竹蟲蛋白的堿法提取及功能性質(zhì)測(cè)定

張芮嬌，朱靜靜，劉紹芳，高斌，馮勵(lì)

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院（昆明 650201）

竹蟲又稱為竹蛆，是螟蛾科（Pyralidae）禾草螟屬（Chilo）的昆蟲，竹蟲的食用蟲態(tài)為幼蟲，主要分布于云南省的西雙版納州、德宏州、紅河州等地區(qū)，是云南當(dāng)?shù)鬲?dú)具特色的民族食品昆蟲[1-2]。

國(guó)內(nèi)對(duì)竹蟲的研究較少，關(guān)于竹蟲蛋白的提取及其功能性質(zhì)的研究鮮見報(bào)道。馮穎等對(duì)竹蟲的營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行分析，并且對(duì)其開發(fā)價(jià)值進(jìn)行評(píng)述，分析表明，竹蟲蛋白含量30%～40%，粗脂肪含量60.42%、氨基酸含量29.9%、不飽和脂肪酸含量55.9%，營(yíng)養(yǎng)豐富[3]。國(guó)外較早對(duì)竹蟲進(jìn)行深入研究[4]，研究?jī)?nèi)容涉及生物學(xué)特性、滯育解除及生理生化等方面。

人類對(duì)昆蟲蛋白資源的價(jià)值認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入，對(duì)其開發(fā)利用也逐漸重視，昆蟲蛋白可能成為人類在21世紀(jì)重要的新蛋白資源，所以對(duì)竹蟲蛋白的提取及研究具有重大意義[5-7]。試驗(yàn)通過(guò)堿提酸沉法提取竹蟲蛋白，探究其功能性質(zhì)，為竹蟲蛋白的研究提供理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)，也為竹蟲蛋白應(yīng)用于保健食品及生物活性制劑等開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

竹蟲（云南省西雙版納州市售）；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸、濃硫酸硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、考馬斯亮藍(lán)等（昆明傲雪商務(wù)有限公司）。

SHZ-82恒溫振蕩器（金壇市大地自動(dòng)化儀器廠）；UV-6100S紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；PHS-3C pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；FD-1A-50冷凍干燥機(jī)（上海比朗儀器制造有限公司）；EPED-ESL-10TH實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 竹蟲預(yù)處理工藝流程

竹蟲洗凈→液氮粉碎→自然風(fēng)干→乙醚脫脂（1∶30）→自然風(fēng)干→脫脂竹蟲粉→密封保存?zhèn)溆?/p>

1.2.2 竹蟲蛋白提取

1.2.2.1 工藝流程[8-9]

脫脂竹蟲粉→堿法提取→離心（4 000 r/min，20 min）→酸沉（調(diào)pH至等電點(diǎn)）→靜置→離心（4 000 r/min，20 min）→冷凍干燥→竹蟲粗蛋白

1.2.2.2 蛋白提取方法

通過(guò)凱氏定氮法測(cè)定竹蟲蛋白含量[10-14]。

式中：c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；V1為滴定樣品吸收液時(shí)消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V2為滴定空白吸收液時(shí)消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；M為1/2 N2的摩爾質(zhì)量，14.01 g/mol；F為氮換算為蛋白的系數(shù)。

利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定提取液中的蛋白含量[15]，蛋白質(zhì)提取率計(jì)算如式（2）。

式中：M1為樣品中蛋白含量，g；M0為提取液中蛋白含量，g。

以牛血清蛋白含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程為：y=5.381 7x+0.111 3（R2=0.999 3）。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

固定提取溫度40 ℃、時(shí)間90 min、料液比1∶30 g/mL，考察不同濃度（0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 mol/L）的NaOH溶液對(duì)竹蟲蛋白提取率的影響；固定提取溫度40 ℃，NaOH溶液濃度1.0 mol/L、料液比1∶30 g/mL，探討不同提取時(shí)間（30，60，90，120和150 min）對(duì)竹蟲蛋白提取率的影響；固定提取溫度40 ℃、時(shí)間90 min、NaOH溶液濃度1.0 mol/L，探討不同料液比（1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60 g/mL）對(duì)蛋白提取率的影響；固定NaOH溶液濃度1.0 mol/L、時(shí)間90 min、料液比1∶30 g/mL，探討不同提取溫度（20，30，40，50和60 ℃）對(duì)竹蟲蛋白提取率的影響。

1.2.4 竹蟲蛋白的提取工藝優(yōu)化

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)竹蟲蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[17-20]。優(yōu)化分析因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)表

1.2.5 竹蟲蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定

將堿性的竹蟲蛋白提取也調(diào)節(jié)至pH 3.8，4.0，4.2，4.4，4.6，4.8，5.0和5.2，靜置2 h，在4 000 r/min條件下離心20 min后測(cè)提取液中蛋白的含量，提取液中所殘留的蛋白含量最低時(shí)的pH即為蛋白的等電點(diǎn)。

1.2.6 竹蟲蛋白功能性質(zhì)的測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)，稍做修改，進(jìn)行竹蟲蛋白溶解度[21]、吸水性、吸油性、起泡性和起泡穩(wěn)定性[22]，乳化及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定[23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及處理，利用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料竹蟲蛋白測(cè)定結(jié)果

采用凱氏定氮法，測(cè)得原料竹蟲蛋白含量318 mg/g，蛋白含量達(dá)31.8%，結(jié)果與文獻(xiàn)[1]中報(bào)道的含量基本一致。

2.2 竹蟲蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定

竹蟲蛋白的等電點(diǎn)測(cè)試見圖1。不同pH竹蟲蛋白沉淀后，蛋白在pH 4.4時(shí)沉淀最多，上清液中蛋白殘留率最低，說(shuō)明竹蟲蛋白的等電點(diǎn)為pH 4.4。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 NaOH溶液濃度對(duì)竹蟲蛋白提取率的影響

不同NaOH溶液濃度對(duì)竹蟲蛋白提取率的影響結(jié)果如圖2所示。蛋白提取率隨NaOH溶液濃度增加先呈上升趨勢(shì)，NaOH溶液濃度達(dá)到1 mol/L時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最高，為69.47%，而后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。有研究表明，NaOH溶液濃度過(guò)高會(huì)使蛋白變性，導(dǎo)致蛋白提取率降低[24]。因此，選取NaOH溶液濃度1 mol/L。

圖1 蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定

圖2 NaOH溶液濃度對(duì)蛋白提取率的影響

2.3.2 提取時(shí)間對(duì)竹蟲蛋白提取率的影響

不同提取時(shí)間對(duì)竹蟲蛋白提取率的影響結(jié)果如圖3所示。蛋白的提取率隨提取時(shí)間增加先呈上升趨勢(shì)，提取時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最高，為69.86%，隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，選取60 min為最優(yōu)提取時(shí)間。

圖3 提取時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響

2.3.3 料液比對(duì)竹蟲蛋白提取率的影響

不同料液比對(duì)竹蟲蛋白提取率的影響結(jié)果如圖4所示。蛋白提取率隨料液比增加先呈上升趨勢(shì)，料液比為1∶30 g/mL時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最高，為75.47%，隨著料液比增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，選取料液比1∶30 g/mL。

2.3.4 提取溫度對(duì)竹蟲蛋白提取率的影響

不同提取溫度對(duì)竹蟲蛋白提取率的影響結(jié)果如圖5所示。

蛋白的提取率隨提取溫度的增加先呈上升趨勢(shì)，提取溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最高，為74.11%，隨著溫度上升呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，選取提取溫度為50 ℃。

圖4 料液比對(duì)蛋白提取率的影響

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化與結(jié)果分析

2.4.1 響應(yīng)優(yōu)化及結(jié)果

竹蟲蛋白提取率響應(yīng)面分析的試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 模型的建立及顯著性的檢驗(yàn)

通過(guò)對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸，得到竹蟲蛋白的提取率與各變量的二次方程模型為：Y=63.3+7.55A+7.12B+4.65C+2.24D-1.07AB+2.37AC+2.3AD+1.38BC+2.08BD+0.21CD-3.79A2-1.02B2-1.59C2-4.17D2。

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。根據(jù)表3中的方差分析可知，模型的p＜0.000 1，表明該模型極顯著，而失擬項(xiàng)的p=0.468 2＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，并且模型的決定系數(shù)R2=0.99，信噪比Adeq precisior=41.59，說(shuō)明模型與實(shí)際試驗(yàn)有較好擬合度，可信度較高，可用來(lái)預(yù)測(cè)和分析竹蟲蛋白的提取工藝。離散系數(shù)C.V值為1.71%，C.V值越小，表示試驗(yàn)可信度越高。

從表3中可以看出，一次項(xiàng)A、B、C、D和二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2，以及交互項(xiàng)AC、AD、BC、BD的p值均小于0.01，說(shuō)明其對(duì)蛋白的提取率影響是極顯著的；交互項(xiàng)AB、CD的p值均大于0.05，說(shuō)明其對(duì)蛋白提取率的影響不顯著。

表3 回歸模型方差分析表

2.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)響應(yīng)面的變化情況直觀反各參數(shù)之間的交互作用對(duì)竹蟲蛋白提取率的影響。

由圖6可知，變量?jī)蓛山换r(shí)，保持其中的兩個(gè)變量不變，隨著另外變量增加，竹蟲蛋白提取率呈先上升趨勢(shì)，當(dāng)達(dá)到一定值時(shí)又呈下降趨勢(shì)，綜合響應(yīng)面圖由圖6（a）、（b）可看出NaOH溶液濃度變化坡度更加陡峭，說(shuō)明NaOH溶液濃度較料液比和溫度對(duì)竹蟲蛋白提取率的影響更顯著；圖6（c）可看出料液比變化的坡度更加陡峭，說(shuō)明料液比較時(shí)間對(duì)竹蟲蛋白提取率的影響更顯著；圖6（d）可看出蛋白提取率隨時(shí)間變化的坡度更加陡峭，說(shuō)明時(shí)間較溫度對(duì)竹蟲蛋白提取率的影響更顯著，與方差分析結(jié)果相符。

2.4.4 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證

最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證，結(jié)果見表4。

通過(guò)響應(yīng)面分析得到竹蟲蛋白提取率的最優(yōu)工藝條件為：NaOH溶液濃度1 mol/L，時(shí)間60 min，料液比1∶31.67 g/mL，溫度50 ℃。考慮實(shí)際操作情況與設(shè)備參數(shù)狀況，確定竹蟲蛋白提取率的最優(yōu)工藝條件為：NaOH溶液濃度1 mol/L，時(shí)間60 min，料液比為1∶30 g/mL，溫度為50 ℃。蛋白提取率預(yù)測(cè)值為77.45%。在最佳工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到蛋白提取率為76.14%，與理論結(jié)果接近，試驗(yàn)誤差較小。

圖6 提取率的交互作用

表4 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證

2.5 竹蟲蛋白功能性質(zhì)的測(cè)定結(jié)果

蛋白質(zhì)制品在食品工業(yè)中可作為蛋白類添加劑等用于食品的開發(fā)和運(yùn)用，其應(yīng)用性能取決于其功能特性，試驗(yàn)對(duì)竹蟲蛋白的溶解性、吸水性，吸油性，起泡性、乳化性等進(jìn)行研究。研究表明竹蟲蛋白在溶液5%、pH 7.0的中性條件下其功能性質(zhì)最穩(wěn)定[25]，測(cè)定結(jié)果如表5所示。

表5 竹蟲蛋白功能性質(zhì)測(cè)定結(jié)果

根據(jù)有關(guān)對(duì)不同蛋白的功能性質(zhì)研究報(bào)道，從表5可以看出，竹蟲蛋白的溶解度、吸水性、吸油性、起泡性和起泡穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性均比較良好[26-27]，可利用其吸水性，吸油性等進(jìn)行食品的開發(fā)及運(yùn)用，將其作為一類蛋白質(zhì)類添加劑，保證食品的口感和風(fēng)味，對(duì)食品工業(yè)發(fā)展具有很大潛在價(jià)值。

3 結(jié)論

通過(guò)堿提酸沉法提取竹蟲蛋白在響應(yīng)面基礎(chǔ)上，直觀分析各因素對(duì)竹蟲蛋白的提取率的影響及在提取過(guò)程中各因素的交互作用的影響。結(jié)果表明，各個(gè)提取條件對(duì)竹蟲蛋白提取率的影響次序?yàn)椋篘aOH溶液濃度＞料液比＞時(shí)間＞溫度。在1 mol/L NaOH溶液、料液比1∶30 g/mL、溫度50 ℃、浸提60 min條件下得到竹蟲蛋白的提取率為76.14%，此時(shí)竹蟲蛋白的溶解度為23.11%±0.28%，吸水性為312.4%±0.8%，吸油性為372.27%±1.71%，起泡性為127.33%±3.06%，起泡穩(wěn)定性為87.47%±1.25%，乳化性為52.87%±0.49%，乳化穩(wěn)定性為35.37%±0.38%。說(shuō)明竹蟲具有潛在利用價(jià)值，對(duì)其進(jìn)行開發(fā)利用，可帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)效益及社會(huì)效益。