葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母混釀低醇葡萄酒

崔艷，劉尚，鄧琪緣，石磊，呂文*

1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心（天津 300384）；2.天津市利民調(diào)料有限公司（天津 300308）

葡萄酒自然發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的過程，是由酵母菌群相互作用觸發(fā)的，發(fā)酵初期存在大量的非釀酒酵母，多來自葡萄園和葡萄皮，尤其葡萄汁有胞漢遜酵母和檸檬型克勒克酵母，可達(dá)到總菌的50%～70%，在較熱地區(qū)有胞漢遜酵母占菌種的大多數(shù)[1]；發(fā)酵過程中隨著酒精度的上升，釀酒酵母開始占主導(dǎo)地位，而非釀酒酵母因自身生長緩慢，再加上葡萄漿的滲透壓、低pH、缺氧等抑制，數(shù)量快速下降甚至消失。近來研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵初期葡萄汁有胞漢遜酵母可氧化葡萄糖從而降低酒精度[2]，還可將碳元素從酒精代謝途徑轉(zhuǎn)移到其他的代謝產(chǎn)物中[3]。還發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母具有葡萄糖苷酶、脂肪水解酶、蛋白質(zhì)水解酶和脲酶活性，生成的酯類、高級(jí)醇、甘油、醛類等物質(zhì)可改善葡萄酒的風(fēng)味[4]，其中有胞漢遜酵母具有很好的產(chǎn)乙酸酯的能力，是白葡萄酒的主要香氣成分[5]。有試驗(yàn)用耐熱克魯維酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵降低葡萄酒的酸含量[6]；用異常畢赤酵母和釀酒酵母混釀改善葡萄酒風(fēng)味[7]；用法爾皮有孢漢生酵母和釀酒酵母增加乙酯含量，降低乙醇含量[8]；用美極梅奇酵母和釀酒酵母混釀降低普通葡萄酒的酒精度1.6%vol[9]。研究發(fā)現(xiàn)有胞漢遜酵母可被低含量SO2抑制，這一特點(diǎn)特別適用于低醇酒的釀造。但葡萄汁有胞漢遜酵母和釀酒酵母混釀低醇葡萄酒的研究仍鮮有報(bào)道。試驗(yàn)以天津漢沽（氣候較熱）的玫瑰香葡萄為原料，采用低溫發(fā)酵，對(duì)葡萄汁有胞漢遜酵母和釀酒酵母進(jìn)行混釀研究，以二者的接種時(shí)機(jī)和接種比例為變量，摸索其對(duì)低醇白葡萄酒品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

玫瑰香葡萄（天津漢沽區(qū)茶淀鎮(zhèn)）；葡萄汁有孢漢遜酵母HU-3、釀酒酵母SC-6（實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.2 方法

1.2.1 釀酒試驗(yàn)

新鮮葡萄榨汁，經(jīng)調(diào)酸、果膠酶處理后滅菌。設(shè)定酵母菌總接種量為1.5×106CFU/mL，混釀組的接種比例為HU-3與SC-6 1∶1，2∶1，3∶1，4∶1和1∶2，接種時(shí)機(jī)為先接HU-3，12，24和36 h后分別接種SC-6，發(fā)酵溫度16～18 ℃，目標(biāo)酒精度6.5%vol，用6%的SO280 mg/L終止發(fā)酵。每12 h測發(fā)酵液糖度、OD值。以釀酒酵母（SC-6）和葡萄汁有胞漢遜酵母（HU-3）的純培養(yǎng)分別為對(duì)照組1和對(duì)照組2。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 理化指標(biāo)

酒精度、還原糖、總酸、揮發(fā)酸的測定，參見國標(biāo)[10]。

1.2.2.2 感官指標(biāo)

由10位專家組成感官評(píng)定小組，對(duì)所釀低醇白葡萄進(jìn)行外觀、香氣、滋味和典型性的感官評(píng)價(jià)[10]。

1.2.2.3 香氣成分的檢測

頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）。

頂空固相微萃?。喝?0 mL酒樣置于20 mL萃取瓶中，加入3.75 g氯化鈉平衡30 min，以PDMS纖維頭為萃取頭，在45 ℃下萃取30 min，270 ℃解吸5 min。

色譜條件：N-NOWAX柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度250 ℃，程序升溫：初始溫度40℃，保持5 min，以5 ℃/min升至210 ℃，保持3 min。載氣為氦氣，流速1 mL/min，分流比50∶1。

質(zhì)譜條件：EI離子源，電離電壓70 eV；離子源溫度230 ℃；電子倍增電壓1 400 V。

1.2.2.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每個(gè)結(jié)果重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中的細(xì)胞生長曲線

由圖1可知，對(duì)照組純培養(yǎng)釀酒酵母生長速度最快，在60 h即達(dá)到低醇酒所需的糖度完成低醇酒發(fā)酵，OD值遠(yuǎn)高于其他組，但仍處于對(duì)數(shù)生長旺盛期。其次是純培養(yǎng)的葡萄汁有胞漢遜酵母，60 h達(dá)到最大值后開始下降。HU-3與SC-6混釀組前24 h，4∶1組最高，其次為3∶1組，最低為1∶2組，24 h后，各混釀組生長速度出現(xiàn)差異，1∶2組逐漸加快，并保持最高生長趨勢，60 h超過有胞漢遜酵母純培養(yǎng)組繼續(xù)上升，其他混釀組則趨于穩(wěn)定甚至開始下降，但差距不大。結(jié)果表明混釀可明顯降低發(fā)酵過程中及終止時(shí)的菌種數(shù)量，從而減輕終止發(fā)酵困難，盡管常規(guī)用量的SO2不足以完全致死對(duì)照組的釀酒酵母菌，但對(duì)混釀組的發(fā)酵終止可控。混釀組由于非釀酒酵母在前期能積累一些物質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致酵母菌的生長周期延長，這與前人研究一致[11]。接種間隔12 h時(shí)間太短，葡萄汁有胞漢遜酵母本身尚處于延遲期，自身生長緩慢，因此盡管比例不同混釀組間差距卻沒有拉開，可見接種時(shí)機(jī)對(duì)其生長是很重要的。

圖1 2種菌間隔12 h接種時(shí)的細(xì)胞生長曲線

由圖2知，24 h接種時(shí)，HU-3與SC-6混釀組更為分散，生長曲線基本位于2個(gè)純培養(yǎng)對(duì)照組之間，且差距明顯。24 h前混釀組均為4∶1組最高，1∶2組最低，有胞漢遜酵母數(shù)量越多，生長越快；36 h后釀酒酵母開始起酵，1∶1組和1∶2組明顯快于其他組，除1∶2組以外，其余組OD值在60 h達(dá)到最大值，隨后下降，其中2∶1組發(fā)酵完成時(shí)OD值在混釀中最低，這無疑對(duì)發(fā)酵的終止有好處?？梢娪邪麧h遜酵母相對(duì)較多的組在60 h后均受到較高酒精度及其他條件的抑制，而釀酒酵母比例高的組則到達(dá)對(duì)數(shù)生長期，72 h時(shí)仍保持上升態(tài)勢。說明在一定的接種時(shí)機(jī)下，接種比例對(duì)于發(fā)酵完成和終止具有顯著影響。

圖2 2種菌間隔24 h接種時(shí)的細(xì)胞生長曲線

由圖3可知，HU-3與SC-6混釀組均在84 h才完成發(fā)酵，較前2個(gè)接種時(shí)機(jī)發(fā)酵時(shí)間長。前48 h混釀組均生長緩慢，48 h后，1∶2組明顯發(fā)力，處于最高值，但由于前期有胞漢遜酵母生長時(shí)間較長，接種釀酒酵母后二者比例重排，使混釀組生長變化失去規(guī)律性。除了1∶1組和1∶2組在發(fā)酵完成時(shí)仍保持上升趨勢，其余組酵母菌最大OD值均由前面的60 h推遲到72 h，終止時(shí)最低值為4∶1組。說明36 h的接種間隔延長酵母菌的生長周期，但縮短各比例組間差距，盡管周期延長可能會(huì)積累更多的代謝產(chǎn)物，但是發(fā)酵時(shí)間的延長卻是實(shí)際生產(chǎn)不期望的。

圖3 2種菌間隔36 h接種時(shí)的細(xì)胞生長曲線

2.2 發(fā)酵過程中的糖度變化

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，對(duì)照組釀酒酵母糖度下降最快，在24 h時(shí)開始快速下降，60 h達(dá)到終點(diǎn)，其次是有胞漢遜酵母組，但較釀酒酵母慢，而HU-3與SC-6混釀組均在48 h以后出現(xiàn)較明顯下降，但各組降糖的速度和趨勢很接近，更平緩，以1∶2組最先在72 h達(dá)到目標(biāo)酒精度完成發(fā)酵。說明間隔12 h接種并沒有比單純有胞漢遜酵母更好地進(jìn)行糖代謝，可能是時(shí)間太短，前24 h二者均處于延遲期，二者相互影響導(dǎo)致，36 h后1∶2組因?yàn)獒劸平湍负扛叨堤撬俣却笥谄渌M，但差距并不太大。

圖4 2種菌間隔12 h接種時(shí)的糖度變化

由圖5可知，4∶1組在36 h前相對(duì)降糖較快，其次是3∶1組，最慢是1∶2組，規(guī)律性明顯；36 h后，1∶2和1∶1組反超，在48 h后，HU-3與SC-6混釀組降糖速度均超過有胞漢遜酵母組?？赡苁且?yàn)榻臃N釀酒酵母后該菌種快速起酵，和有胞漢遜酵母協(xié)同作用，在72 h完成發(fā)酵，說明順序接種的間隔時(shí)機(jī)和接種的比例對(duì)降糖速度和發(fā)酵時(shí)間有影響。最終1∶2組糖度最低，其次是1∶1組，2∶1組，這和OD值變化一致，但是由于1∶1組和1∶2組最終的酵母數(shù)量過高，降糖雖然快，但是發(fā)酵終止相對(duì)困難，所以2∶1組更符合低醇酒獲得穩(wěn)定酒精度的要求。

圖5 2種菌間隔24 h接種時(shí)的糖度變化

由圖6可知，HU-3與SC-6混釀組在48 h時(shí)后出現(xiàn)下降趨勢，但不如間隔24 h接種下降快，而前期速度均低于有胞漢遜酵母組；各混釀組在36～60 h出現(xiàn)降糖調(diào)整期，但由于順序接種較晚，且釀酒酵母可能受到有胞漢遜酵母的代謝物抑制和延遲期的共同影響，且此時(shí)釀酒酵母數(shù)量不多，并沒有起到主導(dǎo)作用，有胞漢遜酵母仍占大多數(shù)，因此這段時(shí)間的降糖作用并不顯著，整體來看與有胞漢遜酵母對(duì)照組的糖度變化趨勢和速度接近，到后期延長至84 h才降至目標(biāo)糖度，明顯不如間隔24 h接種，這在實(shí)際應(yīng)用中是不利的。

圖6 2種菌間隔36 h接種時(shí)的糖度變化

2.3 混釀低醇葡萄酒的理化指標(biāo)

由表1可知，所有HU-3與SC-6混釀組最終酒精度均小于7%vol，符合低醇葡萄酒的酒精度國標(biāo)要求，且酒精度均隨著釀酒酵母比例升高而升高。2種菌接種間隔24 h時(shí)，混釀組酒精度均在目標(biāo)酒精度6.5%vol左右，其中2∶1組為6.52%vol，而其他接種時(shí)機(jī)中，最接近目標(biāo)酒精度的組分別是36 h的1∶2組和12 h的1∶2組，酒精度分別為6.41%vol和6.15%vol，其余組均低于6%vol，可見24 h不僅利于酒精度的穩(wěn)定，并縮短發(fā)酵周期。說明混釀確實(shí)能降低酒精度，但釀酒酵母比例不能過高或過低，否則要么難以終止發(fā)酵或酒精度超標(biāo)，要么不利于酒精的生成；還原糖結(jié)果與酒精度的結(jié)果具有對(duì)應(yīng)關(guān)系，且過低或過高的糖會(huì)影響葡萄酒的口感，高糖更易染菌、出現(xiàn)產(chǎn)氣現(xiàn)象而導(dǎo)致原酒不穩(wěn)定，24 h，2∶1組糖度適中?？偹?、混釀組和有胞漢遜酵母組均低于對(duì)照組，且有胞漢遜酵母比例越高酸越低，與前人的混釀降低葡萄酒酸度的報(bào)道一致，但接種時(shí)機(jī)的影響不明顯，對(duì)于低醇酒來說，酸度和甜度相適宜為最好。揮發(fā)酸混釀組之間沒有明顯差別，均在合理范圍之內(nèi)。

2.4 感官評(píng)價(jià)

通過10位專家的感官評(píng)價(jià)，對(duì)照組1酒樣在后期持續(xù)產(chǎn)生氣泡，酒體渾濁，穩(wěn)定性低，且有明顯的硫味和酵母味；對(duì)照組2酒樣盡管較澄清，但是酒香弱，口感偏甜，層次單?。换灬劷M中第5組（2∶1、24 h）酒樣在后期儲(chǔ)藏過程中無氣泡、無渾濁現(xiàn)象，酒體澄清透明，果香酒香協(xié)調(diào)，酸甜適宜，舒順易飲，結(jié)構(gòu)感好，有一定厚度，花香和果香較其他組明顯，同時(shí)有較典型的葡萄品種香氣，獲得最高分92分。

表1 混釀低醇葡萄酒的理化指標(biāo)

表2 混釀低醇葡萄酒的感官評(píng)價(jià)

2.5 香氣成分分析

混釀酒樣中高級(jí)醇異戊醇和苯乙醇含量明顯下降，因?yàn)橛邪麧h遜酵母產(chǎn)該類高級(jí)醇的能力弱于釀酒酵母，對(duì)低醇酒有益。酯類中乙酸酯及乙基酯類物質(zhì)含量較多，混釀酒樣中乙酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸異戊酯的含量均明顯高于對(duì)照組，其次辛酸乙酯，丁二酸二乙酯也高于對(duì)照組，其他酯類均相差不大，但是總酯含量大大增加。萜烯類物質(zhì)，盡管多源于麝香葡萄本身，但有胞漢遜酵母具有產(chǎn)葡萄糖苷酶能力，可以降解葡萄汁中的萜烯醇-糖苷類物質(zhì)，因此對(duì)單萜烯類物質(zhì)有一定影響，試驗(yàn)中混釀組的萜烯類物質(zhì)也高于對(duì)照組，但差距沒有前人研究那么明顯，可能是發(fā)酵時(shí)間較短，菌自溶和產(chǎn)酶作用不明顯造成。

表3 混釀低醇葡萄酒的香氣成分分析

3 結(jié)論與討論

采用葡萄汁有胞漢遜酵母和釀酒酵母混合釀造低醇白葡萄酒，在接種有胞漢遜酵母24 h后再接種釀酒酵母，二者比例2∶1，總菌數(shù)1.5×106CFU/mL時(shí)，可獲得酒精度為6%vol左右的，具有較高微生物穩(wěn)定性和復(fù)雜香氣的高品質(zhì)新鮮型的低醇白葡萄酒。

與釀酒酵母純培養(yǎng)相比，葡萄汁有胞漢遜酵母和釀酒酵母順序接種的發(fā)酵方式，使葡萄酒的發(fā)酵過程變得可控，其發(fā)酵速度較慢[12]，發(fā)酵完成時(shí)的細(xì)胞總數(shù)較低，利于發(fā)酵的終止和原酒的穩(wěn)定，同時(shí)二者的混合發(fā)酵產(chǎn)生更為豐富的代謝物，其相互作用改善酒中的香氣和風(fēng)味物質(zhì)[13]，彌補(bǔ)低醇葡萄酒發(fā)酵時(shí)間短成分積累不足的缺陷，因此方式適用于低醇葡萄酒的釀造。