Xpert? Xpress Flu/RSV Assay用于臨床呼吸道感染病原學(xué)診斷的價(jià)值*

袁 穎，謝爭(zhēng)華，唐詩(shī)歡，陳滿君，范笑地，余 楠△

(1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部/廣東省突發(fā)傳染病病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510282；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院深圳醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518116；3.中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518107)

呼吸道感染是門診患者就診的常見(jiàn)原因[1]，病原體種類繁多，相關(guān)病毒有十余種，其中流感病毒(Flu)和呼吸道合胞病毒(RSV)是影響最廣泛、感染率最高的呼吸道感染病毒[2-5]。Flu擴(kuò)散極快，每年在一定區(qū)域暴發(fā)流行[6]，2018、2019年我國(guó)均有較大規(guī)模流行，2019年1月我國(guó)報(bào)道2018年感染Flu死亡人數(shù)超過(guò)2017年全年的3倍[7]。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，北半球每年約1億人感染Flu[8]。RSV則主要侵犯兒童，2～3歲兒童感染率幾乎為100%[9]，全球5歲以下兒童每年約3 300萬(wàn)感染RSV，占所有呼吸道感染病原體的20%，死亡人數(shù)為6.6萬(wàn)至19.9萬(wàn)[10-11]。呼吸道感染病毒檢測(cè)方法包含病毒分離、病毒抗原或抗體免疫學(xué)檢測(cè)及核酸檢測(cè)等。由于檢測(cè)成本、技術(shù)復(fù)雜程度、實(shí)驗(yàn)室條件要求較高等原因，以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為技術(shù)基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)等核酸分子檢測(cè)方法在基層醫(yī)院用于呼吸道感染病毒檢測(cè)并不現(xiàn)實(shí)[12]。近年來(lái)，針對(duì)呼吸道感染病毒檢測(cè)的反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)多重檢測(cè)儀器越來(lái)越多[13-14]，基于GeneXpert?平臺(tái)的3種呼吸道感染病毒組合多重檢測(cè)系統(tǒng)(Xpert?Xpress Flu/RSV Assay，以下簡(jiǎn)稱Xpress Flu/RSV)將核酸提取、PCR和結(jié)果判斷整合為一體，并實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化，較好地解決了技術(shù)操作煩瑣和生物安全防護(hù)的難題。本研究在2018年冬春季采用Xpress Flu/RSV對(duì)有急性呼吸道感染癥狀患者的鼻咽拭子標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，與普通PCR測(cè)序及自建RT-qPCR兩種方法進(jìn)行比較，評(píng)估其對(duì)主要呼吸道感染病毒的檢測(cè)能力，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年1月11日至5月9日南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院收治的具有發(fā)熱、咳嗽、鼻塞、流涕、咽喉疼痛、頭痛、肌肉痛等呼吸道感染癥狀的420例患者作為研究對(duì)象。患者年齡0～82歲，平均(20.3±10.5)歲；男233例(55.5%)，女187例(44.5%)；門診患者379例(90.2%)，住院患者41例(9.8%)；診斷主要包括呼吸道感染177例(42.1%)，肺炎67例(16.0%)，流感13例(3.1%)，咽炎/扁桃體炎5例(1.2%)，其他158例(37.6%)。本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后進(jìn)行，所有研究對(duì)象均自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2標(biāo)本采集 采用植絨拭子(Copan，意大利)采集所有研究對(duì)象鼻咽拭子，采集后放入密封采樣管(內(nèi)含3 mL病毒保存液)，置于冰盒內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室立即檢測(cè)，或4 ℃暫存(不超過(guò)24 h)進(jìn)行檢測(cè)，剩余標(biāo)本-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3Xpress Flu/RSV檢測(cè) 標(biāo)本振蕩混勻，一次性移液管吸取300 μL標(biāo)本至檢測(cè)盒標(biāo)本倉(cāng)，檢測(cè)盒掃碼后置于核酸檢測(cè)儀(Cepheid，美國(guó))，反應(yīng)34 min，自動(dòng)檢測(cè)并判定結(jié)果。引物和探針包括以下序列：甲型流感基質(zhì)(M)、甲型流感堿性聚合酶(PB2)、甲型流感酸性蛋白(PA)、乙型流感基質(zhì)(M)、乙型流感非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)、RSV A型(RSVA)和RSV B型(RSVB)核衣殼基因。每個(gè)檢測(cè)試劑盒均含有標(biāo)本處理質(zhì)控品(SPC)和探針檢查質(zhì)控品(PCC)。SPC用于質(zhì)控靶序列的充分提取和處理，監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)中是否存在抑制劑，即SPC在陰性標(biāo)本中應(yīng)為陽(yáng)性，在陽(yáng)性標(biāo)本中既可以為陰性，也可以為陽(yáng)性。PCC用于驗(yàn)證試劑的再水化，檢測(cè)盒中PCR管的填充、探針完整性和染料穩(wěn)定性。

1.4普通PCR測(cè)序 標(biāo)本提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，引物序列由Cepheid公司提供。普通PCR過(guò)程簡(jiǎn)述如下：反應(yīng)體系共25.0 μL，焦碳酸二乙酯(DEPC)處理并滅菌的MiliQ純水(DEPC水)5.5 μL，上下游引物混合物5.0 μL，360反應(yīng)混合物12.5 μL，cDNA模板2.0 μL。循環(huán)參數(shù)分為6種，(1)甲型流感病毒(FluA) M程序，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。(2)FluA PB2程序，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。(3)乙型流感病毒(FluB) M程序，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 1 min。(4)FluB NS程序，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。(5)RSVA程序，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。(6)RSVB程序，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳陽(yáng)性，進(jìn)行Sanger雙向測(cè)序。Sequencher4.1.4軟件分析結(jié)果并與參考序列比對(duì)。以擴(kuò)增產(chǎn)物有條帶，Sanger測(cè)序結(jié)果符合目標(biāo)序列時(shí)為陽(yáng)性。PCR測(cè)序由廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心完成。

1.5實(shí)驗(yàn)室自建18種(型/亞型)呼吸道感染病毒RT-qPCR法[15]Xpress Flu/RSV和普通PCR測(cè)序結(jié)果不一致標(biāo)本，采用自建方法確認(rèn)，以任意兩種方法結(jié)果一致為參考標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算診斷效能。簡(jiǎn)述如下：高純度病毒RNA試劑盒(Megan，中國(guó))提取核酸；RT-qPCR反應(yīng)體系共20.0 μL,TaqManTM快速病毒一步法檢測(cè)混合試劑(Invitrogen，美國(guó))5.0 μL，DEPC水7.5 μL，上下游引物各1.0 μL，探針0.5 μL，核酸模板5.0 μL；循環(huán)參數(shù)分為兩種：(1)呼吸道RNA病毒程序(FluA、FluA亞型H1N1-9、FluA亞型H3N2、FluB、副流感病毒1型、冠狀病毒1型、冠狀病毒OC43、冠狀病毒NL63、冠狀病毒229E、鼻病毒)，50 ℃ 10 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。(2)呼吸道DNA/RNA病毒共同程序(腺病毒、人博卡病毒、RSVA、RSVB、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、人偏肺病毒)，50 ℃ 10 min，95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以上述臨床分離毒株為陽(yáng)性質(zhì)控品，以采樣系統(tǒng)病毒培養(yǎng)液為陰性質(zhì)控品。采用ABI Vii7TM real time PCR儀檢測(cè)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，不同方法間的比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，Kappa檢驗(yàn)分析一致性；門診和住院兩類陽(yáng)性患者Ct值的比較采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1檢測(cè)總體情況 420例患者標(biāo)本中，Xpress Flu/RSV檢測(cè)陽(yáng)性213例(50.7%)，其中檢出單個(gè)病原體感染209例(49.8%)：FluA 61例(14.5%)，F(xiàn)luB 104例(24.8%)，RSV 44例(10.5%)；檢出兩種或以上病原體感染共4例(1.0%)，其中FluA+FluB陽(yáng)性1例(0.2%)，F(xiàn)luA+RSV陽(yáng)性3例(0.7%)。

420例患者標(biāo)本中，自建RT-qPCR檢測(cè)到其他呼吸道感染病毒15例(3.6%)，分別是鼻病毒10例(2.4%)，腸道病毒3例(0.7%)，腺病毒+鼻病毒+副流感病毒3型陽(yáng)性1例(0.2%)，人偏肺病毒陽(yáng)性1例(0.2%)。Xpress Flu/RSV和普通PCR測(cè)序?qū)@15例患者標(biāo)本進(jìn)行FluA、FluB、RSV檢測(cè)均為陰性。

2.2Xpress Flu/RSV檢測(cè)性能 以任意兩種方法結(jié)果一致為參考，Xpress Flu/RSV總靈敏度為100.0%(95%CI:97.8%～100.0%)，總特異度為99.7%(95%CI:99.1%～99.9%)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為98.6%(95%CI:95.7%～99.6%)和100.0%(95%CI:99.5%～100.0%)。檢測(cè)各病原體的靈敏度分別為FluA 100.0%(95%CI:93.1%～100.0%)，F(xiàn)luB 100.0%(95%CI:95.5%～100.0%)，RSV 100.0%(95%CI:90.4%～100.0%)；特異度分別為FluA 100.0%(95%CI:98.7%～100.0%),FluB 99.4%(95%CI:97.5%～99.9%)，RSV 99.7%(95%CI:98.3%～100.0%)；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為FluA 100.0%(95%CI:93.1%～100.0%)和100.0%(95%CI:98.7%～100.0%)，F(xiàn)luB 98.1%(95%CI:92.6%～99.7%)和100.0%(95%CI:98.5%～100.0%)，RSV 97.9%(95%CI:87.3%～99.9%)和100.0%(95%CI:98.7%～100.0%)。Xpress Flu/RSV檢測(cè)FluA的結(jié)果與參考方法完全一致；FluB和RSV分別有2例和1例Xpress Flu/RSV檢測(cè)為陽(yáng)性，參考方法為陰性。見(jiàn)表1。

2.3Xpress Flu/RSV與自建RT-qPCR的比較 420例患者標(biāo)本中有95例進(jìn)行了自建RT-qPCR檢測(cè)。對(duì)比分析結(jié)果，Xpress Flu/RSV與自建RT-qPCR的總陽(yáng)性符合率、陰性符合率均較高，分別為92.4%(95%CI:82.5%～97.2%)和100.0%(95%CI:97.9%～100.0%)，一致性強(qiáng)，Kappa值為0.949(P<0.001)。兩種方法檢測(cè)各病原體的Kappa值如下：FluA 0.957(P<0.001)，F(xiàn)luB 0.876(P<0.001)，RSV 0.978(P<0.001)，其中兩種方法檢測(cè)FluB的一致性低于另外兩種病原體，見(jiàn)表2。

表1 Xpress Flu/RSV診斷結(jié)果(n)

表2 Xpress Flu/RSV與自建RT-qPCR結(jié)果一致性分析

2.4門診和住院檢測(cè)陽(yáng)性患者Ct值的比較 經(jīng)Xpress Flu/RSV共檢測(cè)出陽(yáng)性患者213例，包括27例住院患者，186例門診患者，門診和住院兩類患者的Ct值進(jìn)行兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)。

3 討 論

呼吸道感染發(fā)病率極高，病原體種類繁多，引起的呼吸道感染臨床表現(xiàn)相似。明確病原體，對(duì)于避免濫用抗菌藥物[16]，及早開(kāi)展針對(duì)性的抗病毒治療，把握治療時(shí)機(jī)，判斷預(yù)后具有重要意義。

GeneXpert?快速分子診斷平臺(tái)對(duì)標(biāo)本制備和RT-PCR過(guò)程進(jìn)行了全自動(dòng)化。基于該技術(shù)平臺(tái)開(kāi)發(fā)的檢測(cè)項(xiàng)目目前以單項(xiàng)PCR為主，如金黃色葡萄球菌、結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥性檢測(cè)等[17-19]。Xpress Flu/RSV為三重PCR檢測(cè)，標(biāo)本用量少，檢測(cè)快速(34 min完成)，整個(gè)過(guò)程在封閉試劑盒中進(jìn)行，極大程度減少了污染的風(fēng)險(xiǎn)，自動(dòng)化程度高，隨到隨檢，可實(shí)現(xiàn)床邊和急診實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，為臨床篩查或病原學(xué)診斷提供了較好的選擇。

經(jīng)臨床標(biāo)本評(píng)估發(fā)現(xiàn)，以Xpress Flu/RSV、普通PCR測(cè)序和自建RT-qPCR任意兩種方法結(jié)果一致為參考，Xpress Flu/RSV與參考方法一致性較高，但檢測(cè)FluB和RSV出現(xiàn)3例假陽(yáng)性結(jié)果，可能由于Xpress Flu/RSV檢測(cè)過(guò)程中存在核酸污染或非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致。由于普通PCR測(cè)序方法靈敏度一般低于熒光PCR法，普通PCR測(cè)序檢測(cè)RSV的檢測(cè)限為100.0 TCID50/mL；Xpress Flu/RSV對(duì)兩種RSVA毒株和兩種RSVB毒株的檢測(cè)下限均≤2.3 TCID50/mL。自建RT-qPCR法檢測(cè)靈敏度與Xpress Flu/RSV接近，不同之處在于單重檢測(cè)，手工提取核酸。比較這兩種方法的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Xpress Flu/RSV與自建RT-qPCR一致性好。以上對(duì)比試驗(yàn)中FluA、FluB和RSV的陰性預(yù)測(cè)值、陰性符合率均高達(dá)100.0%，表明Xpress Flu/RSV靈敏度高，假陰性結(jié)果或漏檢率低，適合用于呼吸道感染病毒初篩；雖然存在假陽(yáng)性結(jié)果，但概率低，具有較高檢測(cè)性能。

國(guó)內(nèi)學(xué)者將Xpress Flu/RSV與中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的RT-qPCR進(jìn)行比較，3種病毒檢測(cè)的一致性為94.7%～99.1%，Xpress Flu/RSV檢測(cè)FluA的靈敏度、特異度分別為100.0%、98.6%，檢測(cè)FluB的靈敏度、特異度分別為100.0%、99.2%，RSV靈敏度、特異度分別為 90.5%、99.7%[20]，對(duì)Xpress Flu/RSV檢測(cè)性能的評(píng)價(jià)與本研究結(jié)果相似，但RSV靈敏度比本研究稍低，原因可能是入選的受試者比例的差異，本研究住院患者較少(9.8%)，上述研究住院患者(77.8%)所占比例較大，而住院患者RSV檢出率更高[3]。國(guó)外有研究將Xpress Flu/RSV與美國(guó)疾病預(yù)防控制中心研發(fā)的RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，檢測(cè)FluA的靈敏度和特異度分別為98.6%、99.3%；檢測(cè)FluB的靈敏度和特異度分別為97.9%、99.4%；檢測(cè)RSV的靈敏度和特異度分別為98.1%、99.4%[21]，與本研究結(jié)果接近。綜合分析國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究[20-23]，雖參考方法不同，對(duì)Xpress Flu/RSV的檢測(cè)性能評(píng)價(jià)基本一致。Xpress Flu/RSV已在美國(guó)和歐洲批準(zhǔn)上市，在我國(guó)于2019年批準(zhǔn)，尚未推廣，Xpress Flu/RSV對(duì)我國(guó)檢出率較高，以及在呼吸道感染病毒占比較大的Flu和RSV檢測(cè)性能較高[24-25]，具有較好應(yīng)用前景。

檢測(cè)Ct值與病毒載量呈線性相關(guān)，有研究對(duì)Xpress Flu/RSV檢測(cè)的Ct值與不同類別受試者的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了探索，住院患者由于病程較長(zhǎng)，檢測(cè)時(shí)病毒載量一般低于處于感染急性期的門診患者[20]。本研究比較了住院患者(27例)和門診患者(186例)的Ct值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)，提示門診患者較住院者更易獲得陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。

本研究存在一定局限，合并感染和其他病原體感染標(biāo)本的數(shù)量較少，且經(jīng)自建RT-qPCR檢測(cè)的標(biāo)本數(shù)較少，故缺少更有力的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)；研究時(shí)間跨度較小，檢測(cè)標(biāo)本均在2018年冬春流感季采樣，僅一個(gè)中心的數(shù)據(jù)，時(shí)間和空間的代表性不足，有待更多實(shí)踐來(lái)驗(yàn)證其臨床應(yīng)用性能。

4 結(jié) 論

Xpress Flu/RSV檢測(cè)性能好，自動(dòng)化程度高，使用方便、快捷，是流感流行期大規(guī)模人群篩查和呼吸道感染病毒感染病原學(xué)診斷的良好選擇。