CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在水生甲殼動(dòng)物中的應(yīng)用進(jìn)展*

郭華榮，陶奕文

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院海洋生物遺傳與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003；2. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物進(jìn)化與多樣性研究所，山東 青島 266003)

甲殼動(dòng)物是節(jié)肢動(dòng)物門中的一個(gè)亞門，因體表有一層幾丁質(zhì)外殼而得名。甲殼動(dòng)物的種類有2.6萬(wàn)種之多，大多數(shù)生活在海洋里，少數(shù)棲息在淡水中和陸地上。其中的蝦蟹類營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，是重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種。而另外一些小型甲殼動(dòng)物則成為魚類等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的餌料或生態(tài)環(huán)境指示生物，在水生食物鏈中占有重要地位。

隨著越來(lái)越多的甲殼動(dòng)物全基因組序列的公布[1-2]，其生長(zhǎng)、發(fā)育和免疫等重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因的生物學(xué)功能的研究也引起了人們更多的關(guān)注。而CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)因其操作簡(jiǎn)便、快速和成本低的特點(diǎn)，也迅速在少數(shù)幾種水生甲殼動(dòng)物中得到了成功應(yīng)用[3-8]。但是由于顯微注射技術(shù)在應(yīng)用上的局限性，導(dǎo)致該技術(shù)在許多重要海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種如對(duì)蝦中的應(yīng)用受到限制，基因編輯效率低下，難以廣泛開展。本文對(duì)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在水生甲殼動(dòng)物中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述和展望，為今后海水養(yǎng)殖蝦蟹類的基因功能研究以及遺傳育種研究提供參考。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)簡(jiǎn)介

CRISPR/Cas9英文全稱為Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9，即成簇的有規(guī)律地間隔排列的短回文重復(fù)序列及其核酸酶9。CRISPR簇是一個(gè)廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中的特殊的DNA重復(fù)序列，由一個(gè)前導(dǎo)區(qū)(Leader)、多個(gè)短而高度保守的重復(fù)序列區(qū)(21～48 bp，參與發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成)和多個(gè)間隔區(qū)(Spacer，26～72 bp，來(lái)源于入侵的病毒和質(zhì)粒的基因組)組成。CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌中較為有效的一種獲得性免疫系統(tǒng)：細(xì)菌-病毒(噬菌體)[9-11]。這一發(fā)現(xiàn)完全顛覆了人們關(guān)于獲得性免疫的概念，即并非只有抗體可以實(shí)現(xiàn)免疫記憶，生命在其非常原始的形態(tài)時(shí)如細(xì)菌，就已經(jīng)學(xué)會(huì)利用堿基的互補(bǔ)配對(duì)原則，在核酸水平上實(shí)現(xiàn)了這種免疫記憶，只是后來(lái)進(jìn)化了，有了更多的細(xì)胞分工和蛋白合成能力，才發(fā)展出抗體而取代了這一機(jī)制。細(xì)菌在與噬菌體的斗爭(zhēng)中發(fā)展出了CRISPR/Cas系統(tǒng)，當(dāng)細(xì)菌被噬菌體侵染后，要么死掉，要么戰(zhàn)勝噬菌體。而勝利活下來(lái)的細(xì)菌會(huì)將噬菌體的一小段DNA片段插入自己的重復(fù)序列區(qū)中，成為一個(gè)新的間隔序列。當(dāng)該病毒DNA再次進(jìn)入細(xì)菌時(shí)，它就會(huì)被間隔序列所轉(zhuǎn)錄的gRNA(guide RNA)所識(shí)別，并激活與其結(jié)合的Cas核酸酶，切割入侵病毒的DNA雙鏈，從而實(shí)現(xiàn)保護(hù)自身安全和防御入侵的目的[12-14]。

人們利用細(xì)菌中這一靶向切割基因組DNA的機(jī)制設(shè)計(jì)了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因功能的分析[15-17]。其中，Cas蛋白有10多種，但由于Cas9的酶活性較高，且不需其它蛋白的輔助，因而最先被選中。在CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)中，如圖1所示，最初設(shè)計(jì)的CRISPR是由一個(gè)基因特異性的CRISPR RNA (crRNA，即gRNA)和一個(gè)反式激活CRISPR RNA (tracrRNA，即gRNA scaffold) 形成的短雙鏈RNA: crRNA/tracrRNA，其與Cas9蛋白結(jié)合形成核糖核蛋白體(Ribonucleoprotein，RNP)，利用其中的gRNA與靶基因的互補(bǔ)結(jié)合，從而引導(dǎo)Cas9核酸酶切割靶基因的DNA雙鏈。后來(lái)，Jinek等(2012)發(fā)現(xiàn)將crRNA和tracrRNA串聯(lián)形成的單個(gè)嵌合gRNA(Single gRNA，sgRNA)也可以行使雙鏈crRNA/tracrRNA的作用，從而大大簡(jiǎn)化操作[17]。因此，之后的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)主要由cas9和sgRNA兩個(gè)基因編輯元件組成。當(dāng)cas9和sgRNA作用于靶序列，形成DNA雙鏈斷裂后，將激活細(xì)胞內(nèi)的兩種DNA修復(fù)機(jī)制：同源重組修復(fù)(HDR)和非同源末端連接(NHEJ)。當(dāng)NHEJ參與斷裂基因的修復(fù)時(shí)，可引起基因的移碼突變，導(dǎo)致靶基因的敲除；當(dāng)系統(tǒng)中加入其它外源基因片段時(shí)，這些外源基因片段就有很大可能被插入靶位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)基因的敲入。

另外，Cas9核酸酶含有2個(gè)酶切活性位點(diǎn)：HNH 和RuvC-like，分別負(fù)責(zé)切割DNA雙鏈的互補(bǔ)鏈和非互補(bǔ)鏈。Cas9核酸酶切割的位點(diǎn)為間隔序列鄰近基序(Protospacer adjacent motif，PAM) 之前的第4個(gè)核苷酸處(見圖1)。PAM序列具有種屬的特異性，例如來(lái)自于釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的SpCas9的PAM序列為NGG，而來(lái)自于金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的SaCas9的PAM序列為NNGRRT/NNGRRN(R指A/G)，來(lái)自狗鏈球菌Streptococcuscanis的ScCas9的PAM序列為NNGN，僅需1 個(gè)G[18]。PAM序列不屬于gRNA，而是gRNA 3’末端的緊鄰序列，PAM序列的存在是激活Cas9的酶活性所必需的，只有DNA靶位點(diǎn)附近存在PAM時(shí)，Cas9才能準(zhǔn)確切割。

總之，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是一種由gRNA引導(dǎo)的Cas9核酸酶靶向編輯技術(shù)，其操作簡(jiǎn)便快速，成本低，已廣泛用于基因的敲除、插入和敲降。自2013年首次應(yīng)用于真核細(xì)胞的基因編輯以來(lái)，以日新月異的速度在不斷發(fā)展[19-20]。不僅廣泛應(yīng)用于基因功能的研究和疾病的治療[21-22]，還在模式生物中用于快速制備突變個(gè)體，研究生長(zhǎng)和發(fā)育的機(jī)制以及遺傳學(xué)規(guī)律[23-24]，以及重要經(jīng)濟(jì)物種優(yōu)良性狀的改良[25-26]。

圖1 雙鏈crRNA/tracrRNA(a)和單鏈sgRNA(b)引導(dǎo)的Cas9核酸酶靶向切割DNA雙鏈?zhǔn)疽鈭D[17]Fig.1 Schematic diagram of the targeted deawage of double-strand DNA by Cas9 nndease which is guided by double-strand crRNA/tracrRNA(left)and single strand RNA(Right)

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的效率問(wèn)題

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的核心元件為sgRNA和Cas9，大量研究表明，sgRNA的準(zhǔn)確靶向、Cas9蛋白的高效表達(dá)以及基因編輯元件的有效遞送是決定該技術(shù)的靶向性和基因編輯效率的三個(gè)關(guān)鍵因素[27]。其中，將基因編輯元件高效遞送到靶細(xì)胞內(nèi)是實(shí)現(xiàn)基因編輯的前提條件。目前，上述基因編輯元件的遞送可以通過(guò)物理方法如顯微注射和電穿孔等，也可以通過(guò)生物學(xué)方法，以病毒載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒等)或非病毒載體(即表達(dá)質(zhì)粒)介導(dǎo)[28]。目前，在模式動(dòng)物中上述基因編輯元件的遞送方法已很成熟。其中，顯微注射到小鼠、斑馬魚和果蠅等的受精卵/早期胚胎中，或者線蟲的生殖腺中是應(yīng)用最廣泛、最成功的遞送方式[23,29-31]。在分裂活躍的哺乳動(dòng)物、魚類和昆蟲的體外培養(yǎng)細(xì)胞系中，也有各種有效的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法以及病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移與表達(dá)系統(tǒng)，可以用來(lái)遞送上述基因編輯元件[32-35]。但是，對(duì)于眾多非模式動(dòng)物來(lái)說(shuō)，往往由于缺乏有效的基因編輯元件遞送工具，而嚴(yán)重限制了CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用[ 3,36]。

目前，sgRNA和Cas9的遞送形式主要有三種：(1) DNA質(zhì)粒，即編碼sgRNA和Cas9的表達(dá)質(zhì)粒；(2) RNA形式，即體外轉(zhuǎn)錄的Cas9 mRNA和sgRNA；(3) RNP形式，即sgRNA和Cas9蛋白復(fù)合物。相比較而言，以DNA質(zhì)粒為遞送形式，操作簡(jiǎn)單，且編輯作用持續(xù)的時(shí)間更長(zhǎng)，但編輯效率要受到靶細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和表達(dá)sgRNA與Cas9的效率的限制；以RNA或RNP為遞送形式，編輯作用更快，但是需要體外制備上述編輯元件[3]。

sgRNA的準(zhǔn)確靶向和降低脫靶率是CRISPR/Cas9基因編輯效率方面的另一備受關(guān)注的問(wèn)題。為此，科學(xué)家們將Cas9蛋白的其中一個(gè)活性位點(diǎn)突變，構(gòu)建dCas9(dead Cas9)突變體，以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因單鏈的切割。然后通過(guò)在靶位點(diǎn)的互補(bǔ)鏈和非互補(bǔ)鏈上分別設(shè)計(jì)兩個(gè)gRNA，二者相距不超過(guò)20 bp，以單鏈缺刻(nick)的形式打斷靶基因雙鏈，可以顯著提高編輯的效率，減少脫靶率。也有科學(xué)家將Cas9的兩個(gè)酶切活性位點(diǎn)全部突變，使其失去切割DNA活性，但是保留結(jié)合gRNA的能力，但是將其標(biāo)記上報(bào)告基因如GFP或轉(zhuǎn)錄因子等，則可以實(shí)現(xiàn)靶基因的細(xì)胞定位和實(shí)時(shí)示蹤。另外，科學(xué)家們通過(guò)改變了組成spCas9蛋白的1 400個(gè)氨基酸中的3個(gè)氨基酸，成功將脫靶效應(yīng)降低到了幾乎無(wú)法檢測(cè)的水平[37]。也有人通過(guò)縮短sgRNA的長(zhǎng)度，制造sgRNA近PAM的3’端核心序列的單堿基差異以及改變Cas9蛋白的構(gòu)象等方式有效提高了基因編輯的靶向性，降低脫靶率[38-39]。

3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在水生甲殼動(dòng)物中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在節(jié)肢動(dòng)物中，特別是昆蟲中已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用[32,36]。近幾年，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在少數(shù)幾種水生甲殼動(dòng)物如鰓足類中的大型蚤(Daphniamagna)和蚤狀溞(D.pulex)、片腳類中的夏威夷明鉤蝦(Parhyalehawaiensis)以及十足類中的脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)中也得到了很好的應(yīng)用[2-3,5-8]。這些甲殼動(dòng)物均為抱卵，早期胚胎能夠耐受顯微注射操作。可以說(shuō)，CRISPR/Cas9技術(shù)在上述水生甲殼動(dòng)物中的成功應(yīng)用得益于其顯微注射技術(shù)的成功建立，即基因編輯元件在甲殼動(dòng)物中的遞送方式主要是通過(guò)顯微注射，遞送形式包括DNA質(zhì)粒、RNA和RNP三種。但是，顯微注射的方式和方法以及孵育的介質(zhì)因甲殼動(dòng)物種類的不同而有所不同(見表1)。詳情如下。

表1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在水生甲殼動(dòng)物中的應(yīng)用總結(jié)

續(xù)表1

3.1 水蚤(Water flea)

水蚤是淡水生境中的小型浮游甲殼動(dòng)物。由于它們?cè)谒澄镦溨姓加兄匾匚?，具有高度的表型可塑性，繁殖能力?qiáng)，個(gè)體小，易于觀察，一直被用作基礎(chǔ)生物學(xué)、進(jìn)化和生態(tài)學(xué)研究的動(dòng)物模型[40]。另外，水蚤在通常情況下是營(yíng)單性生殖的，只有當(dāng)其處于不利的環(huán)境條件下才會(huì)營(yíng)有性生殖[41]。因此，水蚤也是研究生殖方式轉(zhuǎn)換機(jī)制的難得的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。目前，CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于兩種水蚤：大型蚤和蚤狀溞。

3.1.1 大型蚤(D.magna) 大型蚤無(wú)眼基因(ey)基因與哺乳動(dòng)物pax6基因同源，一般認(rèn)為其在眼部的發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。Nakanishi等[6]首次將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用于大型蚤ey基因的敲除，將Cas9 mRNA和 sgRNA顯微注射到大型蚤的單細(xì)胞期胚胎中，成功誘導(dǎo)了無(wú)眼基因(ey)的突變。發(fā)現(xiàn)18%～47%的幼體的眼睛發(fā)育畸形，但是可發(fā)育成熟并產(chǎn)卵，其子一代中約有8%的個(gè)體仍然出現(xiàn)了眼睛畸形的表型，表明ey基因的突變表型可傳遞給子代。2017年Kumagai等[8]又采用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向編輯了大型蚤ey基因的第10個(gè)外顯子，基因編輯元件的遞送形式采用RNP形式，即將Cas9蛋白與ey-sgRNA孵育后，注射到大型蚤的單細(xì)胞期胚胎中，成功導(dǎo)致靶基因的突變，觀察到了眼畸形的表型，獲得的體細(xì)胞誘變率和可遺傳誘變率分別高達(dá)96%和40%。另外，作者還成功實(shí)現(xiàn)了熒光報(bào)告基因的靶向敲入，在幼體中觀察到了熒光信號(hào)，而成體中只有生殖腺中可觀察到熒光信號(hào)表達(dá)。

5-羥色氨是一種吲哚衍生物，最早是從血清中發(fā)現(xiàn)的，又名血清素，廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織中，特別是在大腦皮層和神經(jīng)突觸內(nèi)的含量很高。在昆蟲中，5-羥色氨具有調(diào)控蛻皮激素和保幼激素分泌的作用，從而調(diào)控昆蟲卵子的發(fā)生和卵黃的合成。在十足目甲殼動(dòng)物中，5-羥色氨還具有促進(jìn)生長(zhǎng)激素的分泌、調(diào)控動(dòng)物的行為和代謝的作用[42-43]。而色氨酸羥化酶(Tryptophan hydroxylase, TRH)則是5-羥色氨合成反應(yīng)的限速酶。為了解甲殼動(dòng)物中5-羥色氨的功能，Rivetti等[44]采用CRISPR/Cas9技術(shù)在大型蚤中成功制備了7個(gè)TRH基因的缺失突變株，并分析了這些突變株中5-羥色氨在調(diào)節(jié)大型蚤生長(zhǎng)、繁殖和行為上的作用。結(jié)果表明，TRH是5-羥色氨生物合成中的關(guān)鍵酶，TRH基因的突變可導(dǎo)致5-羥色氨的合成降低，而5-羥色氨的缺乏不僅降低了大型蚤的生長(zhǎng)速度及其子代的大小，還影響了其對(duì)光的敏感性。

在節(jié)肢動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，蛻皮激素在調(diào)節(jié)其胚胎發(fā)育和生長(zhǎng)繁殖中起著非常重要的作用。Adhitama等[45]利用CRISPR/Cas9技術(shù)將蛻皮激素誘導(dǎo)性表達(dá)的mCherry報(bào)告基因 (Ecdysone response element (EcRE)-controlled mCherry，EcRE-mCherry) 敲入大型蚤的基因組中，構(gòu)建了轉(zhuǎn)EcRE-mCherry基因大型蚤，從而可以實(shí)時(shí)了解大型蚤早期胚胎發(fā)育過(guò)程中蛻皮激素的時(shí)空表達(dá)譜，同時(shí)這種轉(zhuǎn)基因水蚤還可以成為監(jiān)測(cè)水環(huán)境中蛻皮激素活性的指示生物。

動(dòng)物的性別決定機(jī)制與其轉(zhuǎn)錄因子Doublesex (Dsx)的上游調(diào)控通路的差異有關(guān)。而大型蚤的環(huán)境性別決定則是通過(guò)Dsx的同源基因Dsx1在雄性個(gè)體中的特異性表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Ishak等[46]利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向敲除了雄性胚胎Dsx1基因啟動(dòng)子中的轉(zhuǎn)錄因子Vrille結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)Dsx1基因的表達(dá)顯著下降；在雌性胚胎中過(guò)表達(dá)Vrille基因，則上調(diào)Dsx1基因的表達(dá)，并誘導(dǎo)雌性胚胎產(chǎn)生了雄性特征。這表明，轉(zhuǎn)錄因子Vrille負(fù)責(zé)激活雄性胚胎中Dsx1基因的表達(dá)，促進(jìn)和維持雄性形狀，但是在雌性胚胎中該轉(zhuǎn)錄因子則被失活。

研究發(fā)現(xiàn)，以RNA形式，即Cas9 mRNA和 gRNA[6,44]，或RNP形式，即Cas9蛋白和gRNA結(jié)合[8]，顯微注射到大型蚤的單細(xì)胞胚胎中都可以取得較好的基因編輯效果。顯微注射需要選擇2～3周大的大型蚤排卵后的1 h之內(nèi)進(jìn)行，注射體積要控制在0.2 nL之內(nèi)，收集后的單細(xì)胞期胚胎暫存于冰浴的含80 mmol/L蔗糖的M4培養(yǎng)基(M4-蔗糖)中，每一個(gè)注射后的胚胎需要轉(zhuǎn)移到96孔板的單個(gè)孔內(nèi)，每孔添加100 mL含80 mmol/L蔗糖的M4培養(yǎng)基，23 ℃孵化3 d[6,47]。

3.1.2 蚤狀溞(D.pulex)，又稱淡水枝角水蚤 在脊椎和無(wú)脊椎動(dòng)物中，Distal-less基因(Dll)編碼遠(yuǎn)端附肢發(fā)育所必須的轉(zhuǎn)錄因子的同源結(jié)構(gòu)域。Hiruta等[48]通過(guò)顯微注射Cas9 RNP，在淡水枝角水蚤中建立了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，設(shè)計(jì)了針對(duì)Dll基因的dll-sgRNA，并將Cas9/dll-sgRNA 核糖核蛋白復(fù)合物注射到單細(xì)胞期胚胎中，發(fā)現(xiàn)注射后胚胎的第二觸角和附肢的發(fā)育均異常。由于在Dll靶位點(diǎn)檢測(cè)到了缺失突變，可見基因敲除是成功的，實(shí)驗(yàn)中觀察到的觸角和附肢的發(fā)育異常與dll基因的敲除有關(guān)。其中，第二觸角和附肢的發(fā)育有嚴(yán)重缺陷的突變體不能順利蛻皮，在成體前死亡，而有輕度或無(wú)表型缺陷的突變體是可存活的，并且可育的。

在淡水枝角水蚤的顯微注射條件方面，也可以通過(guò)顯微注射Cas9/sgRNA SNP到單細(xì)胞胚胎中來(lái)實(shí)現(xiàn)基因編輯，所需胚胎也是來(lái)源于至少2周大的淡水枝角水蚤，在其排卵后1 h之內(nèi)收集，但是，收集后的單細(xì)胞期胚胎要暫存于冰浴的含60 mmol/L蔗糖的M4培養(yǎng)基(M4-蔗糖)中。注射完成后，轉(zhuǎn)移到含2%瓊脂和M4-蔗糖的6孔培養(yǎng)板中，18 ℃孵化[48]。

3.2夏威夷明鉤蝦(P. hawaiensis)

夏威夷明鉤蝦是生活于淺水區(qū)的海洋片腳類甲殼動(dòng)物，以碎屑為食。在26 ℃下的胚胎發(fā)育大約需要10 d，生命周期為7～8周[49]。其身體結(jié)構(gòu)是片腳類的典型代表。由于夏威夷明鉤蝦全年都可以繁殖，且擁有典型的身體結(jié)構(gòu)，使其成為重要的新興模式生物[50]。

在兩側(cè)對(duì)稱動(dòng)物中，Hox基因?qū)τ诰S持身體的前后和左右對(duì)稱至關(guān)重要。Serano等[51]對(duì)夏威夷明鉤蝦的Hox基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)和基因組結(jié)構(gòu)分析，并通過(guò)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組技術(shù)，靶向敲入了eGFP基因，示蹤了觸角足突變基因(Antennapedia,Antp)的組織表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)該基因僅表達(dá)于前胸部，為解析Hox基因在節(jié)肢動(dòng)物發(fā)育和進(jìn)化中的作用奠定了基礎(chǔ)。

Martin等[7]將CRISPR/Cas9靶向誘變技術(shù)和RNAi敲除技術(shù)聯(lián)用，在夏威夷明鉤蝦中解析了6個(gè)Hox基因：Ubx、abd-A、Abd-B、Antp、Scr和Dfd的功能。發(fā)現(xiàn)基因Ubx的表達(dá)可抑制顎部的發(fā)育，但促進(jìn)鰓的發(fā)育；基因Abd-A和Abd-B是身體后部附肢的正確發(fā)育所必需的；基因Antp決定了爪的形態(tài)；基因Scr和Antp與顎肢的發(fā)育有關(guān)；基因Dfd與觸角的發(fā)育有關(guān)。總之，上述研究結(jié)果很好地揭示了不同Hox基因的時(shí)空表達(dá)是如何調(diào)控附肢的發(fā)育的。

在夏威夷明鉤蝦的顯微注射條件方面，基因編輯元件可以RNA 形式，也可以RNP形式，通過(guò)顯微注射遞送至胚胎中，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的定向編輯。其中，Martin等[7]是以1∶2的摩爾比將Cas9 mRNA和sgRNA混合，注射體積約為40～60 pL，注射劑量為400～600 ng/μL RNP。而Serano等[51]則是將333 ng/μL Cas9蛋白與200 ng/μL sgRNA的劑量注射于胚胎中。注射用的單細(xì)胞期胚胎需要在前一天晚上收集，并置于過(guò)濾消毒海水中，于18 ℃條件下培養(yǎng)。后來(lái)，F(xiàn)arboud等[28]又進(jìn)一步改進(jìn)了顯微注射的條件，即在2 μmol/L Cas9蛋白與4～8 μmol/L sgRNA的RNP復(fù)合物中添加0.05%酚紅，室溫孵育10 min后，再顯微注射到胚胎中，然后將注射后胚胎轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，置于密封良好的塑料器皿中，內(nèi)襯濕紙巾以保持濕度，置于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)置12 h/12 h的明暗周期。

3.3 脊尾白蝦(E. carinicauda)

脊尾白蝦為十足目甲殼動(dòng)物，生活于咸淡水中，生長(zhǎng)發(fā)育速度快，繁殖周期短，是很好的甲殼動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀＝陙?lái)，隨著人工繁育技術(shù)的日漸成熟，脊尾白蝦也發(fā)展成為中國(guó)一種重要水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種[52]。近幾年，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)也已在脊尾白蝦中得到成功應(yīng)用。

節(jié)肢動(dòng)物的外骨骼是由幾丁質(zhì)和硬化蛋白構(gòu)成的剛性支架。為了生長(zhǎng)和發(fā)育，節(jié)肢動(dòng)物已經(jīng)發(fā)展出一種蛻皮機(jī)制來(lái)定期替換它們舊的外骨骼[53]。在蛻皮過(guò)程中，幾丁質(zhì)酶在降解舊角質(zhì)層的過(guò)程中起主導(dǎo)作用[54-56]。Gui等[57]克隆了脊尾白蝦的幾丁質(zhì)酶4(Chitinase 4)(EcChi4)，并采用CRISPR/Cas9技術(shù)成功敲除了脊尾白蝦的EcChi4基因，并發(fā)現(xiàn)這種突變可以遺傳給下一代?；蚓庉嬙倪f送形式為RNA，即Cas9 mRNA和EcChi4-gRNA。作者針對(duì)脊尾白對(duì)蝦的發(fā)育特點(diǎn)所建立的顯微注射方法，為CRISPR/Cas9技術(shù)在脊尾白蝦中的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。隨后，Sun等[58]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦的EcChi4基因主要表達(dá)于肝胰腺，且在感染副溶血性弧菌或嗜水氣單胞菌后會(huì)上調(diào)表達(dá)。于是作者利用CRISPR/Cas9技術(shù)將EcChi4基因敲除，發(fā)現(xiàn)當(dāng)脊尾白蝦受到副溶血性弧菌或嗜水弧菌的攻擊時(shí)，EcChi4基因敲除組的死亡率明顯高于野生型脊尾白蝦，表明EcChi4基因參與了脊尾白蝦的免疫防御作用。由于無(wú)脊椎動(dòng)物在免疫防御過(guò)程中會(huì)大量釋放活性氧，以阻止外來(lái)病原微生物的入侵，但活性氧在體內(nèi)的大量累積會(huì)造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷，而類胡蘿卜素可以作為氧自由基清除劑對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。類胡蘿卜素異構(gòu)加氧酶(Carotenoid isomerooxygenase，EcNinaB-X1)是一種類胡蘿卜素加氧酶，具有降解類胡蘿卜素的作用。 Sun等[59]采用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了脊尾白蝦EcNinaB-X1基因，發(fā)現(xiàn)該突變體在受到副溶血性弧菌或嗜水弧菌的攻擊時(shí)存活率明顯高于野生型。同年，Sun等[60]又敲除了脊尾白蝦另一個(gè)類胡蘿卜素加氧酶基因：β, β-胡蘿卜素 9’, 10’-加氧酶(EcBCO2)，得到的突變體的肝胰腺呈現(xiàn)更深的橙色，并且具有更高的抗病性。因此，該基因可以作為對(duì)蝦分子標(biāo)記輔助育種的候選基因，用于培育抗病抗逆對(duì)蝦。

在甲殼動(dòng)物中，蛻皮抑制激素(Molt-inhibiting hormone, MIH)是一種重要的負(fù)調(diào)控因子，在抑制蛻皮過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。Zhang等[61]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了脊尾白蝦EcMIH基因，并分析了基因敲除脊尾白蝦的表型變化。從注射的250個(gè)胚胎中，共篩選出12個(gè)敲除蝦(EcMIH-KO)，突變率高達(dá)4.8%。發(fā)現(xiàn)EcMIH-KO蝦的體長(zhǎng)明顯增加，幼蟲的變態(tài)時(shí)間明顯縮短，而且EcMIH-KO蝦未出現(xiàn)死亡和畸形等問(wèn)題，為對(duì)蝦的分子遺傳育種奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

在脊尾白蝦的顯微注射條件方面，基因編輯元件的遞送均是采用RNA形式，注射到單細(xì)胞期胚胎中。其中，收集的單細(xì)胞胚胎首先暫存于4 ℃無(wú)菌海水中，然后以200 ng/μL Cas9 mRNA和100 ng/μL sgRNA 的劑量注射，注射后胚胎馬上轉(zhuǎn)移到含有滅菌海水的培養(yǎng)皿中，室溫下于100 r/min的速度于搖床上培養(yǎng)。15 d后，脊尾白蝦即可孵化出來(lái)[57-61]。

4 結(jié)語(yǔ)和展望

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)因其簡(jiǎn)單、快速和成本低的特點(diǎn)，自建立以來(lái)就廣受歡迎，很快被應(yīng)用到各種動(dòng)物、植物及其體外培養(yǎng)細(xì)胞的基因編輯研究中，成為人們探究基因功能、修復(fù)受損基因、沉默有害基因以及改良經(jīng)濟(jì)物種種質(zhì)性狀的重要工具，大大推動(dòng)了生物學(xué)領(lǐng)域的研究與發(fā)展。目前，該技術(shù)僅在少數(shù)幾種水生甲殼動(dòng)物包括兩種水蚤(大型蚤和蚤狀溞)、夏威夷明鉤蝦和脊尾白蝦中得到了很好的應(yīng)用。但是，幾種重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蝦類如刀額新對(duì)蝦(Metapenaeusensis，俗稱基圍蝦)、南美白對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)、日本囊對(duì)蝦(Penaeusjaponicus)和中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)中卻未見任何相關(guān)報(bào)道。造成這一困局的主要原因是顯微注射技術(shù)在應(yīng)用上的局限性。不難看出，水蚤、夏威夷明鉤蝦和脊尾白蝦均是抱卵，其早期胚胎能夠耐受顯微注射操作，也就是說(shuō)，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在上述4種小型甲殼動(dòng)物中的成功完全得益于顯微注射技術(shù)的建立。而上述幾種對(duì)蝦產(chǎn)卵后，均不抱卵，其受精卵為均黃卵，針刺后極易破裂，導(dǎo)致顯微注射后胚胎的孵化率很低，又由于對(duì)蝦受精卵的卵裂速度快，40～55 min即完成第一次卵裂，限制了可注射胚胎的數(shù)量，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)蝦的基因編輯效率低下。因此，亟需開發(fā)其它溫和的遞送方式，例如對(duì)蝦病毒介導(dǎo)的基因遞送工具以及納米遞送載體等，以解決目前對(duì)蝦基因編輯效率低下，難以廣泛開展的問(wèn)題。

蟹也是中國(guó)一種重要的人工養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)物種，如淡水生活的中華絨螯蟹、海水生活的三疣梭子蟹和擬穴青蟹，其生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆抗病相關(guān)基因的功能研究也日益得到人們的關(guān)注。但是，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在蟹類中的應(yīng)用尚未見任何成功報(bào)道。在蟹類中缺乏有效的基因編輯元件(Cas9和sgRNA)遞送方法或遞送工具，可能也是限制CRISPR/Cas9技術(shù)在蟹類中應(yīng)用的主要原因，因?yàn)檫@是在非模式動(dòng)物中開展基因編輯工作的前提條件和亟待解決的瓶頸問(wèn)題。

隨著越來(lái)越多的水生甲殼動(dòng)物如南美白對(duì)蝦[1]的全基因組測(cè)序結(jié)果的公布，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用于甲殼動(dòng)物中的條件將日趨成熟。因此，發(fā)展高效的甲殼動(dòng)物基因遞送工具是勢(shì)在必行的，一旦突破，必將推動(dòng)甲殼動(dòng)物在生態(tài)、遺傳、發(fā)育和進(jìn)化等各方面研究的飛速發(fā)展。當(dāng)然，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)仍然存在脫靶問(wèn)題，但隨著哺乳動(dòng)物中CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展和日臻完善，將大大促進(jìn)其在甲殼生物基因功能研究中的的應(yīng)用。