有色保健酒中7種微量元素的測定方法

姚明奇 ，向鵬程，戴余軍 ，王艷樹，湯新金，斯琴朝克圖 *

1.湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院（孝感 432000）；2.湖北省植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心（孝感 432000）；3.湖北省孝感市公共檢驗檢測中心（孝感 432000）；4.湖北省孝感市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心（孝感 432000）

據(jù)報道，自2017年開始，國內(nèi)白酒產(chǎn)量逐漸下降，因此許多商家選擇保健酒作為突破口，進行大規(guī)模生產(chǎn)、銷售。到2018年為至，國內(nèi)酒廠4萬多家，其中3千多家生產(chǎn)保健酒[1]。2012年保健酒市場規(guī)模130億元左右，總銷量超出100萬 t，保健酒行業(yè)正以年均30%的增速高速發(fā)展。保健酒市場成長為繼白酒、葡萄酒和啤酒之后，國內(nèi)酒業(yè)的第四大市場。但是由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)，保健酒飲用安全問題遭到消費者的廣泛質(zhì)疑。因此，中國酒業(yè)協(xié)會于2019年2月1日起批準(zhǔn)實施T/CBJ 5101—2019《保健酒》團體標(biāo)準(zhǔn)。新標(biāo)準(zhǔn)首次明確定義了保健酒的概念，并規(guī)定保健酒應(yīng)取得保健食品批號或備案。保健酒定義為以蒸餾酒、發(fā)酵酒或食用酒精為基酒，加入符合國家有關(guān)規(guī)定的原料、輔料或食品添加劑，經(jīng)注冊或備案，并聲稱具有保健功能的飲料酒。它適用于特定人群食用，有調(diào)節(jié)機體的功能，但不以治療為目的，并且對人體不產(chǎn)生任何急性、亞急性或慢性危害[2]。

食品和飲品中的微量元素組成和含量對消費者和健康護理專業(yè)人員而言都是非常重要的參考數(shù)據(jù)。人體內(nèi)的必需有益元素在體內(nèi)調(diào)節(jié)著各種生理功能，并與人體的健康狀況有著千絲萬縷的聯(lián)系。但極微量重金屬有毒元素會嚴重損害健康甚至致死。因此，在食品及食品工業(yè)生產(chǎn)中嚴格控制其含量。微量元素銅（Cu）、鐵（Fe）、鈣（Ca）、鎂（Mg）、鋅（Zn）、錳（Mn）等元素都是人體所必需的微量有益元素，在人體的酶系、氧化代謝、生長發(fā)育、防御調(diào)控、信息傳遞等生理過程中發(fā)揮著不可替代的作用。但同時這些微量元素在人體內(nèi)大量蓄積時會導(dǎo)致慢性中毒，極易對身體內(nèi)的臟器造成負擔(dān)，特別是肝臟和腎臟等器官，從而導(dǎo)致人體內(nèi)的新陳代謝出現(xiàn)紊亂，影響人體健康[3-5]。鎘（Cd）元素毒性較大，是人體非必需元素，在人體內(nèi)代謝、排泄速度緩慢，半衰期長，在世界上被稱為第三大有害金屬[6]。葡萄酒等有色酒中的微量元素來源可能與其生產(chǎn)區(qū)域、添加原材料、土壤、當(dāng)?shù)貧夂?、原材料的耕種方式、酵母、釀造工藝、運輸和儲存方式和時間，甚至與生產(chǎn)設(shè)備相關(guān)[7-9]。

微量元素檢測方法有電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法、電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICPOES）法，火焰原子吸收（F-AAS）法和電熱原子吸收光譜（ET-AAS）法等[10-15]。其中火焰原子吸收法在國內(nèi)應(yīng)用最廣泛、操作方法簡便，而且無論檢測費用還是儀器設(shè)備購買費用都相對較低，檢測方法易于推廣。如果樣品前處理方法簡單，試劑易得，一般實驗室里都可完成相關(guān)檢測。因此，建立一種經(jīng)過簡單的混酸濕法消解，采用火焰原子吸收分光光度法測定有色保健酒中Cu、Fe、Ca、Mg、Zn、Mn和Cd等7種微量元素的檢測方法，并選擇市場常見的有色保健酒和暫未上市的有色保健酒作為檢測對象，驗證檢測方法的可行性，為食品安全監(jiān)控提供操作簡單、安全、費用低、有效且可靠的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

日立ZA-3000火焰原子吸收光譜儀（配鈣、鎂、鋅、鐵、銅、鎘、錳空心陰極燈，日立高新技術(shù)有限公司）；恒溫電熱板（上海科信電子科技有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；Direct-Q3超純水系統(tǒng)（美國密理博（Millipore）公司）；JOYN-30AL型智能超聲波清洗機（上海喬躍電子有限公司）；常用玻璃儀器在使用前均于鹽酸與硝酸混合液中浸泡過夜，在超聲波清洗器中洗凈，用去離子水沖洗3次備用。

1.2 藥品與試劑

有色酒樣（千古一方，武漢唐樂生物科技股份有限公司）；勁酒（湖北省黃石市勁牌有限公司）。

單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（國家有色金屬及電子材料分析測試中心）：Ca（1 000 μg/mL，GSB 04-1720-2004）、Fe（1 000 μg/mL，GSB 04-1726-2004）、Mg（1 000 μg/mL，GSB 04-1735-2004）、Cd（1 000 μg/mL，GSB 04-1721-2004）、Mn（1 000 μg/mL，GSB 04-1736-2004）、Zn（1 000 μg/mL，GSB 04-1771-2004）、Cu（1 000 μg/mL，GSB 04-1725-2004）。

硝酸（分析純，德國默克股份兩合公司）；鹽酸（分析純，德國默克股份兩合公司）；高氯酸（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；氧化鑭（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；等。

各元素標(biāo)準(zhǔn)使用液（200 μg/mL）：用移液器準(zhǔn)確吸取10 mL各元素標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 mL容量瓶中，用0.5 mol/L硝酸定容至刻度（Ca和Mg用5%稀鹽酸），混勻。

各元素標(biāo)準(zhǔn)加標(biāo)使用液（10 μg/mL）：用移液槍準(zhǔn)確吸取1.25 mL 200 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液于25 mL容量瓶中，用0.5 mol/L硝酸定容至刻度（鈣和鎂用5%稀鹽酸），混勻。

鑭溶液（20 g/L）的配制：準(zhǔn)確稱取23.45 g氧化鑭，先用少量水潤濕，然后再加75 mL鹽酸（1+1）充分攪拌至完全溶解，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶，用超純水定容至刻度，混勻。

硝酸+高氯酸（4∶1）：用量筒準(zhǔn)確量取200 mL濃硝酸和50 mL高氯酸充分攪拌混勻。

5%鹽酸溶液：用量筒準(zhǔn)確量取50 mL濃鹽酸，將其緩慢加入到適量的水中稀釋，將該溶液定容至1 000 mL，混勻。

0.5 mol/L硝酸：用移液管準(zhǔn)確吸取32 mL濃硝酸，將其緩慢加入到適量水中稀釋，定容至1 000 mL，混勻。

鹽酸（1+1）：用量筒準(zhǔn)確量取50 mL濃鹽酸，將其緩慢加入到適量的水中稀釋，定容至100 mL，混勻。

1.3 樣品制備

準(zhǔn)確量取10 mL保健酒樣品置于清潔干燥的250 mL錐形瓶中，于通風(fēng)櫥中在60～80 ℃恒溫電熱板上，去除樣品中的酒精及醇類物質(zhì)。觀察瓶底剩余液體1～2 mL時取下置于桌面以余溫蒸發(fā)至1 mL左右。待其冷卻至室溫后加入10 mL預(yù)先配制好的混酸消解液（硝酸+高氯酸，4∶1），在通風(fēng)櫥中置于140～160℃的恒溫電加熱板上，并在錐形瓶口放置一個小漏斗。加熱消解過程中保持樣品微冒泡但不可沸騰，時刻觀察瓶內(nèi)樣品混合液的顏色，發(fā)現(xiàn)有顏色加深現(xiàn)象需立刻添加適量消解液以防止碳化。一直加熱消解至錐形瓶內(nèi)底部凸起，邊緣剩余少許液體約2 mL且溶液澄清透明冒出大量白煙時停止加熱，取下冷卻至室溫后加入3 mL去離子水繼續(xù)加熱消解，直到有少許白煙，且瓶底約2 mL時取下以余溫蒸干至1 mL左右。冷卻至室溫后，每次加入少量0.5 mol/L硝酸溶液進行沖洗，鈣和鎂的測定組用5%稀鹽酸沖洗，共沖洗5次后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，同時加入2.5 mL 20 g/L的鑭溶液，最終用超純水定容至刻度，備用。其中每個樣品平行處理3份，每份平行測定3次，做全程空白試驗。用0.45 μm的微孔濾膜過濾待測。空白樣品進行同樣處理，待測。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別準(zhǔn)確量取各元素標(biāo)準(zhǔn)使用液（200 μg/mL），配制成質(zhì)量濃度梯度分別為0，0.5，1.0，1.5和2.0 μg/mL的鈣和錳標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；0，0.2，0.4，0.6和0.8 μg/mL的鐵標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；0，0.2，0.4，0.8和1.2 μg/mL的銅標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；0，0.2，0.4，0.8和1 μg/mL的鎘標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；0，0.05，0.10，0.15和0.20 μg/mL的鎂標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；0，0.1，0.2，0.3和0.4 μg/mL的鋅標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。其中，鈣和鎂用5%鹽酸定容，其余元素均用0.5 mol/L硝酸定容。以1% HNO3或5%鹽酸作空白對照，由稀到濃依次測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 準(zhǔn)確度與精密度

向酒樣中加入適量10 μg/mL各元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使各元素濃度分別為20，60和180 μg/L。采用1.3小節(jié)中方法制備，用原子吸收分光光度儀檢測，回收率采用單點校正法計算。同1 d內(nèi)每個濃度5個平行，計算日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，每種樣品重復(fù)5 d，計算日間相對偏差。檢測時加標(biāo)前樣品作為空白對照，減除背景值，計算其回收率。

回收率=[加標(biāo)液濃度（μg·L-1）/空白樣品濃度（μg·L-1）]/加標(biāo)液濃度（μg·L-1）×100% （1）

2 結(jié)果與分析

2.1 定量分析方法學(xué)驗證

2.1.1 儀器最佳工作條件

通過不同元素的特性及儀器的參考推薦值，燈電流在5～12.5 mA的推薦范圍內(nèi)選取5.0，7.5，10.0和12.5 mA常用值依次測試，燃燒器高度在5～12.5 mm范圍內(nèi)選用5.0，7.5，10.0和12.5 mm常用值測試，狹縫寬度在0.2，0.4和1.3 nm范圍內(nèi)測試，其他條件均采用儀器推薦固定值，根據(jù)不同條件下的吸光度，確定每種元素在工作范圍內(nèi)的最佳測定值。結(jié)果表明，在表1所示設(shè)定值條件下儀器運行穩(wěn)定，回收率和精密度可靠，獲得的測定值均能滿足測樣條件。

表1 儀器最佳工作條件

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系

在表1所示條件下對Cu、Mn元素標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定。每個試樣平行重復(fù)3次，取其平均值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各元素線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明，各元素在設(shè)定濃度范圍之內(nèi)有著良好線性關(guān)系和相關(guān)性，滿足定量分析要求。

2.1.3 儀器檢出限

空白消解液在表1所示條件下依次檢測，平行重復(fù)3次，所得吸光度平均值代入回歸方程，結(jié)果的3倍值作為檢測限。得到結(jié)果：Ca 6.00 μg/L，Mg 0.00 μg/L，Zn 0.00 μg/L，F(xiàn)e 13.00 μg/L，Cu 3.00 μg/L，Mn 2.00 μg/L，Cd 3.00 μg/L。

表2 各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程與相關(guān)系數(shù)

2.1.4 回收率與精密度

2種有色保健酒中不同元素添加回收率見表3。結(jié)果表明，7種元素在2種有色保健酒中回收率在85.08%～109.58%之間，RSD為0.13%～4.82%，均可滿足定量分析方法需要。

表3 元素在保健酒中加標(biāo)回收率（n=3）

2.2 有色保健酒中7種元素含量測定

采用濕法消解2種有色保健酒中7種元素總含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，所選保健酒勁酒中各元素濃度順序為Ca＞Mg＞Fe＞Cu＞Zn＞Mn＞Cd；在千古一方保健酒中的各元素濃度順序為Ca＞Mg＞Mn＞Fe＞Zn＞Cu＞Cd。其中，鈣元素含量最高，鎘元素含量最低。2種酒相比較，千古一方保健酒中的各元素含量均比勁酒高。

表4 保健酒中7種元素含量（n=3）

3 討論與結(jié)論

保健酒成分復(fù)雜，原料來源多樣，對產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控帶來較為嚴重的影響，極易產(chǎn)生不確定的多種干擾。保健酒中金屬元素可能來自白酒基酒、各種中藥材、包裝材料等。其中，某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)不符合規(guī)范，則會引入不確定的雜質(zhì)，使酒中的成分含量以及風(fēng)味品質(zhì)發(fā)生變化。其次商品中加入的檸檬酸、香精、防腐劑、酒的顏色等都會對檢測方法產(chǎn)生干擾。因此，建立有色保健酒中的微量元素檢測方法過程中，要根據(jù)樣品特性選擇合適的前處理方法，最大程度消除干擾，保證檢測方法的穩(wěn)定性和可靠性。

在現(xiàn)有文獻報道和國標(biāo)方法[6,16-26]的基礎(chǔ)上，選擇嘗試5種前處理方法：（1）取10 mL樣品于100 mL容量瓶中稀釋后直接進樣；（2）取10 mL樣品首先在電熱板上蒸發(fā)除去乙醇及酯類物質(zhì)，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶并用去離子水定容，進樣；（3）取10 mL樣品，蒸發(fā)去除乙醇及酯類物質(zhì)，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶并用0.5 mol/L硝酸定容，進樣；（4）取10 mL樣品，蒸發(fā)去除乙醇及酯類物質(zhì)后加入10 mL濃硝酸消解，進樣；（5）取10 mL樣品，加熱蒸發(fā)去除乙醇及酯類物質(zhì)后加入10 mL濃硝酸和高氯酸（4∶1，V/V）的混酸置于恒溫電熱板上消解，直至剩余1～2 mL且澄清透明，冷卻至室溫用，0.5 mol/L硝酸定容，進樣。經(jīng)過多次試驗，發(fā)現(xiàn)方法（1）的試樣中含有較多的懸浮顆粒，體系顏色過深，不僅會堵塞進樣管道而且顏色會極大影響檢測結(jié)果。進一步將試樣過濾后測定，其回收率較低。原因主要是未經(jīng)過處理，試樣背景指數(shù)高，在測定波長處干擾物質(zhì)過多。方法（2）和（3）相比與方法（1），試樣中懸浮物顆粒減少，顏色也變淺。但是稀硝酸定容體系中存在的酸性環(huán)境使得部分元素測得吸光度較大，還存在較大的基質(zhì)干擾，所測吸光度飄忽不定，穩(wěn)定性較差。方法（4）的消解基本上能將有機物質(zhì)消解完全，但仍然存在一定的顏色干擾，且很難通過增加消解液的量來徹底消除，影響結(jié)果的準(zhǔn)確度。另外，那海秋等[27]用不同前處理方法處理并測定保健食品中鈣元素時對比發(fā)現(xiàn)，干法消解過程中受環(huán)境影響比較大，周期長，不利于多樣品平行處理分析。濕法消解過程中因空氣中的干擾物質(zhì)污染，造成試樣測量誤差，且樣品加熱時受熱均勻?qū)е绿蓟葐栴}。而微波消解相對簡單可靠，密閉環(huán)境受外間環(huán)境干擾較少，所需試劑量少，周期短，利于大批量同時處理測定且批次之間回收率及重現(xiàn)性好。周雅蘭等[28]用微波消解法處理測定啤酒中多種微量元素，獲得滿意結(jié)果。根據(jù)文獻報道和多次嘗試后發(fā)現(xiàn)，方法（5）的混酸濕法方法可大批量處理樣品，且操作簡單易行。但是在實際操作過程中發(fā)現(xiàn)整個過程消耗試劑多，費時，有時樣品消解不完全。因此，試驗在此方法基礎(chǔ)上以簡化步驟、細化操作精度作為重點，進行進一步優(yōu)化。主要改進的步驟：消解時取小型漏斗置于錐形瓶口增加瓶內(nèi)溫度及形成回流，讓消解液蒸發(fā)速度減慢，消解過程更徹底，可避開富集處理；對于鈣、鎂、鋅、鐵活潑的堿金屬元素，為避免基質(zhì)干擾，選擇使用鑭溶液；進樣前的試樣過濾方法改為靜置幾分鐘，既避免試樣中少量針狀晶體造成進樣管道堵塞，又消除過濾導(dǎo)致的交叉污染和試樣損失。

試驗結(jié)果表明，建立的有色保健酒中7種微量元素定量分析方法的前處理過程簡便易行，不用富集，可大批量同時處理。所用試劑均是實驗室常備試劑，檢測費用低，操作安全。最低檢測限為0～13.00 μg/L；標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍廣，相關(guān)系數(shù)為0.999 4～0.999 9；回收率為85.08%～109.58%，RSD為0.13%～4.82%，均可滿足定量分析方法學(xué)要求。方法所用儀器為火焰原子吸收分光光度儀，具有選擇性好、靈敏度高、簡單易操作、抗干擾能力強等優(yōu)點，可直接快速檢測。所選2種有色保健酒中的7種元素中Ca和Mg含量較高，Cd含量最低。