 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 的相對峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為 0.67%、0.66%、0.73%，表明樣品在24 h以內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3 重復性試驗

取同一批桑黃H藥材各5份，以乙醇為溶劑，超聲提取物法制備樣品溶液，分別應用于HPLC進行測定。結果表明，桑黃中davallialactone、hypholomine B、inoscavin A的平均含量分別為2.95%、1.21%、1.39%，峰面積含量的RSD分別為0.62%、0.58%、0.41%，表明該方法的重復性較好。

2.3 不同桑黃提取物中3種化合物的含量評價

為了高效率地對樣品中有效成分進行提取，以乙醇為溶劑，采用超聲提取法對桑黃中目標成分進行提取，將處理好的桑黃樣品按照1.2.3中液相色譜條件進行分析。在測試過程中，分別考察以甲醇和乙腈作為有機流動相，甲醇作為洗脫溶劑時色譜系統(tǒng)壓力較乙腈大，并且峰形較寬，洗脫時間也會相對較長，因此，選用乙腈作為洗脫的流動相。通過試驗表明向水相中加入一定量的醋酸，能有效防止分子在水相和有機相中電離，有利于改善樣品的色譜峰形狀和基線，避免出現(xiàn)拖尾和基線漂移[16-17]。因此，選用了乙腈-0.2%醋酸水溶液作為流動相對桑黃樣品進行梯度洗脫。

HPLC檢測11種不同的桑黃提取物的結果見圖3。

如圖3所示，在選定的條件下，桑黃中各主要成分得到較好的分離，目標成分davallialactone、hypholomine B、inoscavin A和其他化合物的色譜峰在譜圖中基本得到基線分離，該方法可以用于桑黃中davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 的定量分析[18]。

圖3 11種不同來源桑黃提取物的液相色譜圖Fig.3 HPLC of 11 extracts from different sources of Phellinus igniarius

根據(jù)圖3所示，3種化合物色譜峰保留時間與桑黃提取物樣品中化合物色譜峰保留時間基本一致，不同桑黃提取物中大部分峰為共有峰，這說明提取物中含有的組分較為相似，而不同提取物中色譜峰高、峰面積有所區(qū)別，則說明在不同桑黃提取物中davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 的含量有一定差異。其中，C、D、I桑黃樣品中目標化合物色譜峰較其它樣品差異較大，樣品中davallialactone峰較高，而之后基本未出峰，說明該樣品中未檢測到hypholomine B和inoscavin A。

2.4 11種不同來源桑黃中3種化合物的含量比較

應用HPLC法對11種桑黃提取物中davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 的含量進行檢測，結果見表2。

根據(jù)表2數(shù)據(jù)表明，在11種桑黃樣品中，野生桑黃提取物中 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A含量高于人工栽培桑黃。其中C、D、J桑黃樣品（均為人工栽培）中未檢測到hypholomine B、inoscavin A，I桑黃樣品中未檢測到hypholomine B。桑黃H和F樣品中davallialactone、hypholomine B、inoscavin A 含量最高，基本上達到了1%以上，桑黃A、桑黃K、桑黃E和桑黃 B 樣品中 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A含量次之，達到了0.2%～0.6%之間，而桑黃C、桑黃D、桑黃I、桑黃G和桑黃L樣品中davallialactone、inoscavin A含量相對較少，在0.1%～0.2%之間，未檢測到hypholomine B。

表2 11種不同產(chǎn)地davallialactone、hypholomine B、inoscavin A的含量Table 2 Contents of davallialactone，hypholomine B and inoscavin A in Phellinus igniarius of 11 species from different habitats

對比人工栽培桑黃C、桑黃D和桑黃I，未檢出hypholomine B、inoscavin A，差異的結果可能與栽培過程中的培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基組成有關；而桑黃A、桑黃B桑黃E、桑黃G和桑黃J中，3種單體化合物的含量相差很大，可能是與人工栽培生長年份、生長環(huán)境等不同因素有關。

對比野生桑黃，桑黃K（約5年以上）、桑黃H（約10年） 和桑黃 F（約 3年） 中 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A含量，桑黃H中davallialactone、hypholomine B、inoscavin A含量最高，而桑黃K中3種單體化合物的含量較低，初步判斷可能是與生長年份有關，生長時間長有利于3種單體化合物的累積，也可能與子實體生長的樹種有關。

3 結論

近年來，桑黃因其廣泛而優(yōu)異的藥理活性，受到廣泛關注。由于大量的采摘，致使我國野生桑黃數(shù)量稀少，因此培育優(yōu)質(zhì)桑黃快速發(fā)展，但人工栽培桑黃與野生桑黃中有效成分含量差距較大。本研究應用HPLC法評價不同桑黃提取物中的davallialactone、hypholomine B、inoscavin A含量，該方法簡便，結果準確，精密度、穩(wěn)定性、靈敏度高和重復性良好。通過對比這11種不同來源的桑黃樣品中3種含量較高的有效成分含量發(fā)現(xiàn)，桑黃中 davallialactone、hypholomine B、inoscavin A含量與桑黃生長環(huán)境、生長年份以及培育方式有關，該研究為桑黃的質(zhì)量控制及相關藥物研發(fā)提供一定試驗依據(jù)。