紫果西番蓮皮中多酚組成及其抗氧化活性研究

張玲，吳曉穎，黃啟慧，李春海，*，陳淇，鐘育南

（1.廣東石油化工學(xué)院廣東省嶺南特色果蔬加工及應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，廣東普通高校食品科學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，廣東高校果蔬加工與貯藏工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東茂名525000；2.廣東石油化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東茂名525000）

西番蓮（Passiflora edulis），西番蓮科西番蓮屬，原產(chǎn)于巴西，能散發(fā)出石榴、菠蘿等多種水果的綜合風(fēng)味，又稱百香果[1]。富含維生素、膳食纖維、碳水化合物等營養(yǎng)成分，多酚物質(zhì)、黃酮類化合物、生物堿等生物活性成分含量也極其豐富。在我國的兩廣地區(qū)、海南、臺(tái)灣等地區(qū)種植歷史悠久[2]。

西番蓮果實(shí)可用于制作果汁、果醬、果脯等制品，用途廣泛[3]。西番蓮果皮占整果質(zhì)量的一半，利用率卻不高，造成極大的浪費(fèi)。果皮中多酚物質(zhì)含量豐富，具有廣闊的研究前景。近年來，大量研究表明多酚物質(zhì)具有舒緩壓力、延緩衰老、預(yù)防心腦血管疾病、預(yù)防癌癥、抗膽堿能等功效[4-6]。

目前，我國對(duì)西番蓮果皮營養(yǎng)物質(zhì)的研究多在對(duì)果皮中的果膠、膳食纖維、黃酮和多糖等的提取及工藝優(yōu)化，對(duì)多酚物質(zhì)的提取及抗氧化研究較少。李霞等[7]通過微波輔助法對(duì)西番蓮果皮多糖進(jìn)行提取并進(jìn)行體外抗氧化活性研究。楊丹等[8]采用響應(yīng)面法對(duì)提取果皮中的總黃酮進(jìn)行了工藝優(yōu)化。程明明等[9]分析了兩種超微粉碎法對(duì)果皮中水不溶性膳食纖維的改性研究效果。

本試驗(yàn)主要通過液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)對(duì)西番蓮果皮中多酚物質(zhì)進(jìn)行定性分析，評(píng)價(jià)了多酚粗提物清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的能力，并研究了對(duì)花生油的抗氧化效果，為西番蓮果皮多酚物質(zhì)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茂名本地新鮮紫皮西番蓮，色澤鮮艷，無腐爛無病變無霉變。

無水乙醇：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；三氯化鐵、沒食子酸、硫酸亞鐵、水楊酸、鄰苯三酚（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；香草醛：阿拉??；福林酚試劑：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；過氧化氫（30%，分析純）：天津市百世化工有限公司。

DHG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海申光儀器儀表有限公司；SL-1000A型高速多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市松青五金廠；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；LGJ-10C型冷凍干燥機(jī)：四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展（北京）有限公司；722N可見光分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；UPLC1290-6540BQ-TOF超高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫公司。

1.2 紫果西番蓮皮多酚的提取及得率測(cè)定

1.2.1 紫皮西番蓮果皮多酚提取及干燥

參考馬于然等[10]報(bào)道的紫果西番蓮皮多酚提取方法。稱取一定量的西番蓮果皮粉，按照料液比為30mL/g加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液，在40℃下恒溫提取150 min，抽濾后，將提取液進(jìn)行旋蒸濃縮，最后冷凍干燥制得多酚醇提物。

1.2.2 多酚得率的測(cè)定

1.2.2.1 多酚含量的測(cè)定

采用福林酚比色法，根據(jù)燕雪花等[11]方法略有修改。

稱取0.100 g沒食子酸，用蒸餾水溶解，配制成0.001 g/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。吸取1.00 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和福林酚試劑于10 mL顯色管中，混合搖勻，于1 min內(nèi)加入3 mL10%Na2CO3溶液，加水至刻度，暗處放置反應(yīng)1 h，同時(shí)用蒸餾水做參比溶液，在波長(zhǎng)700 nm～900 nm范圍內(nèi)掃描確定最大吸收波長(zhǎng)。

準(zhǔn)確吸取 0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，其余操作同上，于最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

準(zhǔn)確吸取蒸餾水、樣品溶液各1.00 mL于10mL顯色管中混合均勻，再加3 mL10%Na2CO3溶液，避光反應(yīng)1 h后在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，并根據(jù)線性方程計(jì)算得出多酚濃度。

1.2.2.2 多酚得率的測(cè)定

多酚得率計(jì)算公式如下：

式中：H為多酚得率，%；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線多酚濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；N為西番蓮果皮樣品質(zhì)量，g。

1.3 多酚粗提取物的定性檢驗(yàn)

取0.100 g干燥后的紫果西番蓮皮醇提物于試管中，然后加入10 mL蒸餾水，充分溶解，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液。

1.3.1 三氯化鐵反應(yīng)

取3 mL質(zhì)量濃度為10 mg/mL的多酚溶液于試管中，加入幾滴1%三氯化鐵溶液，觀察并記錄現(xiàn)象[12]。

1.3.2 三氯化鐵-乙醇反應(yīng)

取3 mL質(zhì)量濃度為10mg/mL的多酚溶液于試管中，加入適量2%三氯化鐵-乙醇溶液，同時(shí)提取液與溴水反應(yīng)，觀察并記錄現(xiàn)象[13]。

1.3.3 香草醛-鹽酸反應(yīng)

取3 mL質(zhì)量濃度為10 mg/mL的多酚溶液于試管中，加入適量香草醛-鹽酸溶液，觀察并記錄現(xiàn)象[13]。

1.4 紫果西番蓮皮乙醇提取物多酚成分的液質(zhì)分析

1.4.1 紫皮西番蓮多酚前處理

多酚樣品前處理方法參考張玲等[14]略有修改，取樣品適量，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)樣。

1.4.2 液質(zhì)聯(lián)用分析條件

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC） 條件：Agilent1290/maXis impact；Agilent eclipse plus C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；檢測(cè)器：Agilent-DAD檢測(cè)器；進(jìn)樣器：G4226A；二元泵：G4220A；柱溫：30 ℃；流速：0.200 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL流動(dòng)相：甲醇∶0.100%甲酸水=15∶85（體積比）。

四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（quadrupole time-offlight mass spectrometry，Q-TOFMS/MS）條件：MS QTOF-G6540B；ESI源：全掃描質(zhì)譜負(fù)離子模式，載器溫度350℃；負(fù)離子模式荷質(zhì)比掃描范圍：100 m/z～1 000 m/z；毛細(xì)管電壓：100 V；霧化壓力：35.000 psi；干燥氣流量10 L/min；干燥氣溫度：300℃。

1.5 抗氧化活性研究

1.5.1 清除羥基自由基能力

參考袁磊等[15]方法略有修改。取6支試管編號(hào)，每支試管同時(shí)加入1 mL 3 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 3 mmol/L水楊酸，1號(hào)試管加入水作為對(duì)照，其它試管分別加入梯度為 0.050 mg/mL的0.050 mg/mL～0.250 mg/mL 多酚樣液 1 mL，2 mL 3 mmol/L H2O2，37 ℃水浴30 min。與此同時(shí)用10倍濃度的VC溶液進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，于510 nm處測(cè)定吸光值。

式中：A1為空白對(duì)照組吸光度；A2為多酚樣液吸光度。

1.5.2 清除DPPH自由基能力

參考唐福才等[16]和覃麗等[17]方法略有修改。取6支試管編號(hào)，2 號(hào)～6 號(hào)試管加入 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的多酚樣液，加2 mL 0.1 mmoL/L DPPH溶液。1號(hào)試管加入2 mL無水乙醇和2 mL DPPH自由基溶液作為空白對(duì)照，以無水乙醇為參比，在517 nm處進(jìn)行吸光值測(cè)定。配制質(zhì)量濃度梯度為2 μg/mL的4 μg/mL～12 μg/mL VC溶液進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。

式中：Ac為2 mL DPPH溶液+2 mL多酚樣液的吸光值；Ai為2 mL多酚樣液+2 mL無水乙醇的吸光值；As為2 mL DPPH溶液+2 mL無水乙醇的吸光值。

1.5.3 清除超氧陰離子自由基能力

采用鄰苯三酚法進(jìn)行清除超氧陰離子自由基能力測(cè)定，參考張志軍等[18]和黃健文等[19]方法。取6支試管編號(hào)1～6，加入7 mL Tris-HCl緩沖液，25℃水浴10 min。1號(hào)試管加入1 mL蒸餾水，2號(hào)～6號(hào)加入1、2、3、4、5 mg/mL 多酚樣液 1 mL，水浴 5 min。在 320 nm處測(cè)定吸光值，同時(shí)用等濃度VC溶液進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。

式中：A1為空白對(duì)照組吸光度；A2為多酚樣液吸光度。

1.6 紫果西番蓮皮多酚抗氧化性質(zhì)的應(yīng)用研究

1.6.1 油脂的加速氧化試驗(yàn)

脂肪的初級(jí)氧化產(chǎn)物是氫過氧化物，多酚等作為抗氧化劑可延緩油脂的抗氧化過程，本試驗(yàn)參考左映平等[20]試驗(yàn)方法略有修改。采用烘箱法進(jìn)行油脂的加速氧化試驗(yàn)。分別取處理過的花生油和未經(jīng)處理的花生油30 g于廣口瓶中，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笾糜冢?0±1）℃的恒溫干燥箱中加速氧化過程，每隔12 h攪拌混合均勻并交換位置，每1天取樣測(cè)定POV值，并計(jì)算抑制率。

1.6.2 過氧化值（peroxide value，POV值）的測(cè)定和抑制率的計(jì)算

根據(jù)GB 5009.227-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中過氧化值的測(cè)定》植物油脂POV值測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，以1 kg樣品中活性氧的毫摩爾數(shù)計(jì)算過氧化值。

抗氧化劑對(duì)油脂氧化的抑制率按下面公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：X為添加抗氧化劑油樣的POV值；Y為未添加抗氧化劑油樣的POV值。

1.6.3 西番蓮果皮多酚的抗氧化作用

準(zhǔn)確稱取30g花生油3份，按照質(zhì)量比為0.250%、0.500%、0.750%分別加入干燥的果皮多酚醇提物，攪拌均勻后置于恒溫箱中保存，后續(xù)操作如1.6.1，分別測(cè)定花生油的過氧化值和抑制率。

1.6.4 兒茶素抗氧化作用的陽性對(duì)照試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取30g花生油3份，按照質(zhì)量比為0.250%、0.500%、0.750%分別加入兒茶素，攪拌均勻后置于恒溫箱中保存，后續(xù)操作如1.6.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚粗提物的定性檢驗(yàn)

多酚粗提取物的顯色定性分析結(jié)果見表1，顯色試驗(yàn)照片見圖1。

表1 西番蓮皮多酚粗提取物的定性試驗(yàn)Table 1 Qualitative experiment of passionflower peel polyphenols

綜合表1中顏色特征和圖1照片結(jié)果分析，進(jìn)一步闡述西番蓮皮存在多酚物質(zhì)，可進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析及抗氧化活性研究。

2.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用質(zhì)量濃度為0.001 g/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在700 nm～900 nm以10 nm為間隔測(cè)吸光度，在760 nm處測(cè)得最大吸光度，結(jié)果如圖2。

圖1 西番蓮皮多酚粗提物的定性試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Qualitative experimental results of passionflower Peel Polyphenols

圖2 最大波長(zhǎng)掃描圖Fig.2 Maximum wavelength scan

在760 nm條件下以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作曲線，得到回歸方程為y=12.918x-0.0394，R2=0.992 3的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3。該曲線表明吸光度在0.2～0.8之間線性良好，對(duì)多酚物質(zhì)具有研究意義。

圖3 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of gallic acid

2.3 液質(zhì)聯(lián)用分析

多酚提取物經(jīng)過處理后進(jìn)入HPLC-ESI-MS系統(tǒng)進(jìn)行分離檢測(cè)，紫皮西番蓮多酚提取物的HPLC-ESIMS總離子流圖結(jié)果如圖4。

圖4 多酚提取物的HPLC-ESI-MS總離子流圖Fig.4 Total ion flow chart of polyphenol extract by HPLC-ESI-MS

由圖4可以看出，化合物的極性大小可能與保留時(shí)間有關(guān)，有些極性相對(duì)較強(qiáng)的化合物在柱上的保留時(shí)間較短，分離效果較不理想。但隨著時(shí)間的增加，色譜峰相鄰峰差距明顯，分離效果較好。色譜峰高低與總離子流強(qiáng)度、相對(duì)分子質(zhì)量成正比相關(guān)關(guān)系，總粒子流強(qiáng)度越高，相對(duì)分子質(zhì)量越大，色譜峰值越大。

結(jié)合孫慧等[21]和Soong等[22]研究進(jìn)行定性分析，根據(jù)主要色譜峰的保留時(shí)間、主要質(zhì)譜碎片峰、相對(duì)質(zhì)量大小和極性大小初步推測(cè)西番蓮果皮多酚分子式和種類，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表2。

表2 多酚提取物的HPLC-ESI-MS定性分析結(jié)果Table 2 Qualitative analysis of polyphenol extracts by HPLC-ESI-MS

在甲醇-甲酸-水流動(dòng)相中，共分離得到14種物質(zhì)，鑒別出13種物質(zhì)，另有一種無法鑒別。在這13種物質(zhì)中，有4種屬于黃酮醇類，分別為槲皮素、表沒食子兒茶素、蘆丁和山奈酚，有2種屬于異黃酮類，分別為白藜蘆醇和虎杖苷，有2種屬于酚酸類，分別為沒食子酸和表兒茶素，有2種屬于黃酮苷類，分別為異葒草苷和葒草苷，有3種屬于黃酮類，分別為木犀草素、牡荊素和異牡荊素。

2.4 抗氧化活性研究

2.4.1 清除羥基自由基能力

羥基自由基是活性氧自由基，半衰期極短，水楊酸環(huán)境下能迅速與提取物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，顏色深淺與吸光度大小呈反比關(guān)系[23]。以樣液和VC的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，羥基自由基的清除率為縱坐標(biāo)作雙X雙Y圖，如圖5。

結(jié)果表明，在該體系下，當(dāng)羥基自由基清除率同為30%時(shí)，VC的質(zhì)量濃度（2.5 mg/mL）約為西番蓮果皮多酚質(zhì)量濃度（0.25 mg/mL）的10倍，果皮多酚清除羥基自由基的能力遠(yuǎn)強(qiáng)于VC。從質(zhì)量濃度-自由基清除率方程來看，二者質(zhì)量濃度與自由基清除率之間有良好的線性相關(guān)性，從斜率可知，隨著質(zhì)量濃度的增大，果皮多酚對(duì)羥基自由基的清除率增速遠(yuǎn)大于VC。從IC50值來看，果皮多酚的IC50值為0.328 mg/mL，VC溶液的IC50值為3.305 mg/mL，這表明果皮多酚對(duì)羥基自由基清除效果相對(duì)顯著。

圖5 西番蓮果皮多酚清除羥基自由基能力Fig.5 The ability of polyphenols from passiflora edulis rind to scavenge hydroxyl radicals

2.4.2 清除DPPH自由基能力

DPPH自由基是一種以氮為中心的活潑自由基，在有抗氧化劑存在時(shí)能迅速地與之進(jìn)行配對(duì)并被其清除，因此是鑒定抗氧化能力實(shí)驗(yàn)室常用的研究方法[23]。以VC溶液為對(duì)照，果皮多酚對(duì)DPPH自由基清除能力見圖6。

圖6 西番蓮果皮多酚清除DPPH自由基能力Fig.6 Polyphenols from passiflora edulis rind scavenging DPPH free radicals

從圖6可知，多酚樣品液和VC溶液均具有清除DPPH自由基作用，兩種溶液質(zhì)量濃度與DPPH清除率具有良好的線性關(guān)系，VC的抗氧化能力比多酚樣品液強(qiáng)，欲達(dá)到相同的DPPH清除率，多酚樣品的質(zhì)量濃度約為VC溶液的40倍。從IC50值來看，多酚樣品溶液和VC溶液的IC50值分別為0.328、0.007 mg/mL，可見在該體系下，多酚清除自由基效果較不理想。

2.4.3 清除超氧陰離子自由基能力

O2-·屬于活性氧自由基，與羥基自由基相比活性較低，其自氧化反應(yīng)在320 nm處產(chǎn)生中間產(chǎn)物，加入抗氧化劑后產(chǎn)物的生成受到抑制，吸光度下降[15]，試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

圖7 西番蓮果皮多酚清除超氧陰離子自由基能力Fig.7 The ability of polyphenols from passiflora edulis rind to scavenge superoxide anion free radicals

結(jié)果表明，在320 nm下測(cè)多酚樣品液及VC溶液吸光度，兩種溶液的吸光度在0.2～0.8之間線性良好，多酚提取液清除率曲線擬合度為R2=0.991 6，VC清除率擬合曲線擬合度為R2=0.993 7。由圖7可得，在該體系下，兩種溶液均對(duì)鄰苯三酚生成中間產(chǎn)物有抑制作用，阻礙了鄰苯三酚自氧化作用，在同質(zhì)量濃度下，多酚提取液的抗氧化能力較樣品液強(qiáng)，多酚抗氧化效果較為穩(wěn)定，呈平穩(wěn)趨勢(shì)增長(zhǎng)。本試驗(yàn)體系下，多酚提取液的IC50值為0.696 mg/mL，VC溶液的IC50值為15.850 mg/mL?？傮w而言，多酚的抗氧化效果較VC好。

2.5 西番蓮果皮多酚對(duì)花生油抗氧化的作用

花生油富含不飽和脂肪酸，營養(yǎng)價(jià)值高，但也易于發(fā)生氧化產(chǎn)生異味，并生成對(duì)人體有害的過氧化物，而多酚作為常見的抗氧化劑，可被添加到油脂中防止油脂酸敗[24]。本試驗(yàn)中，西番蓮果皮多酚對(duì)于花生油的抗氧化效果如圖8。

由圖8試驗(yàn)結(jié)果分析，西番蓮果皮多酚對(duì)油脂有一定的抗氧化作用，且隨著果皮多酚濃度的增大而增強(qiáng)，但總體抗氧化效果略差于兒茶素。在第1天，果皮多酚和兒茶素均抑制了花生油的氧化作用，兒茶素的抑制作用強(qiáng)于果皮多酚。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，果皮多酚對(duì)花生油的抗氧化作用平緩增加，兒茶素增長(zhǎng)較為不明顯。在第5天，果皮多酚抗氧化作用開始變得不顯著，添加了不同濃度果皮多酚的油樣POV值降到了4 mmol/kg～5 mmol/kg，這可能是由于果皮多酚對(duì)活性氧自由基捕捉速度減慢，使其清除自由基的能力下降。兒茶素在第4天抗氧化效果開始明顯下降，第5天時(shí)添加了0.25%的兒茶素抗氧化作用與添加了0.75%的多酚相近，后續(xù)效果平緩。以兒茶素為對(duì)照，西番蓮果皮多酚對(duì)花生油的抗氧化效果雖不及兒茶素，但也具有較好的保護(hù)作用，0.75%的用量可使花生油在試驗(yàn)條件下48 h內(nèi)保持POV值基本穩(wěn)定不變，氧化抑制率達(dá)到33.33%，且抗氧化作用隨用量的增大而增強(qiáng)。

圖8 西番蓮果皮多酚對(duì)花生油的抗氧化研究Fig.8 Antioxidant activity of passionflower peel polyphenols on peanut oil

3 結(jié)論

紫果西番蓮果皮中含有豐富的多酚物質(zhì)，本試驗(yàn)通過液質(zhì)聯(lián)用分析方法定性分析了紫果西番蓮果皮乙醇提取物中多酚的種類，鑒定出13種多酚物質(zhì)，為西番蓮果皮多酚的深入研究提供了參考。以VC為參照，選擇清除羥基自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基能力3個(gè)項(xiàng)目，分析比較了西番蓮果皮多酚提取物的體外抗氧化活性強(qiáng)弱，結(jié)果表明，在同等質(zhì)量濃度下，果皮多酚提取物對(duì)羥基自由基的清除能力優(yōu)于VC，對(duì)DPPH自由基清除能力弱于VC，對(duì)超氧陰離子自由基清除率優(yōu)于VC。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)西番蓮果皮多酚抗氧化性質(zhì)的應(yīng)用潛在價(jià)值，以花生油為抗氧化保護(hù)對(duì)象，對(duì)比了西番蓮果皮多酚與抗氧化性質(zhì)較強(qiáng)的兒茶素對(duì)花生油的抗氧化作用，結(jié)果顯示，同等用量情況下，西番蓮果皮多酚對(duì)花生油的抗氧化作用雖不及兒茶素，但也有較好的抗氧化效果，0.75%的用量可使花生油在試驗(yàn)條件下48 h內(nèi)保持POV值基本穩(wěn)定不變。由此可見，紫果西番蓮皮多酚物質(zhì)具有較好的抗氧化活性，可作為抗氧化劑應(yīng)用于油脂的抗氧化。