水楊酸長期注射對老年性耳聾的防護(hù)作用

李勝利武坤毅姬媛媛任曉勇

1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院科研中心實(shí)驗(yàn)室,710004

2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,710004

臨床和實(shí)驗(yàn)研究證明，阿司匹林在聽力學(xué)方面的影響具有矛盾性，大劑量的阿司匹林使用具有耳毒性，導(dǎo)致不可逆性耳聾和耳鳴發(fā)生[1]，同樣也發(fā)現(xiàn)大劑量的阿司匹林具有衰減人類慶大霉素造成的耳毒性[2,3]。大樣本的臨床觀察發(fā)現(xiàn)阿司匹林應(yīng)用于62261例女性后，不增加聽力損失率[4]，而在26917例男性應(yīng)用中則證明有聽覺損害的發(fā)生[5]。在噪聲性聾研究方面，已證明阿司匹林可減少耳蝸?zhàn)杂苫漠a(chǎn)生[6]，可以抵抗噪聲導(dǎo)致的耳蝸毛細(xì)胞損失[7]；而目前的臨床追蹤研究表明低劑量的阿司匹林可以延緩老年性耳聾的發(fā)展進(jìn)程[8]。而有些實(shí)驗(yàn)研究表明無論是低劑量還是大劑量的水楊酸，均可導(dǎo)致耳鳴產(chǎn)生，已證明水楊酸通過耳蝸和中樞途徑來影響聽覺系統(tǒng)[9]。水楊酸在耳蝸途徑的初期是下調(diào)外毛細(xì)胞膜的Prestin蛋白活性而導(dǎo)致聽力損失，長期應(yīng)用則上調(diào)Prestin蛋白活性，增加其表達(dá)而導(dǎo)致耳鳴發(fā)生[10]。更為重要的是，水楊酸具有靶向性調(diào)控耳蝸外毛細(xì)胞prestin蛋白表達(dá)的作用[11]，故成為耳聾耳鳴研究中的熱點(diǎn)領(lǐng)域。我們擬通過應(yīng)用不同劑量的水楊酸給年齡相關(guān)聽力損失DBA/2J小鼠腹腔長期注射，觀察對耳蝸外毛細(xì)胞馬達(dá)蛋白---prestin的表達(dá)水平的影響，同時(shí)觀察注射前后對聽功能的改變，以及對耳蝸毛細(xì)胞存活的影響，并探討不同劑量水楊酸對耳蝸抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Caspase-3表達(dá)的影響，明確對老年性聾治療的最佳劑量，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物DBA/2J近交系小鼠，購買于南京模式動(dòng)物研究所，動(dòng)物品系編號為J000671，選用動(dòng)物4周齡（W）DBA/2J小鼠，每組10～15只，雌雄各半，共使用60余只小鼠。

1.2 聽功能測定方法

小鼠稱重后用0.75%戊巴比妥鈉（0.1mg/kg）麻醉，聽覺誘發(fā)電位儀測定聽覺誘發(fā)點(diǎn)位（ABR）用美國Inteligent Hearing Smart儀器測定。把針電極插入顱頂為記錄電極，兩側(cè)耳垂皮下插入?yún)⒖茧姌O，鼻尖逆向插入接地電極。Click為刺激聲，刺激率19.1/ms，高通300，低通3000，平均疊加250～500次，具體方法參照Li等[12]的方法。

1.3 水楊酸治療方法

4周齡的DBA/2J近交系小鼠50只，隨機(jī)分成5組，每組10只，依次為水楊酸100mg，150mg，200mg和250mg/kg注射組，對照組為同容量生理鹽水注射。水楊酸（Sodium salicylat,Lot＃SLBQ9170V,SIGMA）用生理鹽水配制，動(dòng)物按每公斤體重毫克的（mg/kg）上述的劑量每天腹腔注射一次，對照組注射生理鹽水，連續(xù)注射30天。實(shí)驗(yàn)前后測定動(dòng)物的ABR閾值[11,12]。

1.4 耳蝸鋪片及毛細(xì)胞計(jì)數(shù)方法

耳蝸鋪片及毛細(xì)胞計(jì)數(shù)按發(fā)表文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。

1.5 掃描電鏡觀察

按上我們以前的方法制備耳蝸電鏡樣品[13]，在德國FEI Verios 460 L XHR SEM超高分辨率掃描電子顯微鏡系統(tǒng)上觀察拍照。

1.6 全耳蝸鋪片prestin抗體染色

基本方法參照已發(fā)表文獻(xiàn)[11,12]。

1.7 耳蝸基底膜全蛋白提取和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blotting)

基本方法參照已發(fā)表文獻(xiàn)[11,12]。

1.8 熒光定量PCR

耳蝸組織總RNA抽提用無RNA酶的槍頭和離心管。把勻漿管標(biāo)記好后，加入1ml的Trizol Reagent，并置于冰上預(yù)冷。在冰上分離出整體耳蝸基底膜組織，去除多余的粘附的血管紋或螺旋韌帶組織，加入到標(biāo)記好的勻漿管中。用勻漿機(jī)充分研磨直至無可見組織塊，因耳蝸組織有骨螺旋板骨質(zhì)，更要充分研磨。在4℃離心機(jī)上12000rpm離心10分鐘后，取上清液加入標(biāo)記好的離心管中，并參照文獻(xiàn)進(jìn)行定量PCR檢測[11,12]結(jié)果處理采用ΔΔCT法：

A=CT(目的基因，待測樣本)-CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測樣本)

B=CT(目的基因，對照樣本)-CT(內(nèi)標(biāo)基因，對照樣本)

K=A-B

表達(dá)倍數(shù)=2-K

引物名稱及序列如：M-GAPDH-S：CCTCGTCCCGTAGACAAAATG，M-GAPDH-A：TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT；M-BCL2-S：TGACTTCTCTCGTCGCTACCGT，M-BCL2-A：CCTGAAGAGTTCCTCCACCACC；M-CASP3-S：GTCTGACTGGAAAGCCGAAAC，M-CASP3-A：GACTGGATGAACCACGACCC。退火溫度均為60℃。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism軟件，比較組與組之間單個(gè)點(diǎn)的差別采用t檢驗(yàn)或Mann-Whitney檢驗(yàn)，比較兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組在一個(gè)或一個(gè)以上變量下多個(gè)點(diǎn)（不同時(shí)間）之間的差別使用ANOVA。各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次或以上，非變量數(shù)據(jù)使用Mann-Whitney檢驗(yàn)分析，多變量使用方差（ANOVA）分析，應(yīng)用Graph-Pad prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 ABR反應(yīng)閾值的改變

水楊酸長期慢性注射治療30天后，200mg治療組的效果最好，ABR反應(yīng)閾值較治療前沒有差異，而其它各組的ABR反應(yīng)閾值較治療前均有上升，各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前和不同劑量水楊酸注射30天后ABR閾值改變情況?？梢?00mg/kg水楊酸注射組ABR閾移實(shí)驗(yàn)前后沒有明顯改變，而100mg/kg，150mg/kg和250mg/kg水楊酸注射組及生理鹽水注射組的ABR閾移改變明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（P＜0.01）其ABR反應(yīng)閾值治療前與治療后的閾移差值依次分別為：200mg治療組-0.37dBSPL，100mg治療組 11.15dBSPL，250mg治療組 12.68dBSPL，150mg治療組16.72dBSPL（圖1）。

圖1 各組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前和不同劑量水楊酸注射30天后ABR閾值改變情況。200mg/kg水楊酸注射組ABR閾移實(shí)驗(yàn)前后無明顯改變，而100mg/kg，150mg/kg和250mg/kg水楊酸注射組及生理鹽水注射組的ABR閾移改變明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（*P＜0.01）。Fig.1 Changes of ABR threshold before and 30 days after salicylic acid injection in each group.There was no significant change in ABR threshold shift before and after the 200mg/kg salicylic acid injection group,while there were significant changes in ABR threshold shift in the 100mg/kg,150mg/kg,250mg/kg salicylic acid injection group and normal saline injection group(*P＜0.01）

2.2 全耳蝸毛細(xì)胞觀察計(jì)數(shù)結(jié)果

耳蝸鋪片觀察可見200mg治療組的毛細(xì)胞存活百分率最好，表現(xiàn)為耳蝸頂回OHCs，IHCs基本存活，基底膜上的毛細(xì)胞基本完好，無散在性缺失；中回OHCs大部分存活，僅有少部分消失；基底部仍有30%外毛細(xì)胞存活，IHC有50%的存活。其次為100mg治療組，耳蝸頂回OHCs，IHCs基本存活，基底膜上的毛細(xì)胞基本完好，無大量缺失；中回約50%OHCs存活；基底部仍有20%外毛細(xì)胞存活，IHC有40%的存活。而150mg組，耳蝸頂回OHCs，IHCs基本存活，基底膜上的毛細(xì)胞基本完好，無大量缺失；中回約50%OHCs存活；基底部無毛細(xì)胞存活，IHC已基本消失。250mg治療組較差，耳蝸頂回OHCs，IHCs有散在消失；中回約70%OHCs，IHC存活；基底部無毛細(xì)胞存活，IHC已基本消失。鹽水對照組毛細(xì)胞損失較250mg/kg水楊酸注射組為輕,耳蝸頂回OHCs，IHCs有散在消失；中回上部約50%OHCs，IHC存活，下部已基本消失；基底部無毛細(xì)胞存活，IHC已基本消失，說明250mg/kg水楊酸注射更嚴(yán)重影響毛細(xì)胞的存活。比較100mg/kg，200mg/kg劑量水楊酸注射30天組和生理鹽水組的耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞存活百分率統(tǒng)計(jì)分析，可見從耳蝸頂部到基底部OHC1存活率明顯降低，在頂?shù)街胁?00mg/kg組的OHC1存活率較其它兩組明顯高，而到基底部三組的OHC1存活率均非常低（圖2B,C）；100mg/kg和200mg/kg組OHC2存活率在耳蝸頂?shù)街猩匣剌^高，雖在基底回上部存活較少，但比鹽水對照組高；OHC3的表現(xiàn)基本與OHC2相似；最大差別是IHC，在耳蝸頂上端三組基本沒有差別，而在中回100mg/kg和200mg/kg組的IHC存活率顯著的高于鹽水對照組，基底回亦如此。全耳蝸鋪片三排外毛細(xì)胞記數(shù)用存活的總平均值從頂端到基底端分點(diǎn)制圖（圖4）。

圖2 全耳蝸鋪片三排外毛細(xì)胞記數(shù)用存活的總平均值從頂端到基底端分點(diǎn)制圖。水楊酸注射組有100mg/kg,150mg/kg,200mg/kg和250mg/kg四組及鹽水對照組?？梢婍敹瞬课籓HC存活最少的是100mg/kg組，其他四組均較好；而中回區(qū)的OHC存活有顯著差別出現(xiàn)在100mg/kg和200mg/kg組，其它三組的OHC存活率均較前兩組明顯低；基底部五組之間基本沒有太大差別。Fig.2 The cochlear hair cells count results shown that 200mg/kg group was a better protective effect for apex turn no hair cells loss,middle turn was less loss and basal turn have a moderate loss.150mg/kg and 250mg/kg groups was showed significant differences of hair cells loss.However,the animals with receiving normal saline group hair cells became significantly deteriorated to the terminal point of the experimental time course.

2.3 掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察1月齡DBA/2J小鼠耳蝸中回外毛細(xì)胞（OHC）,可見靜纖毛束（stereocilia,S）排列整齊、完整，無散亂、倒伏和融合消失，表皮板完整（P）。3月齡的DBA/2J小鼠耳蝸中回和頂回（外毛細(xì)胞（OHC）,可見靜纖毛束（S）呈退行性改變，靜纖毛倒伏和融合消失，表皮板不夠完整或萎縮（P）。掃描電鏡觀察100mg/kg和150mg/kg水楊酸注射組耳蝸毛細(xì)胞存活和損害消失情況。100mg/kg組耳蝸頂回內(nèi)外毛細(xì)胞無損害消失（圖3A），中回OHC有散在消失（圖3B），而底回內(nèi)外毛細(xì)胞損害消失教多（圖3C）；150mg/kg組耳蝸頂回有散在的OHC消失（圖3D），中回內(nèi)外毛細(xì)胞損害消失很少（圖3E），而基底回外毛細(xì)胞損害消失主要在第3排（圖3F）；鹽水對照組耳蝸頂回OHC存留較少，大量的OHC消失（圖3G），而中回和基底回的OHC基本消失，IHC亦有散在消失。星號和箭頭指向OHC和IHC消失部位。掃描電鏡觀察觀察200mg/kg和250mg/kg水楊酸注射組及生理鹽水注射組耳蝸毛細(xì)胞存活和損害消失情況。200mg/kg組耳蝸頂回基本無內(nèi)外毛細(xì)胞損害消失（圖4A），中回內(nèi)外毛細(xì)胞約損害消失僅為散在性（圖4B），基底回?fù)p害OHC約占30%（圖4C），整體耳蝸靜纖毛束排列整齊、完整；250mg/kg組耳蝸頂回有散在的外毛細(xì)胞（OHC）消失（圖4D），中回OHC損害消失約70%，靜纖毛有散亂和融合現(xiàn)象（圖4E），而基底回內(nèi)外毛細(xì)胞損害嚴(yán)重，僅有個(gè)別內(nèi)外毛細(xì)胞存活，靜纖毛有散亂和融合現(xiàn)象更嚴(yán)重（圖4F）；生理鹽水對照組的耳蝸各回內(nèi)外毛細(xì)胞損害消失的情況較250mg/kg組更嚴(yán)重（圖4G-I）。

2.4 耳蝸全基底膜行免疫組化prestin表達(dá)標(biāo)記

耳蝸全基底膜行免疫組化prestin表達(dá)標(biāo)記可見，150mg治療組和200mg治療組的prestin表達(dá)熒光最強(qiáng)，其次是100mg治療組prestin表達(dá)較弱，而250mg治療組和鹽水組prestin表達(dá)更弱。耳蝸各回的prestin表達(dá)熒光強(qiáng)度差別不大。毛細(xì)胞消失情況基本與prestin表達(dá)的的強(qiáng)弱有關(guān)（圖5,6）。

2.5 Western Blotting蛋白印痕測定和全耳蝸RNA提取RT-PCR測定

Western Blotting蛋白印痕測定耳蝸prestin蛋白表達(dá)量，可見隨水楊酸注射劑量的增加，耳蝸OHC中prestin表達(dá)的量逐步升高，而鹽水對照組prestin表達(dá)量與各劑量的水楊酸組相比均較低（圖6）。全耳蝸RNA提取RT-PCR測定抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Caspase-3，總體上水楊酸注射的各劑量組均較鹽水對照組，顯示150mg組的Bcl-2水平最高，其次是100mg組和250mg組，200mg組較其它三個(gè)水楊酸組水平較低（圖7）；促凋亡基因Caspase-3水平鹽水對照組最高，而隨著水楊酸注射劑量的升高各組呈現(xiàn)出逐步下降趨勢，表現(xiàn)為Caspase-3水平隨楊酸注射劑量的升高而出現(xiàn)明顯的負(fù)向相關(guān)性（圖8）。

圖3 掃描電鏡觀察100mg/kg和150mg/kg水楊酸注射組3個(gè)月后，耳蝸毛細(xì)胞存活和損害消失情況。兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳蝸毛細(xì)胞頂回和中回內(nèi)外毛細(xì)胞損害消失很少，底回有散在消失（A-F，白色星號），而飲水對照組耳蝸整體有大量的內(nèi)外毛細(xì)胞消失（G-I，白色星號）。Fig.3 Scanning electron micrographs were observed on 100mg/kg and 150mg/kg groups of were use long-term salicylate injection after three mouth.The apical cochlear region,the stereociliary bundles are already well formed on both the row of inner hair cells(IHC)and outer hair cells(OHC)then control groups,the middle cochlear region of the organs of Corti have a normal appearance and show less miss of OHC(white stars),but the basal cochlear region both types of hair cell are ni throughout the cochlea(white stars)than control groups(G-I).

圖4 掃描電鏡觀察觀察200mg/kg和250mg/kg水楊酸注射組及生理鹽水注射組耳蝸毛細(xì)胞存活和損害消失情況。200mg/kg水楊酸長期注射組3個(gè)月后，耳蝸三排外毛細(xì)胞（OHC1,OHC2,OHC3）和內(nèi)毛細(xì)胞（IHC）基本存在（A-C），250mg/kg注射組耳蝸整體有較多的OHC消失（D-F,白色星號），而而飲水對照組耳蝸整體有大量的內(nèi)外毛細(xì)胞消失（G-I，白色星號）。Fig.4 Scanning electron micrographs were observed on 200mg/kg and 250mg/kg groups of were use long-term salicylate injection after three mouth.The apical cochlear region,the stereociliary bundles are already well formed on both the row of inner hair cells(IHC)and outer hair cells(OHC)then control groups,the middle cochlear region of the organs of Corti have a normal appearance and show less miss of OHC(white stars),but the basal cochlear region both types of hair cell are loss in tow groups is less(white stars)than control groups(G-I).

圖5 耳蝸全基底膜行免疫組化prestin表達(dá)標(biāo)記，可見100mg（A-C），150mg(D-F)和 200mg(G-I)水楊酸治療組的OHC prestin熒光表達(dá)強(qiáng)度隨水楊酸用藥量的增加而增強(qiáng)，100mg水楊酸治療組OHC prestin表達(dá)較后兩組弱。箭頭所指為OHC消失。Fig.5 Immunofluorescent staining of DBA/2J mice OHCs for prestin in situ whole-mount preparation，salicylate application for 30 day after 200mg/kg group OHC shown strong staining of prestin,100mg/kg and 150mg/kg groups OHC was more weaken of prestin staining,250mg/kg group OHC was showed sighificantly lower of prestin staining then saline control group.

圖6 耳蝸全基底膜行免疫組化prestin表達(dá)標(biāo)記，250mg水楊酸治療組（A-C）和鹽水對照組(D-F)OHC prestin表達(dá)叫前三組更弱。耳蝸各回的prestin表達(dá)熒光強(qiáng)度差別不大。毛細(xì)胞消失情況基本與prestin表達(dá)的的強(qiáng)弱有關(guān)。Fig.6 Immunofluorescent staining of DBA/2J mice OHCs for prestin in situ whole-mount preparation，salicylate application for 30 day after 250mg/kg group OHC shown OHC was more weaken of prestin staining(A-C),250mg/kg group OHC was showed sighificantly lower of prestin staining then saline control group(D-F).

圖7 Western Blotting蛋白印痕測定耳蝸prestin蛋白表達(dá)量，可見隨水楊酸注射劑量的增加，耳蝸OHC中prestin表達(dá)的量逐步升高，而鹽水對照組prestin表達(dá)量與各劑量的水楊酸組相比均較低。Fig.7 Western blot of the cochlea for prestin.Low-dose to high-dose salicylate have bee showe to selectively increase the OHCs prestin expression then control group.

圖8 全耳蝸RNA提取RT-PCR測定抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Caspase-3，總體上水楊酸注射的各劑量組均較鹽水對照組，顯示150mg組的Bcl-2水平最高，其次是100mg組和250mg組，200mg組較150mg組水楊酸水平較低（A）；促凋亡基因Caspase-3水平鹽水對照組最高，而隨著水楊酸注射劑量的升高各組呈現(xiàn)出逐步下降趨勢，表現(xiàn)為Caspase-3水平隨楊酸注射劑量的升高而出現(xiàn)明顯的負(fù)向相關(guān)性（B）。Fig.8 RT-PCR data showed that 150mg/kg aspirin group used DBA/2J mice cochlear appeared significantly higher expression of mRNA expression of Bcl-2,an ant-apoptotic gene,compared to the other groups mice,while it had sigificantly lower pro-apoptotic gene caspase-3 in the 250mg/kg,showen salicylate dose-selective effect.

3 討論

3.1 水楊酸的劑量選擇性

本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，在給DBA/2J小鼠腹腔注射水楊酸在100至250mg/kg的不同劑量組中，耳蝸生理和病理表現(xiàn)具有明顯的差異。最顯著的變化是耳蝸聽覺功能的差異和毛細(xì)胞形態(tài)及Prestin蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論是耳蝸聽覺功能的改善，還是耳蝸毛細(xì)胞存活率，以及Prestin蛋白表達(dá)，200mg組是最好的，其次是150mg組，而250mg組的效果最差（圖1-4）。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用水楊酸注射在耳蝸生理及病理中存在劑量依賴性改變。以前的研究亦證明大劑量的水楊酸可導(dǎo)致耳聾和耳鳴的發(fā)生，水楊酸的注射劑量基本在200mg是一個(gè)分界線，超過200mg劑量被認(rèn)為是大劑量的應(yīng)用，而低于200mg時(shí)被認(rèn)為是低劑量的應(yīng)用。許多以前的實(shí)驗(yàn)也基本證明了這種分類。大劑量的水楊酸可造成耳蝸及聽覺中樞病理性損傷，而低劑量的水楊酸對耳蝸及聽覺中樞具有保護(hù)性功能。以往在耳鳴的研究中發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)使用200mg/kg水楊酸不會導(dǎo)致聽神經(jīng)纖維的SFR改變[14]，而使用400mg/kg水楊酸則可以使其發(fā)生改變[15]。Lecain等（2007）發(fā)現(xiàn)10或100mg/kg/day阿司匹林抵抗早期的阿米卡星耳毒性而保護(hù)毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元，證明對毛細(xì)胞沒有毒性[16]。已經(jīng)證明阿司匹林在耳蝸外淋巴液中的濃度是血清的30%，產(chǎn)生了永久性和不可逆的聽覺閾移[17]，這種改變已報(bào)道是220mg/kg的大劑量阿司匹林靜脈注射或300mg/kg的水楊酸腹腔注射造成的[18,19]。已知水楊酸具有劑量依賴的耳毒性，在研究慶大霉素耳毒性中證明100 mg/kg的水楊酸鈉皮下注射，可以減少80%慶大霉素造成的耳蝸外毛細(xì)胞損傷[8]。在研究給大鼠皮下注射水楊酸鈉開始兩天之前給予3天的順鉑，劑量為16 mg/kg/day，同樣皮下注射，耳保護(hù)作用可觀察到基本的電生理BAEP測量,與對照組相比，有顯著的外毛細(xì)胞減少[20]。然而，這些改變也沒有在100 mg/kg/day水楊酸治療的3天組觀察到，如文獻(xiàn)報(bào)道的同樣水楊酸劑量[8,20,21]。水楊酸鈉顯示耳保護(hù)作用指征為抵抗順鉑造成的耳蝸解剖上的外毛細(xì)胞損害，這種保護(hù)是有限的，而對這些細(xì)胞的功能狀態(tài)無保護(hù)指征[22]。Jiang等證明300 mg/kg的水楊酸腹腔注射，產(chǎn)生20-30dB的CAP閾移[23]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證明水楊酸對老年性聾的預(yù)防和治療作用是有限的，僅能部分保護(hù)聽覺功能和耳蝸毛細(xì)胞存活。要完全阻止老年性聾的聽功能下降和毛細(xì)胞退變，尚需結(jié)合其它方法聯(lián)合預(yù)防和治療。通過上述文獻(xiàn)的分析比較，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，基本可以認(rèn)同200mg/kg水楊酸是聽力學(xué)研究中損害或保護(hù)的劑量分界線。

3.2 水楊酸鈉劑量選擇性對耳蝸毛細(xì)胞Prestin蛋白表達(dá)的影響

國內(nèi)于寧等察到prestin分布于外毛細(xì)胞膜中最外的質(zhì)膜層上，基底膜亦有表達(dá)[24]。趙寧等[25]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氨基糖甙類耳毒性藥物持續(xù)暴露導(dǎo)致prestin過表達(dá)，可能參與致聾過程。黃治物等[26]研究發(fā)現(xiàn)慢性水楊酸鈉注射后通過上調(diào)prestin基因mRNA及其蛋白的表達(dá)使外毛細(xì)胞能動(dòng)性增加可能是其引起耳鳴的機(jī)制之一。張博等[27]發(fā)現(xiàn)水楊酸鈉影響prestin在毛細(xì)胞底部分布的變化是導(dǎo)致聽力下降的原因。而陳秉等[28]的實(shí)驗(yàn)證明強(qiáng)噪聲暴露導(dǎo)致prestin蛋白表達(dá)上調(diào)，與耳蝸毛細(xì)胞損失程度有關(guān)。這些研究亦同樣證明感音神經(jīng)性聾和耳鳴均與prestin的表達(dá)改變有密切關(guān)系。羅璇等[29]綜述了耳蝸OHC的Prestin蛋白調(diào)控機(jī)制的研究現(xiàn)狀,認(rèn)為Prestin蛋白不僅在感音性聾的發(fā)生機(jī)制中具有重要作用,而且對感音性聾的修復(fù)具有一定的潛在價(jià)值。

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，老年性聾小鼠的耳蝸外毛細(xì)胞prestin的表達(dá)下降，推測prestin蛋白改變可能是導(dǎo)致老年性聾的機(jī)制之一[11]，設(shè)想在上調(diào)耳蝸外毛細(xì)胞prestin的表達(dá)后，可否能夠阻止或延緩老年性聾發(fā)展，而在選擇上調(diào)耳蝸外毛細(xì)胞prestin的表達(dá)靶向藥物方面，我們查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)水楊酸具有這種功能。前期的許多研究者推測水楊酸對外毛細(xì)胞影響產(chǎn)生的永久性聽力損失，許多實(shí)驗(yàn)研究證明大劑量的水楊酸明顯上調(diào)耳蝸外毛細(xì)胞的prestin表達(dá)，被認(rèn)為是產(chǎn)生耳鳴的主要機(jī)制之一。Yu等[34]發(fā)現(xiàn)長期應(yīng)用水楊酸可以增加Prestin mRNA和蛋白表達(dá)水平，上調(diào)Prestin的表達(dá)并增加OHC的電致運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)了耳蝸的主動(dòng)機(jī)制,增加DPOAE幅度，反轉(zhuǎn)Prestin的作用并促進(jìn)其表達(dá)[10]。在本研究中，我們觀察到200毫克水楊酸長期注射，可以明顯提高耳蝸外毛細(xì)胞prestin的表達(dá)，其次是100 mg的水楊酸注射，而250mg的水楊酸注射在上調(diào)耳蝸外毛細(xì)胞prestin的表達(dá)同時(shí)，對耳蝸毛細(xì)胞和聽功能的損傷也明顯存在（圖5-7）。這也和以前的許多實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相同。

通過本實(shí)驗(yàn)研究，我們認(rèn)為這主要是要選擇合適的水楊酸使用劑量，大劑量的水楊酸在提高耳蝸毛細(xì)胞prestin的表達(dá)量的同時(shí)，對耳蝸毛細(xì)胞和聽功能亦造成損害，而低劑量的水楊酸在提高耳蝸毛細(xì)胞prestin的表達(dá)量的同時(shí)，對耳蝸毛細(xì)胞和聽覺功能具有保護(hù)作用?；久鞔_200毫克的水楊酸劑量是耳蝸損傷或保護(hù)作用的分水嶺。

3.3 水楊酸鈉劑量選擇性對老年性聾的治療效果及機(jī)制

在水楊酸應(yīng)用方面，以前的研究者主要是按傳統(tǒng)的水楊酸治療血管疾病和抗炎癥的功效來使用，有些研究亦證明水楊酸的抗氧化自由基作用[8]。Tavanai和 Mohammadkhani過對年齡相關(guān)性聾（ARHL）的文獻(xiàn)綜述，認(rèn)為靶向性作用于細(xì)胞死亡通路較靶向性僅抗氧化應(yīng)激途徑更好[30]。Lowthian等過大樣本的阿司匹林對老年性聾的預(yù)防追蹤觀察，認(rèn)為低劑量阿司匹林對ARHL的作用機(jī)制是抗炎癥和微血管的有效影響[8]。而老年性耳聾的病理機(jī)制中，這些因素也是重要的方面。通過本研究，似乎更明確了水楊酸的作用靶向分子是耳蝸外毛細(xì)胞特異表達(dá)的prestin蛋白。通過我們的系列研究可以初步認(rèn)為prestin蛋白表達(dá)下調(diào)使毛細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的構(gòu)象發(fā)生改變，破壞了毛細(xì)胞膜的完整性，首先使外毛細(xì)胞的主動(dòng)運(yùn)動(dòng)功能減退或喪失，從而導(dǎo)致耳蝸放大器功能和聽覺頻率分辨率下降或喪失；其次是外毛細(xì)胞膜的完整性破壞導(dǎo)致的凋亡過程發(fā)生，外毛細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的構(gòu)象發(fā)生改變后，細(xì)胞膜上的凋亡受體被激活，啟動(dòng)了毛細(xì)胞的凋亡程序，促進(jìn)Caspase途徑的級聯(lián)反應(yīng)，通過反饋環(huán)路抑制了抗凋亡基因的表達(dá)，最終使毛細(xì)胞大量凋亡，使聽覺功能喪失，而發(fā)展為老年性耳聾。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)老年性聾小鼠的耳蝸Caspase-3基因上調(diào)和Bcl-2基因下調(diào)，而應(yīng)用水楊酸后可以明顯逆轉(zhuǎn)這種過程的發(fā)生（圖8），但Bcl-2基因表達(dá)水平與水楊酸注射劑量間的關(guān)系可能更為復(fù)雜。上述結(jié)果為我們的理論假設(shè)提供了初步的依據(jù)。進(jìn)一步的研究需要明確prestin蛋白表達(dá)下調(diào)，使毛細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的構(gòu)象發(fā)生改變超微結(jié)構(gòu)形態(tài)證據(jù)，以及Caspase-3基因上調(diào)和Bcl-2基因下調(diào)與prestin蛋白表達(dá)確切關(guān)系和信號途徑，更為重要的是找到能夠逆轉(zhuǎn)這種過程的靶向分子，從而為老年性聾的治療提供技術(shù)路線和有效方法。