銀杏葉有效成分的提取及對糖尿病大鼠體重的影響

魏攀鳳，程 晶

（泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，福建泉州 362000）

銀杏葉為銀杏科草本植物銀杏的葉子[1]，銀杏存在的時間超過兩億五千年，早在侏羅紀時代就是當(dāng)時最繁盛的植物之一。即使地球經(jīng)歷變動它依然保存其原來的面貌，成了現(xiàn)今生物學(xué)化學(xué)上的“活化石”。它不僅葉子有很高的藥用價值，研究還發(fā)現(xiàn)它的果實、種子皆能利用，且藥用價值非常高，已經(jīng)被人工大量繁殖培育。并且廣泛應(yīng)用在臨床，藥理作用也被廣泛認識。銀杏葉提取物是在秋季銀杏葉片尚綠時采收，經(jīng)清洗、干燥、溶劑提取處理后的產(chǎn)物。銀杏葉提取物的有效成分主要為黃酮苷類、內(nèi)酯類、有機酚酸類、聚異戊烯醇類等。研究表明，其中的黃酮和內(nèi)酯具有較高的藥理活性作用，可應(yīng)用于心腦血管疾病。銀杏葉中豐富的有效成分可用于開展臨床實驗，研究其功能應(yīng)用。目前銀杏葉的提取方法包括：有機溶劑提取法、超臨界流體提取法、超聲波、微波輔助提取法、分離純化等。本次研究采用有機溶劑提取法，此法操作簡便、成本低，提取率較高，值得研究推廣。因此，應(yīng)緊密結(jié)合藥理、化學(xué)、藥學(xué)的現(xiàn)代知識和傳統(tǒng)的中醫(yī)藥經(jīng)驗，對銀杏葉提取物進行規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化開發(fā)研究[3]，為進一步探索銀杏葉的藥理用途起到推動作用。

因為銀杏葉是具有很高的藥用價值及開發(fā)前景的藥物。探索具有明確機制的既能夠改善胰島素抵抗又能對抗其他疾病的中藥制劑成為近年來中西醫(yī)結(jié)合心血管研究領(lǐng)域的熱點，具有重要的臨床應(yīng)用價值[4]。本實驗通過提純銀杏葉中的有效成分，并對糖尿病大鼠進行為期八周的灌胃，研究銀杏葉提取物對于大鼠血糖的影響[5]，進而影響大鼠的體重。來觀察銀杏對于糖尿病大鼠的體重影響。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SD大鼠（Rat；Rattus norvegicus），8周齡的大鼠35只，5只為備用大鼠，購買于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，后期飼養(yǎng)于泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校動物實驗室，于醫(yī)高專5只一籠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后隨機分成三組，一組為正常組，一組為糖尿病組，一組為銀杏葉提取物干預(yù)組（藥液濃度為100mg/kg），每組十只。干預(yù)處理前正常飲食，飲水，不限制活動空間。

1.2 試劑

鏈脲佐菌素（STZ），Sigma公司；銀杏葉中藥材，產(chǎn)地安徽；乙醇，西隴化工；實驗自制備銀杏葉提取物。

1.3 儀器

魚躍血糖測試儀；賽多利斯BSA124S電子天平；單孔恒溫水浴鍋；RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；800Y多功能藥物粉碎機；ZD-10N冷凍干燥儀。

2 實驗方法

2.1 銀杏葉提取物的制備

經(jīng)查閱有關(guān)文獻后，選取乙醇作為有機溶劑，提取銀杏葉中的有效成分，具體方法如下：將銀杏葉中藥材烘干后，用藥物粉碎機加工制得銀杏葉粗粉。稱取50g藥粉，加入10倍量的70%乙醇，在80℃恒溫水浴條件下，回流提取3h。收集提取液，藥渣按此實驗條件重復(fù)提取2次，合并提取液。提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，減壓濃縮，回收大部分溶劑，濃縮至膏狀，得銀杏葉提取物，提取物經(jīng)冷凍干燥后，置于-4℃冰箱存放備用。

取實驗制得銀杏葉提取物用生理鹽水配制成濃度為200mg/mL藥液，供后續(xù)實驗使用，臨用新配。

2.2 動物實驗

三組SD大鼠進行10～12h的禁食，測得空腹血糖量,挑選血糖正常的隨機分組，正常組10只分兩籠正常飼養(yǎng)。糖尿病組給藥組的20只大鼠，一次性腹腔注射STZ供試液45mg/kg。必須保證STZ在15min內(nèi)注射完畢，否則需重新配制STZ供試液。注射完后5只一籠隨機裝籠。

2.3 血糖檢測和各項指標(biāo)記錄

于注射STZ的24h后測量糖尿病組、給藥組大鼠的血糖，超過11mmol/L的大鼠視為造模成功，出現(xiàn)低于11mmol/L的大鼠可在第二天重新測量，如果還是未達可用備用的大鼠重新按45mg/kg注射STZ，未達標(biāo)的大鼠一律淘汰，不使用追加注射STZ的方法繼續(xù)造模。造模成功的大鼠糖尿病組每天按體重灌胃生理鹽水。給藥組組按體重灌胃銀杏葉提取物試液，連續(xù)灌胃八周，每周測一次體重，采尾靜脈血測量血糖值。

2.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0進行處理與統(tǒng)計分析；實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X_±SD）表示；采用t-檢驗與LSD多重比較分析組間差異。

3 結(jié)語

造模成功后，糖尿病大鼠由于血糖升高，正常組和給藥組采食量和飲水量日漸增加，正常組血糖保持在穩(wěn)定合理的范圍內(nèi)，采食量飲水量增加均不明顯。反觀糖尿病組大鼠其精神狀態(tài)日漸萎靡，日趨消瘦，體重下降明顯，活動減少，活動范圍減少，反應(yīng)遲鈍，皮毛失去光澤，被尿液浸濕情況嚴重，出現(xiàn)脫毛等現(xiàn)象，血糖、攝食量和飲水量明顯上升，體重卻反而下降。給藥組在給藥前一兩周時間內(nèi)也出現(xiàn)糖尿病組的特征及行為表現(xiàn)，但是隨著銀杏葉提取物試液灌胃的繼續(xù)，情況得到了比較好的改善。從圖1和圖2可以看出，隨著飼養(yǎng)時間的延長，正常組的體重日趨升高，糖尿病組體重減輕，給藥組的體重先減輕，隨后一段時間體重沒有繼續(xù)減輕。正常組血糖在八周內(nèi)變化不是很明顯，偶爾個別老鼠出現(xiàn)食量增加現(xiàn)象，但是血糖增加并不明顯。糖尿病組血糖升高明顯，給藥組血糖先升高后隨著給藥時間的加長緩慢降低并趨于一定的數(shù)值。

圖1 三組大鼠每周體重的變化

圖2 每周體重差異變化

需要指出的是，實驗過程中如果大鼠出現(xiàn)血糖恢復(fù)正常的情況，可以觀察兩天看看血糖值是否穩(wěn)定，如果穩(wěn)定在正常值范圍內(nèi)可以淘汰該老鼠。實驗過程中，會出現(xiàn)大鼠死亡的狀況可能是血糖過高導(dǎo)致死亡，也可能是其他原因，整個實驗過程中必須保證水量和飼料供應(yīng)充足，定時更換墊料避免出現(xiàn)其他問題，每個籠子的老鼠數(shù)量盡量控制在三到四只避免公鼠打架。正常組灌胃生理鹽水，整個實驗周期它們的血糖值都會比較穩(wěn)定，個別老鼠由于個體差異采食量過大等原因會出現(xiàn)血糖稍微偏高，但是只是個別情況。糖尿病組灌胃生理鹽水，不做其他干預(yù)血糖也會穩(wěn)定在一定的高度，有可能會出現(xiàn)個別血糖恢復(fù)正常值的情況，但是一般淘汰，個別情況不作為數(shù)據(jù)采納。

4 討論與結(jié)論

現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉中主要活性成分為黃酮苷類、內(nèi)酯類、有機酚酸類、聚異戊烯醇類，以黃酮和內(nèi)酯為主。目前有大量的藥理實驗表明，其中的黃酮和內(nèi)酯具有較高的藥理活性，黃酮主要對于心腦血管疾病，降血脂，擴張血管，清除氧自由基具有顯著的療效。內(nèi)酯中A、B、C、M類：是血小板活化因子（PAF）拮抗劑，是銀杏葉中最重要的活性成分，而白果內(nèi)酯有很強的生物活性，抗神經(jīng)末梢的衰老，為神經(jīng)精神病藥物，對改善老年癡呆的記憶有奇異的療效。目前銀杏葉提取物產(chǎn)品主要應(yīng)用于臨床高血脂、動脈粥樣硬化、擴張血管痙攣、改善腦部血液循環(huán)、修復(fù)受損神經(jīng)細胞、改善記憶力、提高認知功能、促進記憶過程，提高記憶力再現(xiàn)力輔助治療老年癡呆性的記憶力減退等，針對多重疾病都有顯著的臨床效果，銀杏葉是地球的“瑰寶”，是未來具有開發(fā)前景的藥物。

隨著銀杏葉中更多有效成分在臨床實驗中的拓廣應(yīng)用，新型提取技術(shù)的研究開發(fā)，今后的銀杏葉的提取研究將聚焦在開發(fā)新型溶劑，優(yōu)化提取工藝方法，升級分離純化技術(shù)，研究新型質(zhì)量檢測方法，實現(xiàn)銀杏葉天然藥物產(chǎn)物的可持續(xù)發(fā)展。

在本次研究中，給藥組灌胃銀杏葉提取物試液后會出現(xiàn)血糖適當(dāng)?shù)亟档停窍鄬τ谡Ｖ颠€是偏高，所以銀杏葉提取物在降低血糖上有明顯的效果是因為他通過激活SIRT1生長基因，活化細胞線粒體功能，提高了代謝水平，并刺激胰島素細胞的分泌，改善糖尿病的敏感性，但是該實驗沒辦法證明銀杏葉提取物能夠治愈糖尿病。銀杏葉提取物黃酮酸苷和銀杏內(nèi)酯具有抗氧化應(yīng)激和減弱炎癥反應(yīng)等[6—7]。張素英等[8]實驗表明銀杏葉提取物可降低糖尿病大鼠的血糖水平，增加糖尿病大鼠體質(zhì)量。后期會繼續(xù)研究血糖的變化，完善實驗，通過其他途徑觀察糖尿病老鼠的其他行為特征，以及給藥后的行為特征。