刺葡萄棒狀擬盤(pán)多毛孢葉斑病病原菌的分離鑒定及其防治藥劑篩選

唐鑫彪　倪玉潔　胡玉慈　白金慧　王琳　陳清西　文志豐

摘要 葡萄葉斑病是一種嚴(yán)重影響葡萄產(chǎn)量的病害。為了明確引起刺葡萄葉斑病的病原菌種類(lèi)及篩選有效防治藥劑，本研究從福建農(nóng)林大學(xué)實(shí)踐教學(xué)基地采集刺葡萄‘高山二號(hào)10片典型葉斑病病葉片，對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子鑒定。結(jié)果表明，通過(guò)形態(tài)學(xué)特征結(jié)合rDNA-ITS（ITS）、β-tubulin和EF-1α序列分析確定分離到的菌株均為棒狀擬盤(pán)多毛孢Pestalotiopsis clavispora。防治藥劑篩選的結(jié)果顯示，不同的防治藥劑對(duì)炭疽病菌的抑制效果不同，60%唑醚·代森聯(lián)水分散粒劑和25%嘧菌酯懸乳劑對(duì)該病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好，其EC50分別為0.119 mg/L和0.178 mg/L;其次為80%波爾多液可濕性粉劑，其EC50為1.766 mg/L;抑制效果最差的藥劑為50%多菌靈可濕性粉劑，僅表現(xiàn)出輕微的抑制作用。防治棒狀擬盤(pán)多毛孢菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的最佳藥劑是60%唑醚·代森聯(lián)水分散粒劑和25%嘧菌酯懸乳劑，可作為備選藥劑進(jìn)行田間刺葡萄葉斑病防控試驗(yàn)。

關(guān)鍵詞 葡萄葉斑病; 鑒定; 擬盤(pán)多毛孢; 致病性

中圖分類(lèi)號(hào)：

S 436.631

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019144

Identification of the fungal pathogen causing Vitis davidii leaf spot and screening of fungicides for control of the disease

TANG Xinbiao， NI Yujie， HU Yuci， BAI Jinhui， WANG Lin， CHEN Qingxi*， WEN Zhifeng*

（College of Horticulture， Fujian Agricultural and Forestry University， Fuzhou 360002， China）

Abstract

Grape leaf spot is one of the most important diseases of grapevine in the world， which causes serious losses in grape yield. In order to confirm the pathogenic species in Vitis davidii Fox and screening of fungicides for control of the disease， ten spot leaves of V.davidii ‘Gaoshan-2 were collected from the Practice-Teaching Base of Fujian Agricultural and Forestry University， and the pathogen was isolated and identified using morphological and molecular biological methods. The results showed that， based on the rDNA-ITS， β-tubulin and EF-1α sequence analysis and morphological characteristics， the pathogen was identified as Pestalotiopsis clavispora. Fungicide screening showed that different fungicides had different inhibitory effects on P.clavispora. The best fungicides against the mycelial growth of the pathogen were pyraclostrobin·metriam 60% WG and azoxystrobin 25% SC， with an EC50value of 0.119 mg/L and 0.178 mg/L， respectively， followed by bordeaux 80% WP， with an EC50value of 1.766 mg/L. The fungicide with the lowest inhibitory effect was carbendazim 50% WP， which showed only slight inhibition. Our study suggested that pyraclostrobin-metriam 60% WG and azoxystrobin 25% SE were the effective fungicides for control of mycelium growth， which may be used as alternative chemicals for control of leaf spot in V.davidii in the field.

Key words

grapevine leaf spot; identification; Pestalotiopsis clavispora; pathogenicity

刺葡萄Vitis davidii Fox屬于葡萄科Vitaceae，葡萄屬Vitis，它的典型形態(tài)特征是幼枝及葉柄部位著生皮刺。刺葡萄東亞種群的一種野生種質(zhì)資源，具有優(yōu)良的鮮食、釀酒特性和抗?jié)駸峒翱共?yōu)勢(shì)。通過(guò)對(duì)野生資源馴化改良，形成了‘塘尾[1]

‘紫秋[2]‘高山二號(hào)[3]‘福安[4]‘惠良[5]等多個(gè)刺葡萄品種，主要分布在福建、湖南、江西等地，因其鮮食加工兼用及優(yōu)良抗逆抗病性，人們愈加重視對(duì)刺葡萄的開(kāi)發(fā)利用，近年栽培規(guī)模擴(kuò)增明顯，在部分地區(qū)甚至形成了特色產(chǎn)業(yè)。如福建的福安刺葡萄種植面積達(dá)200多公頃，充分利用葡萄在鮮食加工方面的優(yōu)勢(shì)，衍生出觀光采摘和釀酒加工等產(chǎn)業(yè)[6]，效益十分可觀;2011年湖南省刺葡萄酒產(chǎn)量超過(guò)1 710 t，產(chǎn)值達(dá)到1.9億元[7]

。

葉斑病又稱(chēng)為斑點(diǎn)病、褐斑病，是葡萄常見(jiàn)的葉部病害之一[8]

，全國(guó)各個(gè)產(chǎn)區(qū)的刺葡萄幾乎都發(fā)生過(guò)該病害。近年來(lái)，刺葡萄葉斑病發(fā)病率有升高趨勢(shì)，該病會(huì)引起樹(shù)體早期落葉，影響漿果的產(chǎn)量和品質(zhì)，對(duì)刺葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展影響極大。但目前尚未見(jiàn)對(duì)刺葡萄葉斑病致病菌種類(lèi)及其防治藥劑等方面的研究報(bào)道。

為明確引起刺葡萄葉斑病的致病菌種類(lèi)及其防治藥劑，本研究從福建農(nóng)林大學(xué)教學(xué)基地共采集10個(gè)刺葡萄‘高山二號(hào)病葉樣品進(jìn)行病菌常規(guī)分離，并結(jié)合病菌的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定，明確該菌為棒狀擬盤(pán)多毛孢Pestalotiopsis clavispora，為首次在刺葡萄中分離得到。同時(shí)測(cè)定了6種常用藥劑對(duì)該病原菌菌絲和孢子的抑制作用，以期為進(jìn)一步研究葡萄葉斑病菌種類(lèi)變化及分布奠定良好基礎(chǔ)，并為該病害的田間防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及防治藥劑

供試病樣為2018年6月從福建省福州市福建農(nóng)林大學(xué)教學(xué)基地從刺葡萄品種‘高山二號(hào)采集具有典型葉斑病癥狀的葉片10片。病菌致病性分析試驗(yàn)供試品種為刺葡萄‘高山二號(hào)、華東葡萄‘吉安和葡萄‘紅地球，均來(lái)自福建農(nóng)林大學(xué)教學(xué)基地。抑菌試驗(yàn)所用的殺菌劑為嘧菌酯、百菌清、波爾多液、唑醚·代森聯(lián)、多菌靈、甲基硫菌靈，均為農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)（表1）。

1.2 病原菌分離及形態(tài)學(xué)特征觀察

病原菌分離及單孢純化參照《植病研究方法》[9]

。用濕脫脂棉先將病葉表面污漬擦拭干凈，再?gòu)牡湫筒“叩牟〗〗唤缣幥腥〈笮〖s為3 mm×3 mm的組織，每張葉片切取3塊，然后經(jīng)0.1%次氯酸鈉消毒1 min，用無(wú)菌水洗凈后用70%乙醇消毒30 s，再用無(wú)菌水洗凈后轉(zhuǎn)移至PDA平板上，置于28℃恒溫培養(yǎng)。約3～4 d菌落清晰可見(jiàn)后，用直徑6 mm的打孔器從其邊緣打取菌絲塊轉(zhuǎn)接至新的PDA平板上，生長(zhǎng)7～10 d后，進(jìn)行單孢純化。

病原菌形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察參照Cai等[10]

的方法。從PDA上培養(yǎng)5 d的純化菌落邊緣切取菌餅（直徑6 mm），并將其轉(zhuǎn)移至新的PDA平板上置于28℃，L∥D=12 h∥12 h條件下培養(yǎng)。每個(gè)菌株3次重復(fù)。7 d后測(cè)量菌落直徑，計(jì)算平均生長(zhǎng)速率（mm/d），并觀察菌落的形態(tài)，分生孢子形態(tài)，并在倒置熒光顯微鏡（LEICA DMI8）下分別測(cè)量10個(gè)分生孢子盤(pán)、40個(gè)分生孢子的大?。ㄩL(zhǎng)度和寬度）。

1.3 分子鑒定

收集在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5～7 d的菌絲體，參照Weir等[11]

的方法提取基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（Bio-Rad凝膠成像GelDocTMXR+系統(tǒng)，美國(guó)伯樂(lè)公司）后作為PCR的擴(kuò)增模板。利用特異引物（表2）分別擴(kuò)增rDNA-ITS（ITS）、β-微管蛋白基因（TUB2）和EF-1α序列，PCR擴(kuò)增在Bio-Rad PCR儀（T100TM Thermal Cycle，美國(guó)，ABI）進(jìn)行。25 μL反應(yīng)體系如下：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，無(wú)菌超純水9.5 μL。

PCR擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性1.5 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，36個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并純化后，由鉑尚生物技術(shù)（福州）有限公司完成測(cè)序。

本研究中其他序列是根據(jù)BLAST搜索結(jié)果并參考文獻(xiàn)[12]

從GenBank中下載（表3）。使用Clustal X 1.81軟件處理3個(gè)保守基因rDNA-ITS（ITS）、TUB2和EF-1α組合序列數(shù)據(jù)。然后使用軟件MEGA 7.0，應(yīng)用自展法（bootstrap）對(duì)分離得到的菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，自展數(shù)據(jù)為1 000次。

1.4 致病性測(cè)定

將刺葡萄‘高山二號(hào)、華東葡萄‘吉安、葡萄‘紅地球的健康葉片分別剪下40片，用脫脂棉蘸取70%乙醇擦拭葉片表面消毒30 s后，然后用無(wú)菌水清洗3遍。每個(gè)葡萄品種分別取20片葡萄葉片作為試驗(yàn)組，另外20片設(shè)為對(duì)照，總共分為6組;用3號(hào)昆蟲(chóng)針在葡萄葉片表面制造微傷口，然后用直徑為6 mm的打孔器在培養(yǎng)了7 d的擬盤(pán)多毛孢PDA平板上打取菌餅，分別接種到相應(yīng)的葡萄葉片表面，以接PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，上述試驗(yàn)均重復(fù)3次，置于28℃，濕度80%條件下培養(yǎng)，72 h后將菌餅移除，培養(yǎng)7～10 d，每天觀察發(fā)病情況并記錄。

1.5 常用殺菌劑室內(nèi)抑菌效果的測(cè)定

含藥平板法：在無(wú)菌條件下，將6種常用殺菌劑用無(wú)菌水配制成濃度為0.1 g/mL的母液以備用，然后設(shè)置4個(gè)濃度梯度，配制含藥培養(yǎng)基。60%唑醚·代森聯(lián)WG終濃度為125、625、1 250、2 000、2 500 mg/L;80%波爾多液WP終濃度為150、300、600、900、1 200 mg/L;50%多菌靈WP和70%甲基硫菌靈WP終濃度為50、250、500、750、1 000 mg/L;75%百菌清WP終濃度為100、200、400、600、800 mg/L;25%嘧菌酯SC終濃度為10、50、250、750、1 250 mg/L。待培養(yǎng)基冷凝后，用直徑6 mm打孔器打取大小相同的菌絲塊接種于不同殺菌劑處理的PDA培養(yǎng)基上，置于28℃，L∥D=12 h∥12 h的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組重復(fù)6次，以無(wú)菌水代替殺菌劑為對(duì)照。每隔24 h觀察記錄1次，至第7天采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算各藥劑的菌絲生長(zhǎng)抑制率。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=

對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑-處理菌落生長(zhǎng)直徑對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑-菌餅直徑×100%。

計(jì)算出不同濃度下的抑制率后，以防治藥劑濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑制率的生物統(tǒng)計(jì)幾率值為縱坐標(biāo)，使用Excel 2010處理后得到毒力回歸方程及回歸系數(shù)，并計(jì)算出有效中濃度（EC50），比較不同防治藥劑的相對(duì)抑制效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)觀察

根據(jù)菌株在PDA平板上菌落的形態(tài)、大小和顏色等特征，本研究共從福建農(nóng)林大學(xué)教學(xué)基地采集具有典型葉斑病癥狀（圖1a）的刺葡萄‘高山二號(hào)病葉中分離得到1種致病菌株，將其編號(hào)為FJFZYeBan20180507。在PDA平板上，28℃培養(yǎng)7 d后，菌落呈近圓形，菌落正面為白色（圖1b），呈波浪狀，菌落背面為黃色，中心向外顏色逐漸變淺（圖1c）;14 d左右菌落上可見(jiàn)黑色油狀小點(diǎn)，即為分生孢子盤(pán)，后期分生孢子盤(pán)上會(huì)出現(xiàn)墨汁狀黏液（圖1d～e），分生孢子盤(pán)散生，黑色，直徑為138.92～246.04 μm。分生孢子呈紡錘形或長(zhǎng)棱形（圖1f～g），長(zhǎng)22.26～31.18 μm，寬5.09～7.31 μm，共5個(gè)細(xì)胞，4個(gè)隔膜，分隔處縊縮不明顯，頂端與基部細(xì)胞顏色較淡，多數(shù)呈透明狀，中間3個(gè)細(xì)胞顏色較深，多為褐色，頂端有2～4（多為3）根不分支的附屬絲，無(wú)色透明，基部細(xì)胞具有小柄（圖1 h～k）。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

分離得到的菌株用ITS序列的通用引物（ITS1/ITS4），β-微管蛋白（TUB2）和EF-1α，可分別從其基因組DNA中擴(kuò)增出一條約為500 bp（圖2a）、450 bp（圖2b）和280 bp（圖2c）的特異性條帶。將該菌株的測(cè)序結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)分別為MK620299、MK620300和MK620301。序列信息比對(duì)結(jié)果顯示，與該菌同源性較高的序列為棒狀擬盤(pán)多毛孢屬P.clavispora，同源性高達(dá)99%～100%。

通過(guò)MEGA7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以N.magna（MFLUCC_12-652）為外群，獲得Pestalotiopsis屬的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3），結(jié)果顯示FJFZYeBan20180507與已登錄的P.clavispora菌株（CGMCC 3.9123）具有很高的Bootstrap支持率，相似率最高，可以認(rèn)為是同一種菌。因此通過(guò)ITS、β-微管蛋白和EF-1α 3個(gè)基因并結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)特征，得出FJFZYeBan20180507為棒狀擬盤(pán)多毛孢菌P.clavispora。

2.3 致病性測(cè)定

刺葡萄‘高山二號(hào)、華東葡萄‘吉安、葡萄‘紅地球的葉片在室內(nèi)接種3 d后，在接種處出現(xiàn)褐色病斑，病斑周?chē)~片褪綠，中央變干，與田間癥狀類(lèi)似（圖4）。從具有典型癥狀的葡萄葉片上重新進(jìn)行病菌分離，結(jié)果分離得到的菌株菌落形態(tài)與分離得到的菌株相同，符合柯赫氏法則，證明該菌株是引起葡萄葉斑病的病原菌。

2.4 常用防治藥劑對(duì)病原菌的抑制作用

不同供試防治藥劑對(duì)刺葡萄棒狀擬盤(pán)多毛孢的抑制效果見(jiàn)表4。由表4可知，除50%多菌靈可濕性粉劑外，其余的防治藥劑對(duì)刺葡萄棒狀擬盤(pán)多毛孢均表現(xiàn)出一定的抑制作用，但不同的防治藥劑間的抑制效果有差異。供試的防治藥劑中，60%唑醚·代森聯(lián)水分散粒劑和25%嘧菌酯懸乳劑對(duì)該病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好，其EC50分別為0.119 mg/L和0.178 mg/L;其次為80%波爾多液可濕性粉劑，其EC50為1.766 mg/L;抑制效果最差的藥劑為50%多菌靈可濕性粉劑，僅表現(xiàn)出輕微的抑制作用。

3 討論

葡萄葉斑病的分布范圍較廣，是世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的重大病害之一，在我國(guó)大部分葡萄主栽區(qū)均有發(fā)生，發(fā)病較重時(shí)，可引起葉片提早脫落，進(jìn)而影響樹(shù)勢(shì)的生長(zhǎng)和果實(shí)產(chǎn)量。多種病原菌均可使葡萄葉部產(chǎn)生病斑，如葡萄褐柱絲霉Phaeoisariopsis vitis （Lev.）[13]，葡萄生單軸霉Plasmopara viticola （Berk.et Curtis） Berl.et de Toni[14]等，張夢(mèng)影等[15]

調(diào)查發(fā)現(xiàn)了尤韋可擬盤(pán)多毛孢 P.uvicola （Speg.） Bissett 能夠侵害葡萄葉片引起葉斑病，但國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)擬盤(pán)多毛孢屬危害刺葡萄葉片的報(bào)道。

本試驗(yàn)從福建農(nóng)林大學(xué)教學(xué)基地采集的刺葡萄‘高山二號(hào)病葉樣品中共分離純化得到1株形態(tài)特征一致的致病菌株，對(duì)該菌株進(jìn)行多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，明確該菌為棒狀擬盤(pán)多毛孢P.clavispora，在福建省內(nèi)尚屬首次發(fā)現(xiàn)。棒狀擬盤(pán)多毛孢，為擬盤(pán)多毛孢屬，可以危害枇杷、杧果、番石榴、山茶等多種植物，引起葉斑、腐爛、潰爛等癥狀。它的菌落形態(tài)、分生孢子盤(pán)及分生孢子與已報(bào)道的菌株P(guān).clavispora[16]形態(tài)相似。在印度南部，該菌能引起茶的灰斑病[17]。Ismai等[18]報(bào)道P.uvicola 和P.clavispora能引起杧果灰斑病。Ruvishika等[12]認(rèn)為Pestalotiopsis-like真菌可引起國(guó)內(nèi)葡萄果實(shí)腐爛和葡萄藤病害，造成潰瘍病。P.clavispora和P.neglecta能引起經(jīng)濟(jì)水果潰瘍病和莖枯病[19]。趙景楠等[20]認(rèn)為棒狀擬盤(pán)多毛孢P.clavispora可引起草莓葉斑病，而薛德勝等[21]認(rèn)為棒狀擬盤(pán)多毛孢P.clavispora是引起山東省藍(lán)莓葉斑病和根腐病的病原菌，說(shuō)明該菌可引起作物多種病害。本研究結(jié)果與之前其他物種中分離的致病菌P.clavispora一致，而該菌所造成的刺葡萄葉斑病在我國(guó)其他地方是否也有分布還有待于進(jìn)一步研究。

目前對(duì)該病害的防治措施主要是田間管理和化學(xué)藥劑防治。及時(shí)清理果園、改善果園通風(fēng)透光條件、降低園內(nèi)濕度、嚴(yán)控化肥的施用及葡萄果實(shí)負(fù)載量均是田間管理的主要措施。化學(xué)藥劑防控主要是前期預(yù)防，多菌靈、唑醚·代森聯(lián)等均是市面上較為常用的藥劑。然而市場(chǎng)上仍未有明確的防治藥劑能夠?qū)υ摼a(chǎn)生顯著的抑制效果。

本試驗(yàn)測(cè)定了7種殺菌劑對(duì)葡萄棒狀擬盤(pán)多毛孢菌絲的生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制效果，結(jié)果表明唑醚·代森聯(lián)對(duì)病菌的抑制效果最好，嘧菌酯和百菌清也有一定的抑制作用，其余的如波爾多液、多菌靈和甲基硫菌靈對(duì)該病原菌幾乎沒(méi)有抑制效果。該結(jié)果為刺葡萄葉斑病的田間藥劑試驗(yàn)提供參考，還需要在田間進(jìn)行試驗(yàn)方可推廣。

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（責(zé)任編輯：田 喆）