藜麥內(nèi)參基因篩選及鹽脅迫相關基因表達分析

賈冰晨,王 宇,張東亮,吳筱林,尹海波,陳世華,郭善利

(煙臺大學生命科學學院,山東 煙臺 264005)

實時熒光定量PCR(quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR)是一種能夠高效、定量分析基因表達量的技術手段,具有靈敏度高、特異性強、重復性好以及反應速度快等特點[1]．但是有許多因素會對定量分析結果的準確性造成影響,如RNA提取的質(zhì)量與產(chǎn)量、RNA反轉(zhuǎn)錄效率、qRT-PCR反應體系初始模板量、酶促反應效率等[2]．因此,為了排除基因表達的時空間差異、減少試驗材料間的樣本差異、減小實驗過程中的系統(tǒng)誤差,獲得精確度高、科學合理的數(shù)據(jù),通常需要引入一個或多個表達較為穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參基因,通過穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因?qū)z測基因的表達進行校正及標準化分析[3]．篩選特定物種、或者在特定處理中穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因是進行熒光定量實驗的前提[4-5],目前基于常用的geNorm、NormFinder和Bestkeeper3種分析方法,可以篩選出特定實驗條件下表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因[6-7]．

藜麥(Chenopodiumquinoawilld)是莧科、藜亞科、藜屬的一年生自花授粉雙子葉植物,具有耐寒、耐旱、耐瘠薄、耐鹽堿等特性[8],其種植、推廣和不斷增長的消費需求也使得其遺傳育種等基礎生物學研究受到了科研工作者越來越多的關注．本研究利用篩選出的最佳內(nèi)參基因?qū)见滬}脅迫下小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成相關基因脯氨酸合成酶基因(P5CS1)以及甜菜堿合成相關基因膽堿單加氧酶基因(CMO)的基因表達進行了分析[9]．

1 材料與方法

1.1 材料與處理

用500 mmol NaCl溶液澆灌處理8片真葉期藜麥苗2 d,樣品做3個生物學重復,剪取地上部分為試驗材料．

1.2 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

使用Vazyme公司生產(chǎn)的Fast Pure Plant Total RNA Isolation Kit試劑盒提取處理后藜麥苗地上部分組織材料RNA,然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,并且使用GE Healthcare公司生產(chǎn)的Nano VueTM紫外/可見光分光光度計檢測RNA濃度和純度．隨后使用Vazyme公司生產(chǎn)的HiScript?Ⅱ Q Select RT SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈．

1.3 候選內(nèi)參基因特異性引物設計

根據(jù)NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)發(fā)布的藜麥全基因組序列和在其他物種中常用的候選內(nèi)參基因,選取了(以NCBI網(wǎng)站發(fā)布的Gene ID為準)LOC110715281 (ACT-1),LOC110686159 (TUB-1),LOC110711758 (TUB-6),LOC110711181 (eIF3),LOC110710371 (EF1-α),LOC110711214 (GAPDH)共6個基因作為候選內(nèi)參基因,以及鹽脅迫相關基因LOC110722294 (P5CS1)和LOC110710124 (CMO)．使用BeaconDesign8軟件設計特異性引物(表1)并且在Primer-BLAST網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)上限定物種為藜麥對特異性引物進行檢測,并送至北京六合華大基因科技有限公司合成引物．

1.4 候選內(nèi)參基因?qū)崟r熒光定量PCR分析

qRT-PCR在QIAGEN?公司生產(chǎn)的Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR儀中進行．使用Vazyme公司生產(chǎn)的Cham QTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix試劑進行qRT-PCR反應．實時熒光定量PCR反應體系總體積為20 μL:2×Cham Q Universal SYBR qPCR Master Mix,10 μL;Forward Primer (10 μmol·L-1),0.4 μL;Reverse Primer (10 μmol·L-1),0.4 μL;10倍稀釋cDNA模板,1 μL;ddH2O,8.2 μL．反應程序為:95 ℃,3 min;95 ℃,10 s,58 ℃,30 s,72 ℃,30 s,40個循環(huán)．進行72～95 ℃熔解曲線分析．

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理使用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3個軟件進行分析,并利用Excel 2016作圖．

2 結果與分析

2.1 RNA檢測

將提取的藜麥地上部分樣品RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測．結果(圖1)顯示, 28S和18S RNA條帶清晰,表明RNA樣品沒有降解．使用Nano VueTM紫外/可見光分光光度計檢測的結果顯示,各樣品A260/A280在1.9～2.0之間,A260/A230在2.0～2.3之間,表明RNA的純度高,能滿足反轉(zhuǎn)錄實驗的要求．

2.2 候選內(nèi)參基因引物特異性PCR檢測

使用反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模板,通過普通PCR驗證內(nèi)參引物擴增特異性(圖2)．結果顯示,引物特異性較好,沒有非特異性擴增及引物二聚體出現(xiàn),并且確定6對候選內(nèi)參基因引物Tm值為57 ℃．

2.3 候選內(nèi)參基因表達豐度

對6個候選內(nèi)參基因的循環(huán)閾值(Ct)進行整理分析,評估這些基因的平均表達豐度(圖3)[10]．結果顯示,這6個候選內(nèi)參基因的Ct值位于17～28之間,其中4個候選內(nèi)參基因Ct值集中在20～26之間,說明表達豐度適中．其中GAPDH的Ct值最低,范圍位于17～19之間,說明其表達豐度最高;而EF1-α的Ct值最高,范圍位于于25～28之間,說明其表達豐度最低．

2.4 geNorm程序分析候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性

geNorm通過計算每個候選內(nèi)參基因在特定實驗條件下、特定組織材料中表達穩(wěn)定值(M)來判定其表達穩(wěn)定性[11]．該程序以M=1.5為閾值,當候選內(nèi)參基因的M值大于1.5則不適于作為候選內(nèi)參基因．因此M值越小,候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性越高,越適合特定條件下作為候選內(nèi)參基因．由程序分析結果可知(圖4(a)),6個候選內(nèi)參基因的M值均小于1.5,其中ACT-1最小,為0.255;GAPDH最大,為0.378,表明這些基因都可作為候選內(nèi)參基因,按照M值由低到高排序依次為:ACT-1

2.5 NormFinder程序分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

NormFinder與geNorm類似, 通過計算候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定值M來判定表達穩(wěn)定性的大小[11]．M值越小,越適合作為候選內(nèi)參基因;反之,則不適合．由程序分析結果可知(圖5), 6個候選內(nèi)參基因M值從低到高排列為ACT-1

2.6 Bestkeeper程序分析候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性

BestKeeper程序根據(jù)不同候選內(nèi)參基因在樣品中平均Ct值分別計算相關系數(shù)(coefficient of correlation,r)、標準差(standard deviation,SD)和變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)來判定候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性[11]．判定原則是相關系數(shù)越大,標準差和變異系數(shù)越小,內(nèi)標基因表達穩(wěn)定性越好．由程序分析結果可知(表2),6個候選內(nèi)參基因SD值均小于1,說明這些基因都適合作為內(nèi)參基因．其中,ACT-1和TUB-6相關系數(shù)較大,并且標準差和變異系數(shù)比較小,故二者適合作為內(nèi)參基因．這與geNorm和NormFinder程序分析結果相似．

表2 Bestkeeper分析候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性

2.7 內(nèi)參基因熔解曲線和標準曲線分析

綜合上述3種程序分析顯示,在鹽脅迫下藜麥ACT-1與TUB-6作為熒光定量PCR內(nèi)參基因最為穩(wěn)定．故對2條內(nèi)參基因引物的熔解曲線和標準曲線進行分析[12],結果如圖6、表3所示,ACT-1和TUB-6熔解曲線(n=3)出現(xiàn)明顯單一峰,說明引物特異性較好,并且Tm值分別為80.5 ℃和83.5 ℃．

表3 實時熒光定量PCR中2條內(nèi)參基因標準曲線參數(shù)

2.8 鹽脅迫相關基因P5CS1和CMO基因表達分析

在鹽脅迫下,由于外界滲透勢較低,植物細胞會發(fā)生水分虧缺現(xiàn)象,即滲透脅迫．多數(shù)植物能夠通過積累大量的代謝物質(zhì)如糖類(果糖、蔗糖、海藻糖等)、氨基酸(脯氨酸)等來調(diào)節(jié)植物細胞內(nèi)滲透壓與外界平衡,降低體細胞水勢,保持膨壓．維持植物體內(nèi)生理代謝平衡,保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)．植物的脯氨酸和甜菜堿是公認的小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[13-14],兩種物質(zhì)的合成與積累是植物應答滲透脅迫、離子脅迫以及次生氧化脅迫的手段．分別使用篩選出的ACT-1和TUB-6作為內(nèi)參基因通過qRT-PCR對脯氨酸合成相關基因P5CS1和甜菜堿合成相關基因CMO基因表達分析．結果顯示(圖7),P5CS1和CMO基因在以ACT-1和TUB-6為內(nèi)參基因時,表達情況一致,由此可見ACT-1和TUB-6可作為藜麥鹽脅迫時qRT-PCR分析時合適的內(nèi)參基因．并且在鹽脅迫下,藜麥P5CS1基因上調(diào)6倍左右,CMO基因上調(diào)30～40倍．

3 討 論

本研究分別使用geNorm、NormFinder和Bestkeeper內(nèi)參基因分析程序?qū)见溤贜aCl脅迫下6個候選內(nèi)參基因進行篩選,并利用實時熒光定量PCR技術對藜麥鹽脅迫相關基因P5CS1和CMO基因相對表達量進行分析．綜合上述3種程序的分析結果,在NaCl脅迫下藜麥實時熒光定量PCR內(nèi)參基因最佳選擇數(shù)目為2,最佳內(nèi)參基因分別是ACT-1和TUB-6,并且2個內(nèi)參基因表達豐度處于22～24之間,基因表達豐度適中,能夠滿足實驗需求．利用篩選出的ACT-1和TUB-6作為內(nèi)參基因,檢測到在NaCl脅迫下,藜麥P5CS1基因表達上調(diào)6倍左右,CMO基因表達上調(diào)30～40倍．由于基因表達存在時空間差異,經(jīng)驗式的認為管家基因都可以作為內(nèi)參基因是片面的[15],所以篩選特定物種、特定處理下實時熒光定量PCR內(nèi)參基因是有必要的．在不同物種,在同一物種不同組織、不同生長階段、不同脅迫條件下內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性不盡相同[16],所以篩選特定物種中、特定處理下表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因變得尤為重要．隨著藜麥在基因表達、抗逆分子生物學領域研究的深入,篩選出穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因成為研究的前提．此實驗結果為NaCl脅迫下藜麥實時熒光定量PCR篩選出了可靠、穩(wěn)定的內(nèi)參基因,并從基因表達角度驗證了甜菜堿的積累是藜麥應答NaCl脅迫、調(diào)節(jié)滲透平衡的主要方式,這與其他藜科、莧科植物鹽脅迫下物質(zhì)積累相關報道一致[17-18]．