維生素U含量測定方法的研究進(jìn)展

朱碧云，秦博文，馬霞*

1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院（上海 201418）；2.上海禾文農(nóng)業(yè)科技有限公司（上海 201107）

S-甲基甲硫氨酸（S-methylmethi onine，SMM），也稱維生素U，是一種功能性親水分子，具有α-氨基酸端基的陽離子結(jié)構(gòu)。Cheney等[1]不僅從甘藍(lán)汁中分離出該物質(zhì)，還驗(yàn)證了它對胃潰瘍的愈合和預(yù)防有益，所以其因潰瘍（Ulcer）一詞得名。顧名思義，維生素U是一種有效的抗?jié)儎?。維生素U不僅具有清除自由基的能力，還具有其他的藥用價(jià)值，例如鎮(zhèn)痛、降血脂、防輻射、明顯提高肝細(xì)胞的谷胱甘肽水平和抑制肝損傷等作用[2-4]。

目前在國內(nèi)維生素U主要是以一種合成胃藥的形式出現(xiàn)在公眾的視野中，碘甲烷法和氯甲烷法是人工化學(xué)合成維生素U常見的方法[5]。天然維生素U廣泛存在于自然界的植物中，特別是十字花科蕓薹屬植物。由于維生素U的化學(xué)結(jié)構(gòu)中有雙鍵，造成其具有不穩(wěn)定性的特征，維生素U在酸堿、熱、光等環(huán)境下易分解生成一種風(fēng)味物質(zhì)——二甲基硫醚（圖1），因此其分析測定都比較困難[6]。由于人工合成維生素U與天然維生素U的測定方法有所不同，因此對兩種不同來源的維生素U含量的測定技術(shù)和方法進(jìn)行總結(jié)，以期為這種特殊的“維生素”的研究和發(fā)展提供理論依據(jù)。

圖1 S-甲基甲硫氨酸（2）在酸堿、熱等條件下降解生成二甲基硫醚（1）反應(yīng)方程

1 藥品中維生素U的測定方法

維生素U包含兩種化學(xué)結(jié)構(gòu)：氯化甲基蛋氨酸（C6H14ClNO2S）和碘化甲基蛋氨酸（C6H14INO2S）[7]。維生素U常與氫氧化鋁、三硅酸鎂、顛茄浸膏等組成復(fù)方制劑，用于治療胃潰瘍和十二指腸潰瘍。目前市場上的制劑主要包括復(fù)方維U顛茄鉍鎂片、維U顛茄鋁鎂片和復(fù)方蘆薈維U片等[8]。針對此類藥品，目前建立的主要分析方法有銀量法、酸堿滴定法、電位滴定法、TLC薄層色譜技術(shù)、柱前衍生-高效液相色譜法。

1.1 滴定法

1.1.1 銀量法

銀量法，是采用硝酸銀（AgNO3）溶液作為滴定劑，測定能與Ag+反應(yīng)生成難溶性沉淀的一種滴定分析方法[9]。在酸性環(huán)境中，用硫氰酸銨反滴用過量硝酸銀滴定后的供試品，以硫酸鐵銨為指示劑，測定復(fù)合維生素U制劑中的維生素U含量。每毫升0.1 mol/L硝酸銀（AgNO3）溶液相當(dāng)于19.97 mg的C6H14ClNO2S。在國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中，銀量法最初采用硝基苯試劑來保護(hù)氯化銀沉淀，但硝基苯毒性大且易揮發(fā)。因此彭瑞平[10]采用雙次過濾法，對原法進(jìn)行了改進(jìn)。定量供試液通過干燥濾紙進(jìn)行二次過濾后再用硫氰酸銨滴定，該法的滴定突躍較原法明顯，又避免了有毒物質(zhì)的添加。該法雖然對銀量法進(jìn)行了改進(jìn)，但仍存在滴定終點(diǎn)不清晰，難以準(zhǔn)確判別；硫氰酸銨有害健康；實(shí)驗(yàn)操作繁瑣耗時(shí)等缺點(diǎn)。

1.1.2 酸堿滴定法

酸堿滴定法是指利用酸和堿在水中以質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)為基礎(chǔ)的滴定分析方法。惠白[11]針對維U顛茄鋁膠囊Ⅲ含量進(jìn)行測定，對供試液的處理方法進(jìn)行改進(jìn)。該藥在國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中維生素U含量的測定：將供試品用錘熔玻璃漏斗過濾后，經(jīng)中性甲醛固定，以酚酞為指示劑，用氫氧化鈉（NaOH）滴定液滴定。每毫升氫氧化鈉相當(dāng)于19.97 mg的C6H14ClNO2S。但由于供試品為乳濁狀，很難過濾，改進(jìn)后的方法，是將供試液過濾后再離心取上清液用于滴定。該法耗時(shí)少，由原法的6～10 h縮短為1 h左右，但酸堿滴定法的精密度與準(zhǔn)確性都不高，需要進(jìn)一步的改進(jìn)。

1.1.3 電位滴定法

電位滴定法是一種在滴定過程中通過測量電位變化以確定突躍指示終點(diǎn)的方法[12]。與傳統(tǒng)指示劑滴定法相比：電位滴定法可用于滴定突躍小或不明顯的滴定反應(yīng)；可避免有色或混濁試樣的干擾；裝置簡單，操作方便，可自動(dòng)化且精密度和準(zhǔn)確度高。陳莉[13]對傳統(tǒng)銀量法進(jìn)行改進(jìn)，采用電位滴定法，以硝酸銀（AgNO3）溶液測定維生素U制劑中的維生素U含量。該方法直接將用純水溶解過濾后的供試品用硝酸銀（AgNO3）溶液進(jìn)行電位滴定，實(shí)驗(yàn)操作簡單，避免了各種類型維生素U制劑中的輔料、其他成分以及滴定過程中產(chǎn)生的Ag+沉淀的影響；實(shí)驗(yàn)耗時(shí)少，由原法的2～3 h縮短至30 min左右，大大提高了工作效率；實(shí)驗(yàn)過程中不需要添加硝基苯、硫氰酸銨等有毒試劑，安全環(huán)保。但電位滴定對儀器的精度要求很高，精度不高，會(huì)對檢出限有一定的限制，對某些微量滴定來說，電位滴定法顯得有些力不從心。

1.2 色譜法

1.2.1 TLC薄層色譜技術(shù)

TLC薄層色譜技術(shù)又稱薄板層析技術(shù)，是一種最常見的分離分析方法，屬于固液吸附色譜，其兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)[14]。趙體慧等[15]為了測定維生素U片中的維生素U含量，建立了基于TLC色譜技術(shù)的快速檢測方法。該方法以95%的乙醇作為提取溶劑，正丁醇-丙酮-25%～28%氨水-水（40∶40∶8∶25）為流動(dòng)相，微晶纖維素為固定相，同時(shí)以茚三酮為顯色劑，可對維生素U片中的維生素U進(jìn)行分析和含量測定。TLC薄層色譜技術(shù)前處理方式簡單，設(shè)備廉價(jià)，操作方便，但其理論塔板數(shù)較低，分離效率不好且對生物高分子的分離結(jié)果不甚理想。

1.2.2 柱前衍生-高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）是色譜法的一個(gè)重要分支，其以氣相色譜理論為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實(shí)驗(yàn)和技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用小顆粒作為固定相，用高壓泵輸送流動(dòng)相建立而成[16]。因?yàn)榫S生素U的結(jié)構(gòu)中不具有紫外和熒光吸收的基團(tuán)，所以無法直接利用HPLC-UV進(jìn)行檢測。但由于維生素U分子中含有氨基酸結(jié)構(gòu)，可以利用該特點(diǎn)將氨基酸柱前衍生化后，建立柱前衍生-高效液相色譜法，以提高分析檢測的靈敏度和分離選擇性[17]。馬經(jīng)明等[18]對維U顛茄鋁膠囊中維生素U含量測定的方法進(jìn)行改進(jìn)，根據(jù)維生素U的特殊結(jié)構(gòu)，建立柱前衍生化HPLC檢測法測定其含量。以二硝基氟苯（FDNB）為柱前衍生劑，在碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液（pH 10.0）介質(zhì)中進(jìn)行衍生化反應(yīng)，以HPLC法測定含量。王林鳳[19]通過正交試驗(yàn)對維U顛茄鋁膠囊的HPLC柱前衍生條件進(jìn)行優(yōu)化，選用二硝基氟苯（DNFB）為柱前衍生劑，最佳衍生條件為：反應(yīng)溫度70 ℃，介質(zhì)pH 10.0，衍生劑DNFB與維生素U的摩爾比1∶3，反應(yīng)時(shí)間 40 min。維生素U的兩種構(gòu)型分別在8～40 μg/mL（r=0.999 2）和12～60 μg/mL（r=0.999 7）濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。該法得到的衍生產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定，色譜圖中樣品的各成分均達(dá)到基線分離，且色譜行為良好，方法準(zhǔn)確，精密度高、重復(fù)性好，為維U顛茄制劑中維生素U的含量檢測提供了新方法。但該法操作復(fù)雜，成本較高。

2 食品中維生素U的測定方法

植物和動(dòng)物中維生素U是由L-甲硫氨酸先轉(zhuǎn)化為S-腺苷甲硫氨酸，再通過甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的作用合成（圖2）[20]。維生素U是許多代謝途徑的中間體，其合成可降低游離甲硫氨酸及其活性衍生物S-腺苷甲硫氨酸的濃度[21]。測定食品系統(tǒng)中維生素U的含量，難點(diǎn)在于維生素U在植物和動(dòng)物體內(nèi)代謝的復(fù)雜性和其結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。近些年，國內(nèi)外研究者多將幾種檢測技術(shù)結(jié)合使用以精確定量測定維生素U。目前主要的方法是氨基酸分析儀、液相色譜法、質(zhì)譜法等之間的聯(lián)用。

圖2 維生素U在植物體內(nèi)的合成流程

2.1 液相色譜與氨基酸分析儀聯(lián)用

氨基酸分析儀是一種基于陽離子交換柱分離、柱后茚三酮衍生、光度法測定的離子交換色譜（IEC）法，它可用于水解氨基酸及游離氨基酸含量的測定，具有專一性且無需將待測氨基酸進(jìn)行柱前或柱后衍生的特性[22]。Ueda等[23]僅將西藍(lán)花干燥樣本經(jīng)檸檬酸鋰緩沖液萃取后，直接采用氨基酸分析儀定量測定西藍(lán)花中的維生素U。該方法簡便，但精確度低，未考慮維生素U結(jié)構(gòu)的特殊性。Kim[24]使用液相色譜（LC）與氨基酸分析儀聯(lián)用的方法測定26種食用植物中的維生素U含量，并且通過統(tǒng)計(jì)分析證明食用植物中各種游離氨基酸和維生素U含量水平之間不存在顯著聯(lián)系。該方法較前者分離效果好，具有較高的選擇性和靈敏度。

2.2 液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用

液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）是當(dāng)代最重要的分離和鑒定的分析方法之一，為食品和藥物等領(lǐng)域的分析檢測技術(shù)提供了廣闊的發(fā)展前景[25]。液相色譜技術(shù)的優(yōu)勢在于其分離效率高、選擇性好、檢測靈敏度高、操作自動(dòng)化及應(yīng)用范圍廣；但色譜法的缺點(diǎn)在于其定性能力較差。質(zhì)譜法不僅樣品用量極少，而且能提供豐富的結(jié)構(gòu)信息，但樣品檢測前需經(jīng)一定的分離、純化處理。為解決這兩種技術(shù)的弱點(diǎn)，經(jīng)過前人不斷的研究，發(fā)展了許多技術(shù)，其中色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)極具發(fā)展和應(yīng)用前景。Scherb等[26]首先開發(fā)利用穩(wěn)定同位素稀釋分析（SIDA）與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法，該方法用氘代碘甲烷標(biāo)記S-甲基甲硫氨酸，以量化食品樣品中的維生素U。SIDA與LC-MS/MS的聯(lián)用技術(shù)被證明具有高選擇性和高敏感性，其回收率為102.5%，平均標(biāo)準(zhǔn)偏差≤6%，表現(xiàn)出了良好的再現(xiàn)性。然而，該方法需要復(fù)雜的提取步驟以及優(yōu)化溫度的時(shí)間，有必要開發(fā)簡化的提取程序，優(yōu)化維生素U在食品中的定量方法。Morisaki等[27]利用氘代苯-d6作為S-甲基甲硫氨酸的內(nèi)標(biāo)，采用液相色譜-電噴霧-質(zhì)譜（LC-ESI-MS/MS）的方法實(shí)現(xiàn)了對大豆熱處理過程中維生素U含量變化的一個(gè)檢測。 Song等[28]在對十字花科家庭蔬菜中的維生素U進(jìn)行測定時(shí)，采用超高效液相色譜-電噴霧-質(zhì)譜（HPLC-ESI-MS/MSn）的方法，其檢出限達(dá)0.488～0.502 μg/mL，準(zhǔn)確度達(dá)98.84%（±4.77%）～109.12%（±2.63%）。該方法更為簡便快捷，結(jié)合HPLC-MS/MS，提供有關(guān)分子量和多級(jí)質(zhì)量檢測的重要數(shù)據(jù)，并且可以便于鑒定單個(gè)化合物。Deed等[29]建立了一種液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法與穩(wěn)定同位素稀釋（SIDA）法相串聯(lián)的技術(shù)來測定葡萄汁和葡萄酒中的維生素U，為釀造工業(yè)中檢測食用植物的維生素U含量提供了一種更為便捷的方法。

3 結(jié)語與展望

目前，國內(nèi)學(xué)者對維生素U的研究還是集中于藥物學(xué)方面，而國外學(xué)者早在20世紀(jì)就開始對食品中維生素U的含量進(jìn)行了一定的研究。隨著分析化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)的滴定法、薄層色譜技術(shù)在實(shí)驗(yàn)的精確度、選擇性和靈敏度等方面都有一定的制約，液相色譜技術(shù)以及各種高新技術(shù)的串聯(lián)方法也就應(yīng)運(yùn)而生。雖然這些方法操作簡便快捷，準(zhǔn)確度高，檢測限低，但是仍具有設(shè)備昂貴、操作難度較大等劣勢。因此，研究學(xué)者需要不斷的研究，開發(fā)出更為精準(zhǔn)、快捷、普及性和實(shí)用性高的分析技術(shù)和方法，為維生素U含量的測定研究提供可行性依據(jù)。