HPLC-ABTS+·在線檢測(cè)快速評(píng)價(jià)茶葉總抗氧化能力

王丹，時(shí)志春，李軍，王金蘭，張樹(shù)軍，趙明

齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院（齊齊哈爾 161006）

茶葉為山茶科植物茶（Camellia sinensis（L.）O.Ktze.）的芽、葉，其含有豐富的茶多酚、茶多糖、維生素及礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖和降血脂等[1-3]功效，是天然酚類抗氧化劑的主要來(lái)源，能有效清除自由基，抑制活性氧的形成，具有良好的抗氧化能力[4]。茶多酚是從綠茶和紅茶中提取的一種純天然復(fù)合物，具有清除自由基、防止DNA受損、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)及抗癌等生物學(xué)功能[5]。茶多酚中以兒茶素類為主要成分，具有顯著的藥理作用，茶多酚含量占茶葉干重的30%左右[6]。近十幾年，評(píng)價(jià)和篩選具有強(qiáng)抗氧化活性的天然資源已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)研究的新趨勢(shì)。

物質(zhì)的總的抗氧化活性是指清除不同的自由基或者物質(zhì)的不同活性成分的有效和[7]。國(guó)內(nèi)外常用的測(cè)定總抗氧化活性的方法有DPPH法、ABTS法、ORAC法、FRAP法等。但是這些方法對(duì)于一些大規(guī)模的分析植物樣品抗氧化活性，存在著實(shí)驗(yàn)步驟較多的缺點(diǎn)，因此開(kāi)發(fā)了HPLC-DPPH法、銅離子在線檢測(cè)（HPLC-CUPRAC）法、在線HPLC-ABTS+·法[8-10]等多種HPLC在線檢測(cè)系統(tǒng)，可以高效快速地分析樣品的抗氧化活性。但是這些在線檢測(cè)法的重點(diǎn)是確定單體化合物是否具有抗氧化活性[11-13]，利用抗氧化活性綜合指數(shù)（Antioxidant potency composite，APC）評(píng)價(jià)樣品抗氧化能力[14]，并不能直接快速地?fù)Q算成標(biāo)準(zhǔn)抗氧化物質(zhì)當(dāng)量來(lái)表示樣品的總抗氧化能力大小，同時(shí)定性定量樣品的總抗氧化活性。為了實(shí)現(xiàn)在線快速檢測(cè)茶葉水提物的總抗氧化活性，此次試驗(yàn)建立一種利用在線HPLC-ABTS+·檢測(cè)系統(tǒng)，快速高效地測(cè)定總混合物抗氧化活性的分析測(cè)定方法，并基于傳統(tǒng)的離線DPPH自由基清除法評(píng)價(jià)，驗(yàn)證了利用在線HPLCABTS+·系統(tǒng)研究的實(shí)用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉樣品均為市售品：花茶（福建福州）；鐵觀音（福建安溪）；綠茶（西湖龍井；信陽(yáng)毛尖）。水為娃哈哈純凈水。兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司，純度98%以上）；ABTS（2,2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽）；DPPH（2,2′-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）；過(guò)硫酸鉀（上海凌峰，分析純）；無(wú)水乙醇（分析純）；甲醇（山東禹王，色譜純）。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1260在線高效液相色譜系統(tǒng)（配有二元梯度泵、ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、光電二極管陣列 DAD檢測(cè)器）；柱后反應(yīng)系統(tǒng)（配有柱后衍生單元泵、柱后反應(yīng)線圈、三通、MWD多波長(zhǎng)檢測(cè)器）；Chemstation數(shù)據(jù)分析工作站（美國(guó)安捷倫公司）；RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TGL-16G型高速離心機(jī)（江蘇金壇市中大儀器廠）；BP 310S電子天平（賽多利斯公司）；酶標(biāo)儀（瑞士Tecan sunrise）。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

每個(gè)茶葉樣品經(jīng)40 ℃干燥后，粉碎過(guò)60目篩，分別準(zhǔn)確稱取2.0 g茶葉粉末于250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL純凈水，回流2 h，重復(fù)回流2次，冷卻后過(guò)濾蒸干稱重，制得的茶葉水提物于冰箱中4 ℃保存，備用。

1.3.2 溶液的配制

DPPH自由基溶液的配制：準(zhǔn)確稱取7.5 mg DPPH粉末于20 mL無(wú)水乙醇中，配制成質(zhì)量濃度為0.375 mg/mL的DPPH溶液，在4 ℃冰箱中避光保存，備用。

ABTS+·溶液的配制：采用2 mmol的ABTS水溶液和3.5 mmol的K2SO4水溶液混合，用8倍體積的娃哈哈純水稀釋，室溫避光保存，過(guò)夜后加入系統(tǒng)溶劑瓶中。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為甲醇；流動(dòng)相B為水；流速為1.0 mL/min；梯度洗脫：0～5 min 25% A，5～10 min 25%～30% A，10～15 min 30%～40% A，15～20 min 40% A，20～30 min 40%～70% A；進(jìn)樣體積為10 μL；柱溫為25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；ABTS+·溶液流動(dòng)相流速為0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為734 nm。

1.3.4 樣品抗氧化活性測(cè)定

1) HPLC-ABTS+·在線抗氧化活性測(cè)定。分別取不同茶葉提取物浸膏置于容量瓶中，配制成2.0，3.0和4.0 mg/mL甲醇溶液，離心后，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，將濾液置于棕色進(jìn)樣瓶中待測(cè)。將處理后的樣品提取液按照1.3.3小節(jié)進(jìn)行HPLC-ABTS+·在線系統(tǒng)分析，進(jìn)樣量為10 μL。柱后衍生分析系統(tǒng)參照文獻(xiàn)[15]方法，ABTS+·溶液引入流速為0.5 mL/min，MWD檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為734 nm。

2) DPPH自由基清除能力測(cè)定。自由基清除試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[16]的方法，設(shè)置2個(gè)試驗(yàn)組：空白組（A0），20 μL無(wú)水乙醇+180 μL DPPH溶液；樣品組（A1），20 μL待測(cè)樣品+180 μL DPPH溶液。分別取20.0 μL配制好的不同濃度的樣品溶液至96孔板中，向其中分別加入180.0 μL的DPPH溶液，輕輕振蕩，使其充分混合，避光反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀在517 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度。各試驗(yàn)組設(shè)2個(gè)平行孔，重復(fù)試驗(yàn)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取20.0 mg兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解定容至10 mL棕色容量瓶中，制成2.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋，制備2.0，1.5，0.75，0.375和0.062 5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣；記錄檢測(cè)波長(zhǎng)為734 nm的倒峰面積。

用兒茶素的質(zhì)量濃度（x）與其對(duì)應(yīng)的色譜倒峰面積（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。回歸方程和相關(guān)系數(shù)為：y=14 594x+2 733.8（R2=0.999 1）。兒茶素在0.062 5～2.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。經(jīng)HPLC測(cè)定，以信噪比（S/N）為3和10所對(duì)應(yīng)樣品中該物質(zhì)的質(zhì)量濃度分別計(jì)算檢限測(cè)（LOD）和定量限（LOQ），兒茶素檢測(cè)限檢出限為0.2 μg/mL，定量限為1.0 μg/mL。利用兒茶素抗氧化當(dāng)量（Catechin equivalent antioxidant capacity，CEAC）換算樣品的總抗氧化活性測(cè)定值，從而實(shí)現(xiàn)分析樣品的總抗氧化能力。

圖1 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 儀器精密度的考察

精密吸取10 μL 1.5 mg/mL的兒茶素對(duì)照品溶液，按上述測(cè)定條件連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算得兒茶素測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD），為1.77%，精密度滿足方法學(xué)定量要求。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批次茶葉樣品，各5份，按照上述供試溶液的制備方法和測(cè)定條件，制備5份供試溶液并測(cè)定，對(duì)同一批次樣品多次取樣分析，RSD為1.98%，表明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.4 基于HPLC-ABTS+·法測(cè)定不同茶葉提取物的總抗氧化能力分析

利用HPLC-ABTS+·系統(tǒng)已經(jīng)測(cè)得的樣品倒峰總面積代入兒茶素建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將不同濃度樣品抗氧化活性以兒茶素當(dāng)量（Catechin equivalent antioxidant capacity，CEAC）表示，測(cè)試結(jié)果如表1所示，所得數(shù)值 CEAC 值越大，表示抗氧化能力越強(qiáng)。

由表1可知，由HPLC-ABTS+·法測(cè)定的4種茶葉抗氧化能力由大到小的順序依次是花茶＞西湖龍井＞信陽(yáng)毛尖＞鐵觀音。其中花茶的抗氧化能力表現(xiàn)最強(qiáng)，分析結(jié)果如圖2所示；兩種綠茶類茶葉抗氧化能力相當(dāng)，且均強(qiáng)于烏龍茶類的鐵觀音。由圖2可以看出，花茶在線系統(tǒng)反應(yīng)后的倒峰較多且吸光度較大，鐵觀音的倒峰較少且吸光度較弱。

兒茶素是茶多酚最具生物活性的部分[17]，在發(fā)酵過(guò)程中，酚類氧化酶氧化兒茶素生成醌類，然后形成Bisflavanol、Thearubigen、茶黃素等物質(zhì)[18]。隨著發(fā)酵程度的加深，兒茶素含量迅速下降。表明發(fā)酵程度越高，抗氧化能力越低，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道的一致[19]。

2.5 DPPH法抗氧化活性驗(yàn)證

選用兒茶素作對(duì)照品，對(duì)4種茶葉用DPPH進(jìn)行抗氧化活性驗(yàn)證試驗(yàn)。分別稱取兒茶素及待測(cè)樣品，配制成100，80，60，40和20 μg/mL五種不同的質(zhì)量濃度，將配制好的待測(cè)樣品及兒茶素加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的小孔中，在避光條件下再分別加入180 μL DPPH乙醇溶液到每個(gè)孔中，反應(yīng)0.5 h后放入酶標(biāo)儀中，96孔板反應(yīng)液結(jié)果圖如圖3所示。

表1 待測(cè)樣品的抗氧化活性

圖2 花茶和鐵觀音的HPLC-ABTS+·在線抗氧化分析結(jié)果圖

圖3 不同茶葉樣品DPPH抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果圖

由圖4可知，不同茶葉樣品的DPPH自由基清除率均隨質(zhì)量濃度增加而增加，其清除能力比兒茶素略低。在517 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，經(jīng)計(jì)算得待測(cè)樣品及兒茶素的IC50值。由表2可以看出，在DPPH自由基的反應(yīng)體系中，各種茶葉樣品對(duì)自由基的清除能力差異較大，其清除能力依次為兒茶素＞花茶＞西湖龍井＞信陽(yáng)毛尖＞鐵觀音。

圖4 不同茶葉樣品對(duì)DPPH自由基清除率的影響

表2 樣品及兒茶素抗氧化活性的IC50

3 結(jié)論

HPLC-ABTS+·在線抗氧化檢測(cè)系統(tǒng)是指通過(guò)HPLC系統(tǒng)與柱后衍生系統(tǒng)連接起來(lái)，在線分析抗氧化活性，使樣品提取物可以隨著流動(dòng)相被洗脫出來(lái)，并與另一個(gè)泵的ABTS+·自由基溶液反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果以自由基溶液色譜倒峰圖體現(xiàn)。倒峰總面積越大，代表被清除的自由基越多，樣品的總抗氧化活性越強(qiáng)。該方法樣品自動(dòng)進(jìn)樣，分析時(shí)間短，克服了離線抗氧化活性分析過(guò)程中操作過(guò)程繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)，減少了人為操作過(guò)程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

此次試驗(yàn)以不同茶葉為研究對(duì)象，采用在線HPLC-ABTS+·法證實(shí)茶葉提取物具有一定清除自由基能力，初步計(jì)算了抗氧化活性相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)抗氧化物質(zhì)的當(dāng)量值，同時(shí)與離線DPPH法測(cè)定提取物的總抗氧化活性進(jìn)行比較，大小趨勢(shì)基本一致。清除能力依次為兒茶素＞花茶＞西湖龍井＞信陽(yáng)毛尖＞鐵觀音，該方法可用于植物資源總抗氧化活性系統(tǒng)的快速評(píng)價(jià)。