中華稻蝗Knickkopf(Knk)基因分子特性和生物學(xué)功能

于榮榮　張育平　馬恩波　張建珍

摘要 基于中華稻蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學(xué)方法搜索獲得1條OcKnk基因全長cDNA序列，采用qRT-PCR檢測其組織部位表達特性和其在表皮發(fā)育過程中表達情況，明確其分子特性，采用RNAi技術(shù)結(jié)合表型觀察，研究其對中華稻蝗蛻皮和生長發(fā)育的影響，以明確其生物學(xué)功能。組織部位表達結(jié)果顯示其在中華稻蝗體壁、前腸和脂肪體表達最高，發(fā)育表達結(jié)果顯示其在表皮不同發(fā)育日齡均有表達，且在蛻皮前期和后期表達顯著高于其他日齡。生物學(xué)功能研究表明，注射dsRNA后，多數(shù)蟲體難以成功蛻去舊表皮，導(dǎo)致死亡，少部分可蛻至下一齡期，但活動力較低，行動緩慢，最終死亡。研究結(jié)果表明OcKnk參與昆蟲生長發(fā)育和蛻皮過程，可作為重要靶標(biāo)基因，為下一步害蟲防治提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 中華稻蝗; Knickkopf; 分子特性; 生物學(xué)功能

中圖分類號： S 433.2

文獻標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019648

Molecular characteristics and biological function of Knickkopf （Knk） gene in Oxya chinensis

YU Rongrong1， ZHANG Yuping1， MA Enbo2， ZHANG Jianzhen2*

（1. Taiyuan Normal University， Jinzhong 030619， China; 2. Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

Abstract

The full-length cDNA of OcKnk gene was obtained based on the transcriptome database of Oxya chinensis. To determine the molecular characteristics of OcKnk， the expressions of OcKnk in different tissues and during different developmental stage （day） of cuticle were detected by qRT-PCR. The biological functions of OcKnk affecting molting and development were investigated by RNAi technology combined with phenotype observation. Tissue expression results indicated that there was a highest expression in the integument， foregut and fat body; developmental expression pattern showed that it was expressed in the cuticle during different developmental days of age， with a significantly higher expression during proecdysis and post-ecdysis. The biological function assay showed that most locusts was unable to escape from the old cuticle successfully， finally leading to death and failing to reach the next instar. During the process， they moved slowly with low activity and eventually went to death. The results indicated that OcKnk may be involved in insect growth and molting， which can be used as an important target gene and provide a theoretical basis for further pest control.

Key words

Oxya chinensis;? Knickkopf; molecular characteristics; biological function

中華稻蝗Oxya chinensis隸屬于直翅目Orthoptera斑腿蝗科Catantopidae稻蝗屬Oxya，廣泛分布于我國水稻種植區(qū)，是稻田土蝗的優(yōu)勢種[1-3]，喜食水稻幼嫩組織，造成葉片缺刻受損、白穗和稻粒缺失，嚴(yán)重影響農(nóng)作物產(chǎn)量[4-5]。目前化學(xué)藥劑仍是防治稻蝗的主要手段[6-7]，長期施用化學(xué)藥劑，使稻蝗產(chǎn)生一定程度的抗藥性[8-9]。昆蟲生長發(fā)育伴隨周期性舊表皮脫落和新表皮形成，幾丁質(zhì)是昆蟲表皮的重要組成成分[10-11]，幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)以恒定角度螺旋排列形成致密而富有彈性的表皮結(jié)構(gòu)[12-15]。幾丁質(zhì)排列過程中，Knickkopf（Knk）發(fā)揮著關(guān)鍵作用[16]。因此，通過RNA干擾（RNAi）技術(shù)篩選獲得幾丁質(zhì)排列關(guān)鍵靶基因?qū)橹腥A稻蝗防治提供重要理論基礎(chǔ)。

目前對于Knk功能的研究主要集中于黑腹果蠅Drosophila melanogaster和赤擬谷盜Tribolium castaneum中，果蠅DmKnk對于胚胎氣管直徑的維持、長度的保持和結(jié)構(gòu)的完整性發(fā)揮重要作用，此外，DmKnk通過對表皮幾丁質(zhì)進行組裝，進而影響胚胎形態(tài)[16]。通過點突變結(jié)合遺傳學(xué)試驗篩選，發(fā)現(xiàn)DmKnk的DOMON功能域4個關(guān)鍵氨基酸對于幾丁質(zhì)組裝具有作用[17]。同時，DmKnk對于成蟲翅形狀和翅表面結(jié)構(gòu)的維持具有重要作用[18]。赤擬谷盜中，TcKnk對胚后發(fā)育時期蟲體生長發(fā)育起著關(guān)鍵作用，當(dāng)TcKnk表達量下降后，不同發(fā)育階段（幼蟲-蛹和蛹-成蟲）蟲體均出現(xiàn)難以蛻去舊表皮，蛻皮致死的表型，進一步通過透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)注射dsTcKnk后，鞘翅表皮致密排列的幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)消失，同時氣管形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[19]。此外，TcKnk對胚胎發(fā)育起著關(guān)鍵作用，將dsTcKnk注射進入雌蟲體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其所產(chǎn)卵的孵化率顯著降低，幾丁質(zhì)含量下降，同時漿膜表皮幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)消失，部分已孵化幼蟲在蛻至下一齡期前死亡[20-21]。此外，TcKnk負責(zé)保護幼蟲新合成的表皮，防止其被幾丁質(zhì)酶降解[22]。已在意大利蜜蜂Apis mellifera中鑒定出AmKnk，但對其功能未做進一步闡述[23]。

1.7.2 dsRNA沉默效率檢測

收集18頭5齡2 d若蟲，平均分為2組，采用微量注射器分別將3 μL dsGFP和dsOcKnk注射進入不同組若蟲體腔內(nèi)，待24 h后，收集蟲體，凍存于-80℃冰箱，進一步提取總RNA并將其反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA，采用qRT-PCR檢測OcKnk在對照組和處理組中的表達情況，采用SigmaPlot 12.0繪制柱形圖，使用t測驗分析OcKnk在對照組和處理組中表達差異。

1.7.3 飛蝗表型觀察

選取40頭5齡2 d若蟲，平均分為2組，分別將6 μg dsGFP和dsOcKnk注射進入5齡2 d若蟲中，置于人工氣候培養(yǎng)箱中，對其生長發(fā)育進行連續(xù)觀察和記錄，直至蛻皮至下一齡期。

2 結(jié)果

2.1 OcKnk全長cDNA鑒定

基于中華稻蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，搜索獲得1條OcKnk序列（圖1），其全長cDNA核苷酸長度為2 265 bp，由5′-UTR區(qū)、開放閱讀框和3′-UTR區(qū)組成。其中5′-UTR和3′-UTR分別為172 bp和41 bp，開放閱讀框為2 052 bp，編碼684個氨基酸，分子量為77 kD，等電點為5.8。功能域預(yù)測結(jié)果顯示其包含信號肽（1-24 aa）、兩個串聯(lián)的DM13功能域（37-136 aa和152-252 aa）、1個多巴胺類似功能域（DOMON）（282-414 aa）和C端的GPI錨定位點（655-683 aa）。

不同昆蟲Knk氨基酸序列系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示（圖2），不同昆蟲Knk聚為一支，說明不同昆蟲Knk序列具有較高同源性，故將其命名為OcKnk。

2.2 OcKnk表達特性

采用qRT-PCR檢測OcKnk組織部位和表皮不同天數(shù)表達特性（圖3），OcKnk在不同組織部位表達結(jié)果表明（圖3a）：OcKnk在體壁和前腸中表達最高，暗示其在表皮中發(fā)揮重要作用，將5齡不同日齡若蟲體壁解剖下來，進一步檢測其在不同日齡體壁表達（圖3b），結(jié)果表明其在5齡不同日齡均有表達，且其在5齡若蟲蛻皮前、后期表達量顯著提高，暗示其參與昆蟲蛻皮過程。

2.3 OcKnk生物學(xué)功能

將合成的dsGFP和dsOcKnk分別注射進入稻蝗體內(nèi)，24 h后檢測其在對照組和處理組的表達情況（圖4a），結(jié)果顯示注射dsOcKnk后，與對照相比，OcKnk表達量顯著降低，dsOcKnk沉默效率為98.5%。

表型觀察結(jié)果顯示（圖4b），注射dsOcKnk后，85%蟲體在蛻皮時脊線開裂，難以蛻去舊表皮，最終導(dǎo)致死亡，5%蟲體可蛻去舊表皮，但蟲體崩裂，組織暴露，最終死亡，10%蟲體蛻至成蟲，但活動力不強，行動緩慢，蛻皮后48 h內(nèi)死亡。表明OcKnk在中華稻蝗蛻皮過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

3 討論

昆蟲表皮是防止體內(nèi)水分蒸發(fā)和隔絕病原體侵害的重要結(jié)構(gòu)，對昆蟲的生長發(fā)育具有重要意義[24-25]。昆蟲表皮堅硬而富有彈性[26]，由幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)交聯(lián)組裝而成。其形成過程為幾丁質(zhì)纖維絲通過氫鍵聚合為幾丁質(zhì)微纖維，幾丁質(zhì)微纖維進一步與蛋白交聯(lián)形成水平的幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)，多個幾丁質(zhì)片層結(jié)構(gòu)以中心垂直軸為中心，以恒定的角度螺旋排列組裝形成致密的表皮結(jié)構(gòu)[12-15]。Knk為參與幾丁質(zhì)組裝的關(guān)鍵蛋白[16]。目前已在多個昆蟲中鑒定出Knk蛋白[22-23， 25， 27]。赤擬谷盜中鑒定出3個Knk蛋白，分別被命名為TcKnk、TcKnk2和TcKnk3，且不同蛋白的功能域具有多樣性，TcKnk含有信號肽，2個串聯(lián)的DM13功能域，多巴胺單加氧酶N端結(jié)構(gòu)域和C端的GPI-錨定位點。而TcKnk2不含信號肽和GPI-錨定位點，含有跨膜區(qū)。TcKnk3包含多個剪切子，不同剪切子因C端是否含有GPI-錨定位點而導(dǎo)致其功能域存在差異[19]。文獻報道DM13功能域參與氧化還原反應(yīng)中電子轉(zhuǎn)移，DOMON是結(jié)合幾丁質(zhì)的重要區(qū)域，是幾丁質(zhì)排列關(guān)鍵功能域[28-29]。本文采用生物信息學(xué)方法，將搜索獲得的1條OcKnk全長cDNA序列翻譯成相應(yīng)的氨基酸，并對其功能域進行分析，結(jié)果表明其含有信號肽，2個串聯(lián)的DM13功能域，多巴胺單加氧酶N端結(jié)構(gòu)域（DOMON）和C端的GPI-錨定位點。故推測其可能為OcKnk基因。進一步將其與其他昆蟲同源Knk序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明，其與其他昆蟲Knk以較高的置信度聚為一支，故將其命名為OcKnk。登錄號為MN603495。

昆蟲Knk在組織部位和發(fā)育階段的表達具有多樣性，果蠅中，DmKnk特異性表達于13期胚胎氣管和15期胚胎咽、后腸和表皮中[16]，DmKnk在幼蟲、蛹和成蟲期均有表達，且其在蛹化前后特定時間內(nèi)表達量顯著高于卵期和幼蟲期[18]。赤擬谷盜中，TcKnk特異性表達于幼蟲表皮和后腸以及卵期漿膜中，且其在整個胚后發(fā)育階段（幼蟲、蛹和成蟲期）均有表達[19]。本文中OcKnk表達于體壁、前腸和脂肪體中，同其他昆蟲一樣，體壁和前腸均來源于外胚層，均含有幾丁質(zhì)[12]，表明Knk在富含幾丁質(zhì)的組織中發(fā)揮作用，而其在脂肪體中表達量較高，可能由于脂肪體和氣管密布于昆蟲表皮上，解剖時由于部分氣管的粘連，導(dǎo)致OcKnk在脂肪體中表達量較高。此外，目前研究多集中于不同發(fā)育階段Knk表達，而對其在特定組織部位同一發(fā)育齡期動態(tài)變化情況研究較少，本文通過對不同組織部位檢測發(fā)現(xiàn)其在體壁中表達量較高;為了研究其對蛻皮的影響，將不同日齡的5齡若蟲體壁解剖下來，探究Knk的動態(tài)表達情況，結(jié)果表明OcKnk在不同日齡的5齡若蟲中均有表達，且其在蛻皮前后表達量較高，暗示其參與昆蟲蛻皮過程。

目前對于Knk功能研究多集中于全變態(tài)昆蟲中。果蠅中的DmKnk在多個組織部位中發(fā)揮功能。DmKnk參與胚胎氣管直徑的調(diào)節(jié)和形態(tài)結(jié)構(gòu)的維持。DmKnk突變體中，氣管橫截面由圓形變得不規(guī)則，氣管長度過度延伸，纏繞在一起，導(dǎo)致形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。同時突變體胚胎膨大，且頭部表皮結(jié)構(gòu)畸形并呈現(xiàn)黑色[16]。DmKnk參與翅形成和形態(tài)結(jié)構(gòu)的維持。采用RNAi沉默DmKnk表達后，蛹羽化為成蟲時，出現(xiàn)翅折疊不能伸展，翅卡在蛹中，出現(xiàn)斷翅或殘翅，甚至蟲體死亡等多種表型[18]。赤擬谷盜注射dsRNA后，不同發(fā)育階段（幼蟲-蛹-成蟲）均出現(xiàn)蛻皮困難，蟲體死亡的表型[22]。RNAi是功能基因檢測常用方法[30]，本文將OcKnk特異性dsRNA注射進入蟲體中對中華稻蝗功能基因進行研究，為了確保試驗可行性，首先對dsOcKnk沉默效率進行檢測，結(jié)果表明沉默效率高達98.5%，為進一步表型觀察順利進行提供保障。表型觀察結(jié)果顯示dsOcKnk可使中華稻蝗出現(xiàn)蛻皮致死的表型。同時翅出現(xiàn)一定程度殘缺，而該表型與果蠅翅殘缺表型相一致[18]。說明OcKnk對于翅形態(tài)結(jié)構(gòu)維持具有一定作用。但其是否影響幾丁質(zhì)排列，仍需進一步研究。本試驗結(jié)果明確了OcKnk參與中華稻蝗生長發(fā)育和蛻皮的生物學(xué)功能，篩選獲得的OcKnk將為中華稻蝗防治提供重要理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）