藍(lán)莓葉總黃酮對LPS/D-GalN誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

焦豪妍，許夢怡，師大智，湯慶發(fā)，*

（1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，廣東廣州510520；2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州510515；3.廣東省中藥制劑重點實驗室，廣東廣州510515）

急性肝損傷可由多種因素引起，如病毒、毒素和藥物濫用等[1]，其主要表現(xiàn)為肝臟功能的喪失和代謝障礙、體內(nèi)環(huán)境失衡等。急性肝損傷的持續(xù)發(fā)展會導(dǎo)致肝功能衰竭，死亡率極高[2]。近年來，由于藥物濫用，急性肝損傷在我國的發(fā)病率逐年增加，因此研究及開發(fā)預(yù)防或治療急性肝損傷的有效藥物具有十分重要的臨床意義。

藍(lán)莓（Vaccinium corymbosum L.），又名越橘，是越橘屬的多年生落葉或常綠灌木，研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓具有抗氧化、清除自由基、抗癌、降血壓、降血脂、降血糖等多種生物活性，在世界各地被廣泛用作保健品[3-8]。目前對藍(lán)莓的研究開發(fā)主要都是針對藍(lán)莓果實，較少對藍(lán)莓葉進(jìn)行深入研究。前期研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓葉含有豐富的黃酮類化合物，藍(lán)莓葉總黃酮（flavonoids of blueberry leaf，F(xiàn)BL）具有良好的抗炎活性[9]；同時研究發(fā)現(xiàn)，灌胃給予小鼠FBL后，小鼠肝臟血漿中FBL濃度較高。據(jù)此推測，F(xiàn)BL可能具有保肝作用。因此，本研究采用脂多糖（lipopolysaccharid，LPS）/氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型，首次考察FBL對肝臟的保護(hù)作用，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級昆明小鼠（南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物研究中心提供）60只，雄性，體重18 g～22 g，許可證編號為SCKX（粵）2011-0015。實驗動物每日自由攝取去離子水和標(biāo)準(zhǔn)詞料，實驗開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。

1.2 材料與試劑

藍(lán)莓葉：南京金瑞藍(lán)莓專業(yè)合作社；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）：廣州賽國生物科技有限公司；D-GalN：東京化成工業(yè)株式會社（Tokyo Chemical Industry）；D101 大孔樹脂、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）試劑盒、白細(xì)胞介素-6（IL-6）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒：上海源業(yè)生物科技有限公司；石油醚、乙醇、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；實驗用水均為超純水。

1.3 主要儀器

Zokia HC-3018R型高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器公司；PL602-S型電子天平：上海梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司；GC03型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海申生科技有限公司；CA-1111型冷卻水循環(huán)裝置：上海愛朗儀器有限公司；A-1000S型水循環(huán)真空泵：上海埃朗科技國際貿(mào)易有限公司；KH-500DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司：Thermo FC酶標(biāo)儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；JB-P5型石蠟包埋機：武漢俊杰電子有限公司；RM2016型切片機：上海徠卡儀器有限公司；KD-P組織攤片機：浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；NIKON ECLIPSE CI正置光學(xué)顯微鏡、NIKONDS-U3成像系統(tǒng)：日本尼康（Nikon）公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 FBL的提取

將藍(lán)莓葉打粉稱重，加入20倍的石油醚回流提取0.5 h，過濾，除去濾液，收集濾渣，加入相等體積的70%乙醇回流提取1.5 h，過濾，取濾液棄濾渣，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至流浸膏狀。

大孔樹脂用95%乙醇浸泡1 d后裝柱，再用95%的乙醇淋洗至無白色，分別用5%鹽酸和2%氫氧化鈉浸泡洗至中性。上述流浸膏濕法上樣過大孔樹脂柱，分別使用70%乙醇和95%乙醇沖柱子，收集不同乙醇濃度梯度的溶液。70%乙醇收集液為FBL。

1.4.2 動物給藥及造模

120只小鼠隨機分成6組，即空白組、模型組、陽性組（聯(lián)苯雙酯 5 mg/kg）及 FBL低（5 mg/kg）、中（10 mg/kg）、高（20 mg/kg）劑量組，各組灌胃給藥，陽性組給予聯(lián)苯雙酯滴丸5 mg/kg，空白組和模型組給予等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。最后一次給藥2 h后，除空白組外，其余各組小鼠腹腔注射LPS（8 mg/kg）和D-GalN（800mg/kg）制備急性肝損傷模型。造模10h后每組10只動物取標(biāo)本檢測相關(guān)指標(biāo)，留10只測定存活率。

1.4.3 樣本采集及指標(biāo)測定

1.4.3.1 小鼠生存情況及存活率的計算

觀察并記錄小鼠24 h內(nèi)的生存情況，計數(shù)6、12、18 h和24 h各組的存活只數(shù)，并計算存活率。

1.4.3.2 樣本采集

小鼠存活10 h后，摘眼球取血，分離血清，保存于-20℃?zhèn)溆?。取肝臟組織，分成兩部分，一部分浸泡在10%福爾馬林中進(jìn)行病理檢查，另一部分保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3.3 血清肝功能活性檢測

為評價藥物對LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝功能的影響，測定取樣3 h內(nèi)的血清中AST和ALT的濃度水平，測定過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.3.4 肝臟組織中炎癥因子濃度的測定

取小鼠肝臟組織低溫勻漿，離心取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）按照試劑盒說明要求檢測IL-1β、IL-6和TNF-α水平，考察藥物對LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠炎癥的調(diào)節(jié)作用。

1.4.3.5 肝臟組織氧化損傷

氧化損傷是LPS/D-GalN所致肝損傷的主要問題之一，因此，測量FBL治療是否能改善LPS/D-GalN引發(fā)的氧化損傷。取小鼠肝臟組織勻漿并溶解在提取緩沖液中，測定MDA、GSH、SOD和CAT的水平，所有結(jié)果均通過每個樣品中的總蛋白濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4.3.6 肝臟形態(tài)學(xué)觀察

取小鼠肝臟右葉組織，放入10%甲醛中固定浸泡，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察肝臟組織切片病理學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。采用雙尾t檢驗進(jìn)行兩組樣本均數(shù)比較分析，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠存活率觀察

各組小鼠24 h存活率結(jié)果見表1。LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型死亡率很高，24 h的存活率為0。各給藥組小鼠存活性均提高，其中FBL高劑量組存活率達(dá)到了80%，說明FBL能顯著降低LPS/DGalN誘導(dǎo)產(chǎn)生的肝臟毒性。

表1 各組小鼠24 h存活率Table 1 24-hour survival rate of mice in each group

2.2 血清肝功能活性檢測

各組小鼠血清中AST和ALT測定結(jié)果見表2。與空白組比較，模型組小鼠血清AST和ALT水平均顯著升高（P＜0.01），說明LPS/D-GalN誘導(dǎo)致小鼠肝功能受損；與模型組比較，陽性藥組小鼠血清AST和ALT水平均顯著降低（P＜0.01），同時FBL高劑量組和中劑量組AST和ALT水平均顯著降低，而FBL低劑量組對AST和ALT水平無顯著影響。上述結(jié)果說明FBL對小鼠肝功能有恢復(fù)作用。

表2 FBL對急性肝損傷小鼠血清AST和ALT水平的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of FBL on the levels of ALT and AST in serum of mice with acute liver injury（±s，n=10）

表2 FBL對急性肝損傷小鼠血清AST和ALT水平的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of FBL on the levels of ALT and AST in serum of mice with acute liver injury（±s，n=10）

注：和空白組比較，##表示P<0.01，差異極顯著；和模型比較，*表示P<0.05，差異顯著；**表示P<0.01，差異極顯著；-表示給予生理鹽水。

組別劑量/（mg/kg）AST/（IU/L）ALT/（IU/L）空白組 - 61.63±3.28** 46.44±5.85**模型組 - 692.42±66.36## 454.63±46.48##聯(lián)苯雙酯組 5 315.65±15.31##** 88.45±3.21##**低劑量組 5 630.87±34.01## 424.66±8.82##中劑量組 10 487.25±24.478##* 259.62±8.29##**高劑量組 20 378.29±28.77##** 106.21±7.32##**

2.3 肝臟組織中炎癥因子濃度的測定

各組小鼠肝臟組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的濃度如表3所示。與空白組比較，模型組小鼠肝臟組織IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著升高（P＜0.01），說明LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠伴隨有炎癥的發(fā)生；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組小鼠肝臟組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，F(xiàn)BL低、中、高劑量組IL-1β水平均顯著降低（P＜0.01），且呈劑量依賴關(guān)系，同時，F(xiàn)BL低、中、高劑量組IL-6和TNF-α水平均顯著降低，說明陽性藥物和FBL均對炎癥有抑制作用。

表3 FBL對急性肝損傷小鼠肝組織中IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of FBL on levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in liver of mice with acute liver injury（±s，n=10）

表3 FBL對急性肝損傷小鼠肝組織中IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of FBL on levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in liver of mice with acute liver injury（±s，n=10）

注：和空白組比較，##表示P<0.01，差異極顯著；和模型比較，*表示P<0.05，差異顯著；**表示P<0.01，差異極顯著；-表示給予生理鹽水。

組別 劑量/（mg/kg）IL-1β/（ng/L）IL-6/（ng/L）TNF-α/（ng/L）空白組 - 29.76±0.65** 18.46±0.57** 60.56±12.70**模型組 - 206.43±27.06##100.36±5.52##528.54±30.92##聯(lián)苯雙酯組 5 98.25±7.51##**47.79±5.32##**339.59±54.26##**低劑量組 5 140.40±13.60##**81.78±6.01##*390.00±41.27##**中劑量組 10 114.20±13.00##**54.35±7.03##**422.45±48.73##*高劑量組 20 97.50±10.70##**53.24±8.17##**345.26±70.13##**

2.4 肝臟組織氧化損傷測定

肝臟組織氧化損傷測定結(jié)果如表4所示。與空白組比較，模型組中MDA的濃度顯著增加，說明LPS/GalN顯著增加了MDA的過度積累（P＜0.01），而MDA是自由基損傷的標(biāo)志。同時，與空白組比較，模型組中GSH、SOD和CAT的濃度顯著降低（P＜0.01），表明肝臟具有抗氧化能力。與模型組比較，F(xiàn)BL治療有效地逆轉(zhuǎn)了LPS/D-GalN引起的氧化損傷，其中FBL高中劑量組逆轉(zhuǎn)作用更顯著（P＜0.01）。上述結(jié)果表明FBL可通過抑制氧化應(yīng)激緩解LPS/D-GalN所致急性肝損傷。

2.5 肝臟形態(tài)學(xué)觀察

各組小鼠肝臟組織典型切片圖見圖1?？瞻捉M小鼠肝臟外觀色淡，邊緣滑潤，質(zhì)韌；鏡下見細(xì)胞大小均一，排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核位于肝細(xì)胞中央。模型組肝臟外觀顏色暗紅，有明顯腫脹、淤血；鏡下見肝臟組織病理損傷嚴(yán)重，肝細(xì)胞變性、胞漿內(nèi)充滿小空泡，且有明顯的肝臟出血和炎癥細(xì)胞浸潤。經(jīng)FBL給藥后，小鼠肝臟的外觀及顏色呈現(xiàn)明顯的好轉(zhuǎn)，病理檢查顯示肝細(xì)胞間隙減小，高劑量組充血和炎細(xì)胞浸潤狀況明顯改善，接近于恢復(fù)正常。

表4 FBL對急性肝損傷小鼠肝組織中MAD、GSH、SOD和CAT含量的影響（±s，n=10）Table 4 Effects of FBL on levels of MAD，GSH，SOD and CAT in liver of mice with acute liver injury（±s，n=10）

表4 FBL對急性肝損傷小鼠肝組織中MAD、GSH、SOD和CAT含量的影響（±s，n=10）Table 4 Effects of FBL on levels of MAD，GSH，SOD and CAT in liver of mice with acute liver injury（±s，n=10）

注：和空白組比較，#表示P<0.05，差異顯著；##表示P<0.01，差異極顯著；和模型比較，*表示P<0.05，差異顯著；**表示P<0.01，差異極顯著；-表示給予生理鹽水。

組別劑量/（mg/kg）MAD/（nmol/mg ptrotein）GSH/（μmol/g protein）SOD/（U/mg protein）CAT/（U/g protein）空白組 - 6.22±1.56** 16.34±4.01** 57.31±8.34** 956±102.3**模型組 - 18.51±3.06## 7.16+1.86## 24.75±5.40## 446±44.71##聯(lián)苯雙酯組 5 9.71±2.62#** 14.59±3.15** 50.88±7.43#** 901±88.94#**低劑量組 5 14.12±3.58##* 9.98±2.71##* 31.43±5.77##* 645±59.31##**中劑量組 10 12.99±2.81##** 12.72±3.2#** 53.31±7.45** 792±60.41##**高劑量組 20 9.45±2.36#** 14.63±2.94** 60.26±8.41** 923±81.45**

圖1 FBL對急性肝損傷小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響（HE，×200）Fig.1 Effect of blueberry leaf flavonoids on liver histopathology in acute liver injury mice（HE，×200）

3 討論與結(jié)論

在前期的研究中，通過超高效液相色譜/四極飛行時間質(zhì)譜（UPLC/Q-Tof-MS）鑒定了藍(lán)莓葉中的黃酮類化合物[9]。9種主要成分分別為楊梅素、蘆丁、鳶尾苷、槲皮素、有毒異黃酮、山奈酚、楊梅素-3′-鼠李糖苷和3，3′，4′，5，7-五羥基-6-（4-羥基芐基）-黃烷酮、花青素-3-（6′-丙二酰葡萄糖苷）。

LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷是一種典型的藥物性肝損傷，與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激有關(guān)，是評價藥物肝保護(hù)作用的常用實驗?zāi)Ｐ蚚10-11]。LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁的組成成分，是一種內(nèi)毒素，在肝臟組織中LPS與其結(jié)合蛋白結(jié)合成復(fù)合物，通過存在于目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞膜中的TLR4釋放炎癥因子，從而使肝細(xì)胞發(fā)生凋亡與壞死。D-GalN可通過消耗肝臟中的三磷酸尿苷，抑制生物大分子合成，引起肝臟炎癥反應(yīng)和肝細(xì)胞壞死。LPS對肝臟損傷的特異性不高，和D-GalN協(xié)同作用可導(dǎo)致動物的肝細(xì)胞在短時間內(nèi)大量死亡，肝臟生理功能嚴(yán)重受損[12-13]。本研究顯示，F(xiàn)BL可延長急性肝損傷小鼠的生存率和存活時間，改善肝臟組織的形態(tài)，降低血清中AST和ALT水平，說明FBL對肝臟有保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示模型組肝臟組織中炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α含量較空白組顯著升高，而這一現(xiàn)象能被FBL有效抑制，提示FBL對肝臟的保護(hù)作用與其抗炎作用相關(guān)。炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生主要受核因子kappa-B（NF-κB） 的調(diào)控，NF-κB 與其抑制性蛋白（IκB）結(jié)合，在肝細(xì)胞胞漿中以非活性形式存在。促炎性細(xì)胞因子、病毒等及其他因子，可觸發(fā)NF-κB的活化，催化IκB的磷酸化，進(jìn)而IκB/NF-κB復(fù)合物解離，導(dǎo)致NF-κB轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核從而促進(jìn)IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[14]。前期研究表明，F(xiàn)BL能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中NF-κBp65 和 P-NF-κBp65 的表達(dá)[9]。FBL 對 LPS/D-GalN誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用可能與抑制NF-κB信號通路有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

有研究指出，在急性肝臟損傷的發(fā)生及進(jìn)展過程中，肝臟內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致或者促進(jìn)損傷的發(fā)生，因此氧化損傷參與了急性肝損傷的發(fā)生和發(fā)展[15-16]。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，其水平被廣泛用作自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化損傷的標(biāo)志物[17-18]。經(jīng)LPS/D-GalN誘導(dǎo)后，產(chǎn)生大量過氧化氫，GSH過氧化物酶（GPx）利用兩分子的GSH催化過氧化氫的還原[19-20]。因此，在LPS/D-GalN過量的作用下，GSH在肝臟中被過度消耗。同時，由于酶和非酶的抗氧化機制是抗氧化損傷的重要防御途徑，還測定了抗氧化酶CAT和SOD的肝活性。本研究表明，模型小鼠肝臟組織中MDA水平顯著升高，而GSH、CAT和SOD的水平顯著降低，F(xiàn)BL能有效地抑制這些變化，說明FBL的保肝作用與其抗氧化活性有關(guān)。

綜上所述，本文的研究結(jié)果初步證明了藍(lán)莓葉總黃酮對LPS/D-GalN誘導(dǎo)小鼠的急性肝損傷具有明確的預(yù)防與保護(hù)作用，其作用機制可能是抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而預(yù)防和阻止肝損傷。