響應(yīng)面法優(yōu)化女貞子原花青素提取工藝及抗氧化研究

郗艷麗，周旋，霍明洋，高銳，馬一芯，楊闊，徐斌，*

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院，吉林吉林132013）

%女貞子原產(chǎn)于長江流域，主要在華南、河南、陜西、甘肅等地種植。后來被引入北方[1]。目前女貞子在氣候適宜的地區(qū)均有種植，資源非常豐富。女貞子有滋補(bǔ)肝腎、養(yǎng)陰、止血的功效[2]。臨床上常用于治療肝腎陰虛、頭暈、耳鳴、咽喉干燥、腰膝酸痛、月經(jīng)過多[3-4]。女貞子表皮呈黑褐色或黑紫色，這些黑褐色或黑紫色物質(zhì)中富含原花青素。原花青素是一類多酚化合物的統(tǒng)稱，主要存在于植物的花、果實(shí)、種子及外皮中[5]，其中葡萄籽和松樹皮中原花青素的含量極高[6]。原花青素在抗氧化方面具有無可比擬的優(yōu)勢，能有效清除機(jī)體內(nèi)的自由基[7]，其清除自由基的能力是維生素E的50倍，Vc的20倍[8]，有明顯的抗菌、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、保護(hù)血管、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、增強(qiáng)機(jī)體抗輻射能力等功能[9-11]。

目前，從植物中分離原花青素的方法主要有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法、酶輔助提取法等[12]。傳統(tǒng)的溶劑提取法雖能獲得原花青素，但存在提取率較低、溶劑消耗量大、提取時(shí)間較長等不足之處。超聲輔助提取法作為提取植物活性物質(zhì)的新技術(shù)不僅具有操作簡單、安全、節(jié)能、高效等優(yōu)點(diǎn)，而且具有提取時(shí)間短、無需加熱的特點(diǎn)，可有效減少原花青素等熱敏物質(zhì)在提取時(shí)的結(jié)構(gòu)改變。近年來女貞子黃酮、多糖提取物抗氧化活性方面研究較多[13-14]，但女貞子原花青素抗氧化活性方面研究鮮見報(bào)道。因此，本研究以女貞子原花青素含量為評價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝，并分析女貞子原花青素對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除作用，評價(jià)本研究方法提取的原花青素的生物活性，為女貞子的研究、開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

女貞子：吉林市某藥房，產(chǎn)地為湖南；原花青素（生產(chǎn)批號：B21615）：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：Sigma公司；維生素C（Vc）：上海生工有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS224S電子天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；722型可見光分光光度計(jì)：上海菁華科技有限公司；KQ-800KDE高功率超聲波清洗器：昆山舒美公司；EV311旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：北京萊伯泰科公司。

1.3 女貞子原花青素的提取工藝流程

取女貞子藥材適量，粉碎后過60目篩。稱取女貞子粉末1.0 g，置于燒杯中，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶劑超聲輔助提取，冷卻后5 000 r/min離心20 min，取上清，移入60 mL容量瓶中，用乙醇定容至60 mL，獲得原花青素粗提液。

1.4 女貞子原花青素的含量測定

1.4.1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于10 mL容量瓶中，加適量50%乙醇超聲（頻率：50 kHz，功率：500 W）充分溶解，冷卻后以50%乙醇補(bǔ)足至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.4.2 最大吸收峰的確定

精密吸取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品提取液各1.0mL，以50%乙醇調(diào)零，用紫外分光光度計(jì)在200nm～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，記錄掃描圖譜并對比掃描圖譜。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取1.0 mg/mL的原花青素溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mL，加入 50%乙醇至 1.0 mL，分別加入體積比為95∶5的正丁醇-鹽酸溶液6.0 mL和2%硫酸高鐵銨溶液0.2 mL，搖勻并定容至10 mL，沸水浴加熱40 min，顯色后立即使用冰水冷卻，550 nm處比色測定，用同等體積的50%乙醇代替標(biāo)準(zhǔn)品作為空白對照，繪制原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=0.855 1x-0.001 5（x為原花青素標(biāo)準(zhǔn)品濃度，mg/mL；y為吸光度值），R2=0.999 2。

1.4.4 女貞子粗提液中原花青素提取率的計(jì)算

精確稱取1.0 g女貞子粉末，按1.3方法進(jìn)行提取，按照1.4.3的方法顯色，用同等體積的50%乙醇代替標(biāo)準(zhǔn)品作為對照，將測定吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得粗提液樣品中原花青素的質(zhì)量濃度，代入下列公式求得女貞子中原花青素提取率。

式中：ρ為粗提液樣品中原花青素的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為粗提液定容后的體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為女貞子的質(zhì)量，g。

1.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對女貞子中原花青素提取條件所涉及到的4個(gè)因素（液料比、提取時(shí)間、超聲功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)）進(jìn)行了考察，每個(gè)因素選取3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，得出最佳提取條件。1）液料比設(shè)定為 10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1（mL/g）；2）提取時(shí)間設(shè)定為 10、20、30、40、50、60 min；3）超聲功率設(shè)定為 320、400、480、540、640、720 W；4）乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)定為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%。

1.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behenken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以女貞子提取液中原花青素提取率為響應(yīng)值，以提取時(shí)間、超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比為因變量進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)（見表1），優(yōu)化超聲波輔助提取女貞子原花青素工藝參數(shù)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Design of factors and levels of response surface test

1.7 原花青素抗氧化試驗(yàn)

1.7.1 女貞子原花青素粗提物對DPPH自由基的清除作用

參照Vattem等[15]的方法并稍作修改。精密稱取DPPH試劑4.5 mg，加無水乙醇溶解，棕色容量瓶定容至100 mL，濃度為0.08 mol/L，避光保存?zhèn)溆?。分別取濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L 和 1.0 mg/L 的樣品溶液1.0 mL，置于10 mL試管中，加入2.0 mL的DPPH溶液，30℃、避光反應(yīng)40 min后，517 nm測定吸光度值，計(jì)算DPPH自由基的清除率，VC作為陽性對照。

式中：A1為1.0 mL樣品溶液+2.0 mL DPPH溶液的吸光度值；A2為1.0 mL樣品溶液+2.0 mL蒸餾水的吸光度值；A3為1.0 mL蒸餾水+2.0 mL DPPH溶液的吸光度值。

1.7.2 女貞子原花青素粗提物對·OH的清除作用

參照尤小梅等[16]和張鏡等[17]的方法并稍作修改，在比色管中依次加入濃度為0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L和1.0 mg/L的女貞子原花青素粗提物溶液，再加入1.0 mL 9 mmol/L的硫酸亞鐵、1.0 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、1.0 mL 8.8 mmol/L的過氧化氫溶液。經(jīng)37℃水浴反應(yīng)0.5 h后，以蒸餾水作為參比，于510 nm下測定吸光度。按公式計(jì)算對·OH的清除率：

式中：A1為不加女貞子原花青素粗提物溶液的空白對照液的吸光度；A2為加入女貞子原花青素粗提物溶液后的吸光度；A3為無顯色劑時(shí)提取劑本底吸光度。

1.7.3 女貞子原花青素粗提物對O2-·的清除作用

參照徐懷德等[18]的方法并稍作修改，女貞子原花青素粗提物對O2-·的清除作用采用鄰苯三酚自氧化法進(jìn)行測定，取 4.5 mL、pH 8.2、50 mmol/L 的 Tris-HCl緩沖液，4.2mL超純水，混勻后25℃保溫30min。加入25℃預(yù)熱的3 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL（以10 mmol/L HCl配制）和1.0 mL超純水，于325 nm下每隔30 s測定吸光度值，計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加?？瞻坠苡玫润w積蒸餾水代替樣品溶液，用10 mmol/L的HCl代替鄰苯三酚溶液。樣品活性測定：在加入鄰苯三酚前，分別加入為濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L 和 1.0 mg/L的原花青素粗提物溶液1.0 mL，然后按鄰苯三酚自氧化法測定的方法操作，按公式計(jì)算清除率：

式中：A0為鄰苯三酚自氧化速率吸光度值；A1為加入原花青素樣品后的鄰苯三酚自氧化速率吸光度值。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件作圖，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件，分別對單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)和響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，回執(zhí)單因素變化趨勢圖、建立線性回歸方程并判斷模型顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

原花青素在不同波長下的吸光度見圖1。通過研究發(fā)現(xiàn)原花青素提取液與標(biāo)準(zhǔn)品溶液在550 nm處有共同最大吸收峰。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取時(shí)間對原花青素提取率的影響

圖1 原花青素在不同波長下的吸光度Fig.1 Absorbance of proanthocyanidins at different wavelengths

提取時(shí)間對原花青素的提取率有很大影響。提取時(shí)間不足會造成提取不充分；提取時(shí)間太長，原花青素可能會降解，造成提取率下降，原花青素的生物活性也可能會因?yàn)樘崛r(shí)間太長而降低[19]。提取時(shí)間對原花青素提取率的影響見圖2。

提取時(shí)間在30 min時(shí)，原花青素的提取率達(dá)到最大值，為（1.93±0.13）%。在提取時(shí)間為 10 min～20 min之間，提取率不高，可能與提取時(shí)間不足有關(guān)。提取時(shí)間不夠，超聲的作用沒能發(fā)揮最大作用，當(dāng)提取時(shí)間超過30 min以后，原花青素提取率略有下降，這可能與提取時(shí)間太長有關(guān)，提取時(shí)間太長，提取的原花青素發(fā)生降解而被破壞。所以提取時(shí)間暫定為30 min。

圖2 提取時(shí)間對原花青素提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of proanthocyanidins

2.2.2 超聲功率對原花青素提取率的影響

超聲的空化作用能使細(xì)胞碎裂，且超聲具有攪拌和振蕩作用，有利于液料的充分接觸，促進(jìn)胞內(nèi)有效成分溶出[20]。但當(dāng)超聲功率增大到一定程度，會造成液體出現(xiàn)空化泡，減少能量傳遞，不利于原花青素的提取[21]。超聲功率對原花青素提取率的影響見圖3。

圖3 超聲功率對原花青素提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the yield of proanthocyanidins

超聲功率在350W～400 W范圍內(nèi)，原花青素提取率隨超聲波功率的增大而上升，在400 W處達(dá)到最大值，提取率為（2.82±0.42）%。當(dāng)超聲功率達(dá)到400 W以后，提取率呈下降趨勢。故選擇超聲功率400 W為最佳提取條件。

2.2.3 液料比對原花青素提取率的影響

溶劑和原料在形成合適的比例時(shí)，有利于原花青素的溶出，提取率達(dá)到最高。溶劑與原料的比值增大，雖然有利于原花青素的浸出，但溶劑使用量過大，不僅會造成浪費(fèi)，還會給超聲作用帶來阻力，不利于原花青素的提取。液料比對女貞子原花青素提取率的影響見圖4。

圖4 液料比對原花青素提取率的影響Fig.4 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of proanthocyanidins

當(dāng)液料比為30∶1（mL/g）時(shí)，女貞子原花青素提取率達(dá)到最大值，為（2.18±0.19）%。當(dāng)液料比從30∶1（mL/g）增加到 60 ∶1（mL/g），原花青素提取率略有降低。從節(jié)能環(huán)保角度出發(fā)，選擇30∶1（mL/g）為最佳液料比。

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素提取率的影響見圖5。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對原花青素提取率的影響Fig.5 Effect of f ethanol concentration on the yield of proanthocyanidins

圖5結(jié)果顯示，隨著乙醇濃度不斷增大，原花青素提取率持續(xù)增加，可能與乙醇能促進(jìn)氫鍵斷裂有關(guān)。乙醇作用后能形成小分子的原花青素，從而使溶液中的原花青素提取率升高。當(dāng)乙醇濃度為40%時(shí)，原花青素提取率最高，達(dá)到（2.50±0.39）%。當(dāng)乙醇濃度高于40%，原花青素提取率逐漸下降，這可能與原花青素的極性較強(qiáng)有關(guān)，乙醇濃度太高會造成溶液極性弱，水溶性原花青素析出反而會減少有關(guān)。故選定40%的乙醇體積分?jǐn)?shù)為最佳提取條件。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 模型方程建立與顯著性檢驗(yàn)

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

通過Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸分析，得到回歸方程為Y=2.786+0.076A-0.066B+0.478C+0.068D+0.138AB-0.348AC+0.198AD-0.573BC-0.083BD-0.248CD-0.586A2-0.303B2-0.638C2-0.021D2。方差分析表見表3。

由表3可知，女貞子原花青素提取模型的P<0.05，表明該回歸模型是有效可靠的，達(dá)到了極顯著水平（P<0.001），用該模型對女貞子原花青素的提取工藝進(jìn)行試驗(yàn)分析是合理的。該模型失擬項(xiàng)的P值為0.407 5>0.05，不顯著，對模型有利。相關(guān)系數(shù)R2=0.8898，該模型能解釋88.98%響應(yīng)值的變化，校正系數(shù)R2Adj=0.779 6，變異系數(shù)值為11.54，說明該模型的可行度較好，可以用來分析女貞子原花青素的提取率。根據(jù)表3中F值的大小，推測影響本次試驗(yàn)提取率大小的因素為提取時(shí)間（A）>乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）>超聲功率（B）>液料比（C）。從表3中可以看出，二次項(xiàng)BC、A2、B2和C2對響應(yīng)值的影響極顯著（P<0.01）。

表3 方差分析表Table 3 The table of variance analysis

2.3.2 響應(yīng)面分析

圖6為影響女貞子原花青素提取率的各因素交互作用的響應(yīng)面圖。從響應(yīng)面分析圖可看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用。

等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，馬鞍形或者橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則表示不顯著。由圖6知，響應(yīng)面順著提取時(shí)間的方向陂度最大，結(jié)合方差分析，可以得到提取溫度在交互作用中對女貞子原花青素提取率的影響最顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲功率的影響次之，液料比的影響作用不顯著。

由Design-Expert 8.06軟件分析得出：在穩(wěn)定狀態(tài)下女貞子原花青素的提取率最大值為2.90%，此時(shí)的提取條件為提取時(shí)間33.32 min，超聲功率408.48 W，液料比27.03∶1（mL/g），乙醇濃度50%。理論預(yù)測女貞子原花青素的提取率為2.90%。以實(shí)際操作的方便考慮，將提取條件修正為提取時(shí)間33 min，超聲功率400 W，液料比 27∶1（mL/g），乙醇濃度 50%。

圖6 各自變量間交互作用對女貞子原花青素提取率的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface diagram of independent variable interaction effect to extraction yield of proanthocyanidins from Ligustrum lucidum ait

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)優(yōu)化的提取工藝，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果女貞子原花青素的提取率分別為2.91%、2.79%和2.85%，女貞子原花青素提取率的平均值為（2.85±0.06）%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.28%，與預(yù)測相對誤差為0.18%，表明該優(yōu)化方案穩(wěn)定可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2.5 原花青素抗氧化試驗(yàn)

2.5.1 女貞子原花青素粗提物對DPPH自由基的清除作用

女貞子原花青素粗提物對DPPH自由基的清除作用見圖7。

圖7 女貞子原花青素粗提物對DPPH自由基的清除作用Fig.7 The effect of proanthocyanidins from the Ligustrum lucidum ait on DPPH radical

由圖7可知，女貞子原花青素提取物對DPPH自由基有較好的清除作用。隨著女貞子原花青素提取物濃度的增加，其對DPPH自由基的清除率逐漸升高。女貞子原花青素提取物的濃度與DPPH自由基的清除率呈依賴性。女貞子原花青素提取物對DPPH自由基的清除效果顯著高于陽性對照物VC。

圖8 女貞子原花青素粗提物對·OH自由基的清除作用Fig.8 The effect of proanthocyanidins from the Ligustrum lucidum ait on hydroxyl radical

2.5.2 女貞子原花青素粗提物對·OH的清除作用

女貞子原花青素粗提物對·OH的清除作用見圖8。

由圖8可知，女貞子原花青素提取物對·OH有較好的清除作用。女貞子原花青素提取物的濃度與·OH的清除率呈依賴關(guān)系。女貞子原花青素對·OH的清除效果顯著高于陽性對照VC。當(dāng)女貞子原花青素提取物和VC的濃度增從0.6 mg/mL增加到1.2 mg/mL時(shí)，此時(shí)其對·OH的清除率已接近飽和狀態(tài)，因而自由基的清除率變化不顯著。

2.5.3 女貞子原花青素粗提物對O2-·自由基的清除作用

女貞子原花青素粗提物對O2-·自由基的清除作用見圖9。

由圖9可知，女貞子原花青素提取物對O2-·有較好的清除作用。女貞子原花青素提取物的濃度與O2-·的清除率呈依賴關(guān)系。女貞子原花青素對O2-·的清除效果顯著高于陽性對照VC。

圖9 女貞子原花青素粗提物對O2-·自由基的清除作用Fig.9 The effect of proanthocyanidins from the Ligustrum lucidum ait on superoxide anion radical

3 結(jié)論

本研究利用響應(yīng)面分析法對女貞子原花青素的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。首先通過單因素試驗(yàn)，觀察了提取時(shí)間、超聲功率、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)因素對女貞子原花青素提取率的影響。在此基礎(chǔ)上，采用三因素四水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)化得出女貞子原花青素最佳的提取工藝是提取時(shí)間33 min，超聲功率400 W，液料比27∶1（mL/g），乙醇濃度 50%。經(jīng)方差分析顯示模型擬合度較高。通過驗(yàn)證性試驗(yàn)證實(shí)在最優(yōu)條件下原花青素的提取率達(dá)2.85%，與預(yù)測值2.90%十分接近。由此可見，該模型能有效指導(dǎo)女貞子原花青素提取工藝條件的優(yōu)化，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化女貞子原花青素提取工藝在實(shí)踐上是可行的。此外，本研究結(jié)果還表明，當(dāng)原花青素濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對DPPH自由基的清除率可達(dá)到97%；對O2-·的清除率可達(dá)到60.14%；對·OH的清除率可達(dá)到78.88%。女貞子原花青素提取物具有良好的體外抗氧化活性。