氫化物-原子熒光光譜法測定雞蛋中的硒

耿敬章 ，馬瑞，許亞麗，賀博，唐德劍，楊水云*

1.西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，陜西省營養(yǎng)與健康工程研究中心（西安 710049）；2.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院（漢中 723000）；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部富硒產(chǎn)品開發(fā)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（安康 725000）

硒為人體必不可少的微量元素，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成及維持體內(nèi)氧化還原反應(yīng)平衡的重要作用[1]。隨著對營養(yǎng)健康的日益重視，富硒產(chǎn)品日益受到青睞。富硒產(chǎn)品以硒元素含量高而出名，其中添加的硒形式有無機(jī)硒和有機(jī)硒2種，無機(jī)硒一般指亞硒酸鹽和硒酸鹽，有機(jī)硒多與蛋白質(zhì)或氨基酸結(jié)合而成，具有代表性的是硒代硫蛋氨酸[2-3]。大量研究表明無機(jī)硒攝取后會產(chǎn)生較大副作用，有機(jī)硒形式才是對人體安全且生物利用度較高的硒形式。在利益驅(qū)使下，不良商人會用無機(jī)硒冒充有機(jī)硒富硒產(chǎn)品，以次充好，如用高濃度硒酸鹽溶液浸泡雞蛋獲取“富硒雞蛋”[2]，在茶葉上面噴灑硒酸鹽噴霧提高硒含量等[4-5]，這不僅損害消費(fèi)者利益，更對消費(fèi)者身心安全帶來威脅，為健全市場監(jiān)管機(jī)制，預(yù)防含過量無機(jī)硒產(chǎn)品的危害，建立一個科學(xué)有效的無機(jī)硒在總硒中占比的檢測方法，檢驗(yàn)富硒產(chǎn)品有機(jī)硒（或無機(jī)硒）在總硒中占比，評估富硒食品的安全可靠性就顯得非常重要[6-7]。

試驗(yàn)主要針對富硒雞蛋有機(jī)硒占比測定方法而展開研究，利用國家標(biāo)準(zhǔn)中氫化物原子熒光光譜法對雞蛋中總硒進(jìn)行測定，通過雞蛋內(nèi)容物的性質(zhì)優(yōu)化無機(jī)硒和有機(jī)硒的分離方法，用氫化物原子熒光光譜法對無機(jī)硒含量進(jìn)行測定，用差減法獲得有機(jī)硒占比數(shù)據(jù)，建立有效的測定雞蛋產(chǎn)品中有機(jī)硒的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒雞蛋（市售）；三氯乙酸、NaOH、硼氫化鉀、環(huán)己烷、鹽酸、硝酸等（均為分析純）；硒標(biāo)準(zhǔn)液（質(zhì)量濃度1 mg/mL，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心），取0.02 mL的1 mg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液定容于100 mL，低溫保存。

1.2 儀器與設(shè)備

湘儀H1650R離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；EHD-24電熱趕酸儀（北京東航科儀儀器有限公司）；Mars6高通量密閉微波消解系統(tǒng)（美國CEM公司）；LC-AFS 6500液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀（北京海光）；UV-8000S紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；DHG-914OA鼓風(fēng)干燥箱（上海恒科學(xué)儀器有限公司）；BCD-258WDPM無霜冷藏冷凍箱（青島海爾股份有限公司）；KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.3 溶液配制

50%三氯乙酸母液：稱取50 g三氯乙酸溶解在100 mL去離子水中。0.02 μg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)液：取0.02 mL的1 000 μg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液定容于100 mL，低溫保存。1 μg/mL硒使用液：取0.1 mL的1 000 μg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液定容于100 mL，低溫保存。5%鹽酸溶液：量取50 mL鹽酸，緩慢加入950 mL去離子水中，混勻。20%鹽酸溶液：量取20 mL鹽酸，緩慢加入80 mL去離子水中，混勻。5 g/L氫氧化鈉溶液：稱取5 g氫氧化鈉，溶于1 000 mL去離子水中，混勻。8 g/L硼氫化鉀堿溶液：稱取8 g硼氫化鉀，溶于5 g/L氫氧化鈉溶液中，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 總硒檢測

參照GB 5009.93—2017《國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測定》執(zhí)行[8]。

繪制硒標(biāo)準(zhǔn)曲線，以鹽酸溶液（20∶80）為載流，硼氫化鉀堿溶液（20 g/L）為還原劑，設(shè)置硒標(biāo)準(zhǔn)系列濃度1.0，2.0，4.0，8.0，12.0和20.0 μg/L，選取自動配制硒標(biāo)準(zhǔn)溶液。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取0.5 g（精確至0.001 g）樣品，加入消化管中，加8 mL硝酸于70 ℃預(yù)處理30 min，加2 mL過氧化氫于130 ℃預(yù)處理30 min，轉(zhuǎn)移管至微波消解儀中。設(shè)置條件：15 min升溫至180 ℃，恒溫消解30 min，15 min降溫。待消解結(jié)束冷卻后，放入趕酸儀加熱至近干，加2.5 mL鹽酸和2.5 mL去離子水，繼續(xù)加熱至近干，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用去離子水定容混勻，并做試劑空白待測。在樣品與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液測定條件相同情況下，將空白溶液和試樣溶液分別導(dǎo)入儀器，測定其熒光強(qiáng)度并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比定量。每種樣品均做3個平行樣和空白對照。

1.5 蛋清中無機(jī)硒的分離及測定

取1.5 mL三氯乙酸溶液（濃度50%），加入0.5 g蛋清樣品至5 mL離心管，加去離子水定容（調(diào)節(jié)終濃度至最佳濃度），并在相對離心力10 000 g條件下離心5 min，分離出大顆粒蛋白沉淀，收集上清液。所得上清用環(huán)己烷萃取，去除中間雜質(zhì)層（多為小分子蛋白質(zhì)和氨基酸），繼續(xù)萃取，直到界面清亮為一條線，收集水溶液，并稱其質(zhì)量。用氫化物原子熒光光譜法測定水溶液無機(jī)硒含量。

1.6 蛋黃中無機(jī)硒的分離及測定

取2 mL最佳聚乙二醇溶液（聚乙二醇分子量6 000），與0.5 g蛋黃原液直接混合于離心管，然后通過靜置，使蛋黃油脂發(fā)生相互凝集而自然沉降，并在相對離心力10 000 g條件下離心5 min，分離油脂沉淀，收集上清液。將1.5 mL三氯乙酸溶液（濃度50%）加入脫脂樣品于5 mL離心管中，用去離子水定容（調(diào)節(jié)終濃度至最佳）。以10 000×g離心5 min，分離油脂沉淀，收集上清液，所得上清用環(huán)己烷萃取，去除中間雜質(zhì)層繼續(xù)萃取，直到界面清亮為一條線，收集水溶液，并稱其質(zhì)量。用氫化物原子熒光光譜法測定水溶液無機(jī)硒含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 硒標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

按照儀器的最佳條件，確定硒的最佳線性范圍0～25 μg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=106.82x-29.84，曲線的相關(guān)系數(shù)R2=1，因此可利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線測定雞蛋中硒含量。按照儀器設(shè)定的檢出限程序，經(jīng)計算得出儀器檢出限為0.002 μg/g。

2.2 所建方法的加樣回收率與精密度

分別在蛋清和蛋黃中加入樣品量80%，100%和120%的0.5 mg/L硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組各測定3次共9次，計算加樣回收率與精密度，蛋清加標(biāo)無機(jī)硒樣回收率為86.3%，RSD值為5.6%，可信度較高，證明所建方法通過15%三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)及環(huán)己烷萃取對蛋清的分離方法較為可靠。蛋黃加標(biāo)無機(jī)硒樣回收率為81.6%大于80%，RSD值為4.4%（n=6），可信度較高，證明所建方法通過3%聚乙二醇除油脂、15%三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)及環(huán)己烷萃取對蛋黃的分離方法較為可靠。

2.3 雞蛋總硒測定及有機(jī)硒占比

通過氫化物原子熒光光譜法對蛋清蛋黃分別做3組平行，共6組數(shù)據(jù)測得雞蛋不同部分總硒含量，結(jié)果如表1所示。通過對蛋清蛋黃分別進(jìn)行分離處理，做3組平行，借助氫化物原子熒光光譜法測得無機(jī)硒含量，蛋清、蛋黃中無機(jī)硒的測定結(jié)果如表2所示。

由表1可知，蛋清、蛋黃總硒含量分別為0.073 561±0.003 49 μg/g和0.454 981±0.005 419 μg/g，雞蛋內(nèi)的硒主要存在于蛋黃，且蛋黃硒是蛋白硒的6倍以上。測定的RSD數(shù)值分別為0.64%和2.6%，說明所測數(shù)據(jù)可信度較高。

表1 雞蛋各部分總硒含量

由表2可知，試驗(yàn)條件下，所測無機(jī)硒含量數(shù)據(jù)均為0，故RSD數(shù)值為0，原因可能是所取富硒雞蛋無機(jī)硒含量較低無法檢測出，由于氫化物原子熒光光譜法在稱樣量為1 g，定容體積為10 mL時，方法的檢出限為0.002 μg/g，因而無機(jī)硒含量可能小于0.002 μg/g，此時蛋清中有機(jī)硒占比最少，約97.3%，蛋黃中有機(jī)硒占比最少，約99.6%。

表2 雞蛋各部分無機(jī)硒含量

3 結(jié)論

建立測定雞蛋中無機(jī)硒和有機(jī)硒的方法，蛋清通過三氯乙酸沉淀脫除蛋白，蛋黃通過聚乙二醇脫脂、三氯乙酸沉淀脫除蛋白后，經(jīng)微波消解后可直接測定雞蛋中無機(jī)硒和有機(jī)硒含量，線性范圍在0～20 μg/g之間，無機(jī)硒檢出限為0.002 μg/g，方法加樣平均回收率在81.6%～86.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=3）在0.64%～2.6%之間。該方法操作簡單、靈敏度高、回收率好，適合富硒雞蛋總硒和有機(jī)硒的測定。

結(jié)果表明，雞蛋中的硒主要存在于蛋黃中，蛋黃中的硒含量約是蛋清中硒含量的6倍。通過3%聚乙二醇脫脂，15%三氯乙酸沉淀蛋白，實(shí)現(xiàn)有機(jī)硒與無機(jī)硒的有效分離，方法較為可信。