響應(yīng)面法優(yōu)化烏飯樹葉總黃酮超聲提取工藝的研究

周 鵬，趙 青，黃 婧，張 敏*

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153； 2.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037)

烏飯樹(VacciniumbracteatumThunb.)為杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬常綠灌木，主要分布于長江以南地區(qū)。作為我國傳統(tǒng)的藥食同源植物，具有極高的食用和藥用價(jià)值。江、浙、閩一帶素有用烏飯樹嫩葉制作烏米飯食用的習(xí)俗[1]。據(jù)《中藥大辭典》記載，烏飯樹具有益腎固精、強(qiáng)筋明目、散瘀消腫等藥效[2]。研究表明，除了銀杏等樹種含有黃酮類物質(zhì)外[3]，烏飯樹中也含有黃酮類次生代謝產(chǎn)物，且其種類多樣，含量較高(約 19.48%)[4]，在抗氧化[5]、抗腫瘤[6]和抑菌消炎[7]等方面均具有顯著效果，是其預(yù)防和治療疾病的關(guān)鍵成分，因而成為目前研究的熱點(diǎn)[8]。

烏飯樹葉黃酮類提取物在食品和藥品的開發(fā)以及食品防腐中已經(jīng)開始使用，且具有較大的市場前景[5,9]，因此研究烏飯樹葉黃酮提取工藝具有重要意義。目前比較常見的黃酮提取方法有浸提法[10-11]、酶提取法[12]、超聲提取法[13]等。不同的提取方法各有利弊，需根據(jù)提取對象考慮試驗(yàn)的安全性、經(jīng)濟(jì)性和目的性[14]。已有部分學(xué)者對烏飯樹葉黃酮提取工藝進(jìn)行研究，章海燕等[15]對水提取黃酮的工藝進(jìn)行了優(yōu)化；王曉仙等[16]采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化乙醇超聲提取烏飯樹葉總黃酮的工藝。響應(yīng)面法是解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，通過多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系以尋找響應(yīng)因素的最佳條件，作為有效的分析方法在許多研究領(lǐng)域中得到了應(yīng)用[10,12,14]。本研究以烏飯樹葉為原料，采用超聲波輔助法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法對影響烏飯樹葉黃酮提取量的主要因素進(jìn)行分析和優(yōu)化，以期篩選烏飯樹葉黃酮的最佳提取工藝條件，為進(jìn)一步開發(fā)利用烏飯樹葉黃酮資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏飯樹葉采自江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院資源圃，用硅膠保存并帶回實(shí)驗(yàn)室，擦拭干凈，60 ℃烘干至恒重，粉碎后過60目篩備用。

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)購于北京盛世康普化工技術(shù)研究院；醋酸鈉、無水乙醇、六水合三氯化鋁均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9423A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；FW100型高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；KH-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；SHZ-DIII型循環(huán)水式真空泵(鞏義市矛華儀器有限責(zé)任公司)；WFZ UV-2100型紫外可見分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 黃酮測定采用三氯化鋁比色法[17]。精密稱取10 mg槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，加50%乙醇定容至50 mL，搖勻即得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確量取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液置于25 mL容量瓶中，依次加入5 mL的1% AlCl3溶液和1 mL的10%醋酸鈉溶液，然后用50%乙醇定容至25 mL，搖勻，靜置10 min，于390 nm處測定吸光度。以吸光度(Y)對槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=2.719 3X-0.001 3，R2=0.999 7，表明在0 — 0.32 mg/mL范圍內(nèi)槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度和吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2 烏飯樹葉總黃酮的提取和含量測定 準(zhǔn)確稱取烏飯樹葉干燥粉末0.500 g，加入一定體積分?jǐn)?shù)乙醇溶劑，在設(shè)定的條件下超聲回流提取，抽濾，洗滌濾渣3次，合并濾液并用乙醇定容至50 mL。取0.5 mL黃酮提取液于25mL容量瓶中，測定吸光度，計(jì)算樣品中總黃酮含量(mg/g)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 固定液料比(40∶1 mL/g)、超聲時(shí)間(30 min)、超聲溫度(55 ℃)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(0，30%，50%，70%，90%，100%)對總黃酮提取量的影響；采用篩選出的提取溶劑，固定超聲時(shí)間(30 min)和超聲溫度(55 ℃)，考察液料比(20∶1，40∶1，60∶1，80∶1 mL/g)對總黃酮提取量的影響；采用篩選出的提取溶劑和液料比，固定超聲溫度(55 ℃)，考察超聲時(shí)間(30，50，70，90,110 min)對總黃酮提取量的影響；采用篩選出的提取溶劑、液料比和超聲時(shí)間，考察超聲溫度(45，55，65，75 ℃)對總黃酮提取量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面分析 以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，利用Design-Expert 8.0.5軟件，依據(jù)Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)、超聲時(shí)間(C)及超聲溫度(D)設(shè)置為自變量，以總黃酮提取量(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平二次回歸正交組合試驗(yàn)，各試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2003和SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；利用Origin 9.0對單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)制圖；使用Design-Expert8.0.5軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和圖形輸出。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對烏飯樹葉總黃酮提取量的影響 由圖2可知，水作為提取溶劑時(shí)總黃酮提取量最小。在乙醇體積分?jǐn)?shù)30%—90%范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮提取量逐漸增加，當(dāng)100%乙醇作為提取溶劑時(shí)，提取量較90%乙醇稍有降低，但兩者差異不顯著(P>0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，90%和100%乙醇作為提取溶劑時(shí)，提取液呈現(xiàn)綠色(其他均為黃色)且出現(xiàn)明顯的沉淀，判斷是由于原料中葉綠素、脂溶性物質(zhì)、糖類等雜質(zhì)大量析出，從而增加對總黃酮純化處理的難度和成本[10,18]。因此考慮到生產(chǎn)成本，選擇70%乙醇作為提取溶劑。

注：不同小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量的影響

2.1.2 液料比對烏飯樹葉總黃酮提取量的影響 由圖3可以看出，當(dāng)液料比在20∶1— 60∶1之間時(shí)，隨著液料比的增加黃酮提取量增加，當(dāng)液料比超過60∶1 mL/g時(shí)，黃酮提取量顯著下降。原因可能是隨著溶劑體積的增加，溶劑與物料接觸更加充分，促進(jìn)烏飯樹葉中總黃酮的有效浸提，但當(dāng)溶劑量超過某一值時(shí)，其他物質(zhì)隨之滲出并阻礙黃酮的析出[19-20]。因此，液料比選擇為60∶1 mL/g。

注：不同小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。圖3 液料比對總黃酮提取量的影響

2.1.3 超聲時(shí)間對烏飯樹葉總黃酮提取量的影響 由圖4可知，隨著超聲時(shí)間的增加，總黃酮提取量呈現(xiàn)出“M”型變化趨勢，在90 min時(shí)達(dá)到最大值。超聲時(shí)間超過90 min后，總黃酮提取量顯著下降，推測超聲時(shí)間過長導(dǎo)致部分類黃酮物質(zhì)被超聲波所分解[12]。因此，從總黃酮穩(wěn)定性考慮，選擇超聲時(shí)間為90 min。

注：不同小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。圖4 超聲時(shí)間對總黃酮提取量的影響

2.1.4 超聲溫度對烏飯樹葉總黃酮提取量的影響 由圖5可知，當(dāng)浸提溫度在45—65 ℃之間時(shí)，隨著超聲溫度升高，分子運(yùn)動速率不斷加快，類黃酮物質(zhì)的滲透和擴(kuò)散速率加快，導(dǎo)致黃酮提取量隨之增加，在65 ℃時(shí)達(dá)到最大值。隨著浸提溫度繼續(xù)升高，總黃酮提取量有所降低，判斷是由于當(dāng)溫度過高，導(dǎo)致黃酮類組分被氧化[12]，以及乙醇揮發(fā)較快，葉中黃酮物質(zhì)不能充分被溶解[14]，導(dǎo)致總黃酮提取量有所降低。因此，選擇超聲溫度為65 ℃。

注：不同小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。圖5 超聲溫度對總黃酮提取量的影響

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 回歸模型的建立與分析 表2是響應(yīng)面優(yōu)化方案及試驗(yàn)結(jié)果。利用Design Expert 8.0.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到烏飯樹葉總黃酮提取量的預(yù)測值(Y)對自變量乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)、超聲時(shí)間(C)和超聲溫度(D)的響應(yīng)回歸方程：

Y=22.85+0.88A+0.26B+0.30C+0.35D-0.20AB-0.54AC+0.33AD+4.67BC+0.33BD-0.31CD-0.52A2-0.25B2-0.13C2-1.58D2

表2 Box-Beknhen試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3可知，該模型方差分析差異極顯著(P<0.01)，決定系數(shù)R2為0.938 8，表明其擬合度良好；失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著(P=0.302 8>0.05)，表明未知因素對試驗(yàn)結(jié)果干擾較?。粡腇值可知，各因素對總黃酮提取量的影響程度依次為A(乙醇體積分?jǐn)?shù))>D(超聲溫度)>C(超聲時(shí)間)>B(液料比)。其中，一次項(xiàng)B和C以及交互項(xiàng)AC對試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響(P<0.05)；一次項(xiàng)A和D以及二次項(xiàng)A2和D2對試驗(yàn)結(jié)果的影響極顯著(P<0.01)。

表3 多元回歸模型方差分析

2.2.2 響應(yīng)面圖分析 圖6是基于多元回歸模型所繪制的雙因素間交互作用對烏飯葉總黃酮提取量影響的響應(yīng)面分析圖。響應(yīng)曲面陡峭程度越大，說明響應(yīng)值受所考察因素的交互影響越大，反之，則影響越小。等高線越趨于橢圓形，說明響應(yīng)值受所考察因素的交互影響越大，越趨于圓形，則影響越小[21-23]。由圖6可以看出，從a到f，響應(yīng)曲面陡峭程度依次增大，等高線也由圓形向橢圓形逐漸過渡(f除外)，表明所考察因素間的交互影響作用由小到大順序依次為BC

圖6 2因素間交互作用對烏飯葉總黃酮提取量影響的響應(yīng)面圖

2.2.3 最佳提取工藝及驗(yàn)證 通過Design Expert 8.0.5軟件對回歸方程進(jìn)行分析處理，得到最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，液料比63.47∶1 mL/g，超聲時(shí)間80 min，超聲溫度66.05 ℃，總黃酮提取量的理論值為23.50 mg/g。從實(shí)際操作過程的方便性角度考慮，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，液料比65∶1 mL/g，超聲時(shí)間80 min，超聲溫度65 ℃，在該工藝下進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，總黃酮提取量為23.41 mg/g，與理論值相近，證明試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦x擇可靠。

3 結(jié)論與討論

烏飯樹葉中富含類黃酮化合物，在食品與醫(yī)藥領(lǐng)域均具有廣闊的開發(fā)利用前景[1,8]。本研究以烏飯樹葉干燥粉末為原料，采用乙醇浸提和超聲波輔助法結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，所得的1次總黃酮提取量為23.41 mg/g。該結(jié)果高于章海燕等[15]利用水提取黃酮時(shí)的結(jié)果(提取量達(dá)16.817 mg/g)，說明黃酮類物質(zhì)的醇溶性一般好于水溶性。王曉仙等[16]采用正交試驗(yàn)優(yōu)化烏飯樹葉總黃酮的提取工藝條件，得到最佳的超聲提取工藝為70%乙醇，液料比40∶1 mL/g，超聲提取30 min，提取2次，提取量為29.78 mg/g。本研究中1次提取量與前者2次提取量結(jié)果相近，說明響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取黃酮的方法可靠。

本研究通過響應(yīng)面法分析，結(jié)合實(shí)際操作和生產(chǎn)效益，得到乙醇超聲提取烏飯樹葉總黃酮的最佳工藝條件為以75%乙醇為提取溶劑，液料比65∶1 mL/g，超聲時(shí)間80 min，超聲溫度65 ℃，在此條件下1次總黃酮提取量為23.41 mg/g，與模型預(yù)測值相近，證明采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝方法可靠，可為烏飯樹葉黃酮資源提取和開發(fā)利用提供一定科學(xué)依據(jù)。