復(fù)合菌劑防控香蕉枯萎病的效果及其微生物學機制*

桂 莎，劉 芳，張立丹，樊小林?

復(fù)合菌劑防控香蕉枯萎病的效果及其微生物學機制*

桂 莎，劉 芳，張立丹，樊小林?

（廣東高校環(huán)境友好型肥料工程技術(shù)研究中心，華南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，廣州 510642）

由病原菌尖孢鐮刀菌古巴專化型（f. sp.（Foc））侵染引起的香蕉枯萎病對全世界香蕉產(chǎn)業(yè)帶來了毀滅性的影響，且目前尚無廣泛采用的防治方法。研究復(fù)合生防真菌制劑對香蕉枯萎病的防治效果，以期為大田香蕉枯萎病的防治提供依據(jù)。設(shè)置3組不同的菌劑處理，分別為對照組CK、復(fù)合菌劑NFP、復(fù)合菌劑NFPT，通過兩季的盆栽試驗，研究復(fù)合菌劑對香蕉枯萎病的防治效果及其對土壤微生物多樣性的影響；利用 Illumina Miseq 高通量測序平臺對細菌16S rRNA基因和真菌ITS區(qū)域進行測序分析，采用實時熒光qPCR定量分析各處理病原菌的數(shù)量。結(jié)果表明：（1）復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）對香蕉枯萎病有較好的防治效果，其防效分別為43%和48%。（2）施用復(fù)合菌劑增加了細菌和真菌群落豐富度和多樣性。基于Bray-curtis距離矩陣的主坐標分析（PCoA）結(jié)果表明NFP和NFPT改變了細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)。NFP和NFPT處理增加了潛在有益微生物中與香蕉枯萎病病情指數(shù)呈顯著負相關(guān)的大理石雕菌屬、類諾卡氏菌屬、野野村式菌屬、、屬和屬的相對豐度，顯著減少了病原菌尖孢鐮刀菌的數(shù)量，重塑了土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能，增強其抗病性。

復(fù)合真菌制劑；香蕉枯萎??；Illumina Miseq 高通量測序；土壤微生物多樣性

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；蚮. sp.（Foc）侵染引起的一種土傳病害，給世界香蕉產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。目前防治香蕉枯萎病的常用措施主要有土壤熏蒸[3]、輪作[4]和培育新品種[5]等。然而土壤熏蒸會破壞土壤環(huán)境，與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的理念相悖[6]；病原菌產(chǎn)生的厚垣孢子在無宿主的情況下可長期存活于土壤中[2]，因此，土壤一旦被Foc侵染，在長達30年的時間易感病香蕉品種均難以成功種植[4]；抗病新品種的培育周期長，且品質(zhì)難以保證[7]。因此，香蕉枯萎病的防治亟需新方法。

生物防治作為一種有前途且環(huán)境友好的病害防治方式，正受到廣泛的關(guān)注，為香蕉枯萎病的防治提供了一種新的、有潛力的方式[8]。在眾多的生防微生物中，生防真菌相比于生防細菌而言有更大的潛力在土壤中生長和繁殖[9]，因此，真菌更多地用于防治某些作物因尖孢鐮刀菌引起的病害[9]，目前已有許多生防真菌用于枯萎病的防治[10-12]。盡管許多不同的生防真菌對枯萎病的防治表現(xiàn)出了一定的防效，但是由于在生物防治過程中，生物和非生物因素相互作用的復(fù)雜性，對枯萎病防治的實際效果不盡相同[13]，為此可通過多種生防菌的結(jié)合應(yīng)用解決該問題。多種拮抗菌結(jié)合施用較一種拮抗菌單獨施用有更好的防病效果[14]，大量研究[14-15]表明多種生防菌結(jié)合施用能有效地抑制枯萎病。本研究的前期工作證明香蕉施用多種生防真菌制成的復(fù)合菌劑，對香蕉枯萎病有明顯的防治效果。已有研究[16-17]報道了某些種類的生防真菌防病機理是直接對抗和間接對抗，但是多種生防真菌配合的防病機理尚不明確。本文假設(shè)復(fù)合真菌制劑防治香蕉枯萎病的機理可能在于，香蕉定植前在香蕉根區(qū)接種復(fù)合真菌制劑改變了香蕉根區(qū)土壤微生物結(jié)構(gòu)，刺激了土著微生物中某些有益菌屬相對豐度的增加。為研究復(fù)合真菌制劑防控香蕉枯萎病的效果，本研究開展了兩次盆栽試驗，通過細菌16S rRNA基因和真菌ITS區(qū)域的高通量測序，系統(tǒng)研究了根區(qū)細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)對復(fù)合真菌制劑的響應(yīng)，以期探討復(fù)合真菌制劑防治香蕉枯萎病的機理，為以復(fù)合真菌制劑防治大田香蕉枯萎病的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

盆栽試驗于華南農(nóng)業(yè)大學溫室進行。供試土壤為微堿性砂壤土，是灘涂填海造田的蕉園土壤，采自廣東省中山市翠亨島，土壤pH 7.41，有機質(zhì)含量19.78 g?kg–1，礦質(zhì)態(tài)氮11.12 mg?kg–1，有效磷8.53 mg?kg–1，速效鉀141.0 mg?kg–1。

供試香蕉為巴西蕉（Lour.）無病組培苗的假植苗。香蕉假植苗長至14 cm、7片綠葉時，選取生長健壯、一致的幼苗進行試驗。

復(fù)合真菌活菌制劑由西北農(nóng)林科技大學植保學院植物病理研究室提供，復(fù)合真菌制劑NFP由非致病性尖孢鐮刀菌（non-pathogenicsp.）和淡紫擬青霉菌（sp.）按1︰1比例復(fù)配而成，復(fù)合真菌制劑NFPT由非致病性尖孢鐮刀菌（non-pathogenicsp.）、淡紫擬青霉菌（sp.）和木霉菌（sp.）按9︰9︰4的比例復(fù)配而成。有效活菌數(shù)均大于5×108g–1。

1.2 試驗設(shè)計

分別于2017年9月27日至2018年1月29日和2018年5月10日至2018年8月1日開展了兩次盆栽試驗。兩次試驗結(jié)果的規(guī)律一致，本文以第二次盆栽試驗的結(jié)果進行分析和討論。兩次盆栽試驗方案相同，分別設(shè)置CK（不接種生防菌劑）、復(fù)合菌劑NFP、復(fù)合菌劑NFPT 3個處理，每個處理設(shè)30個重復(fù)，單株為1個重復(fù)，每盆移栽一株香蕉，共90盆香蕉，隨機排列。所有處理的香蕉氮磷鉀用量相等，N︰P2O5︰K2O（質(zhì)量比）均為1︰0.25︰0.75。每個處理的施N量均為0.2 g?kg–1干土，在香蕉生長過程將各處理的總養(yǎng)分均分為12份，分別溶于水后，每周澆灌施肥1次。每盆的含水量用稱重法保持在田間持水量的70%。

1.3 試驗方法

在香蕉苗假植期對其進行復(fù)合菌劑接種，具體方法是將三葉期的香蕉苗從沙培苗床中拔出，洗掉根上附著的河沙，假植于7 cm×10 cm的黑色營養(yǎng)杯中，定植介質(zhì)是無病椰糠+泥炭專用混合基質(zhì)，假植苗移栽時，將2 g復(fù)合菌劑NFP和NFPT分別施于定植穴，使菌劑與香蕉根直接接觸。假植期進行正常水肥管理，待香蕉苗長至7片葉時，選擇生長一致的香蕉苗移栽于盆缽，開始香蕉盆栽試驗。盆栽期按照上述方法進行水肥管理，參考大田管理措施進行香蕉枯萎病外的其他病蟲害防治。

香蕉尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種（Foc4）由華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院植物病理研究室提供。將Foc4接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，在25 ℃下黑暗活化培養(yǎng)7 d，然后用直徑8 mm打孔器從菌落邊緣采取菌餅，接種于裝有500 mL液體PDA培養(yǎng)基的錐形瓶中，在28 ℃、180 r?min–1搖床培養(yǎng)7 d。將得到的菌懸液用四層紗布過濾掉菌絲后，用無菌水稀釋至106CFU?mL–1備用。

供試土壤分兩層裝盆，先裝下層4 cm （約1.5 kg），頂層7 cm（約2.5 kg）先不裝土，移栽假植苗后再用土壤覆蓋香蕉苗及其基質(zhì)塊。移栽前將選好的七葉一心健壯、一致的香蕉苗脫掉營養(yǎng)缽袋，移植于已裝下層土壤的盆缽正中，然后將預(yù)留的頂層土壤覆蓋于香蕉苗基質(zhì)塊周圍，使基質(zhì)塊上仍能覆蓋1 cm土壤。每盆移栽1株香蕉，澆水至田間持水量的70%進行緩苗。移栽的香蕉正常生長1個月后，采用傷根接種法接種病原菌。具體操作方法為用潔凈玻棒在香蕉假莖四周每個方位自上而下插入土壤中后拔出，分別在插入的四個方位中接種10 mL濃度為106CFU?mL–1的Foc4菌懸液，接種量為104CFU?g–1（干土）。

1.4 樣品采集與指標測定

接種病原菌后每隔 10 d 調(diào)查 1 次，連續(xù)調(diào)查 5 次并計算病情指數(shù)[19]。香蕉枯萎病病情分為6級[18]，0級：健株，無癥狀；1級：病株有20%以下的葉片顯病癥；2級：病株有20%～40%的葉片顯病癥；3級：病株有40%～80%的葉片顯病癥；4級：僅有頂部1～2片健康葉；5級：整株枯死。

防病效果/%=[(對照病情指數(shù)–處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)]×100

香蕉枯萎病發(fā)病初期，每處理隨機選取12盆香蕉，用土鉆取土，每盆取4鉆，每4盆的土壤混合均勻后得到1個混合樣，每處理3個混合土樣，即3個重復(fù)，3個處理共9個土壤樣品，用自封袋低溫帶回實驗室，去除植物根系并過2 mm篩后保存于–80℃冰箱，用于16S rRNA和ITS測序分析。

采用土壤DNA提取試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，美國）提取土壤微生物總DNA，用紫外可見分光光度計（NanoDrop 2000，Thermo Scientific，Wilmington，美國）檢測提取的DNA的濃度和純度。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。

樣本總DNA提取后，設(shè)計基因特異性引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對細菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域進行PCR擴增；真菌特異性引物ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGT AA）和ITS2R（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）用來擴增真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄區(qū)（ITS）的ITS1 區(qū)域。PCR反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 °C延伸45 s，細菌16S rRNA 27個循環(huán)，真菌ITS 35個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。對擴增產(chǎn)物進行純化、定量和均一化，形成測序文庫，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司通過Illumina MiSeq平臺進行測序。

土壤樣本尖孢鐮刀菌（）的豐度用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法測定，上游引物FOC1（CAGGGGATGTATGAGGAGGCT）和下游引物 FOC2（GTGACAGCGTCGTCTAGTTCC）[19]用來擴增rRNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄區(qū)（ITS）。PCR反應(yīng)程序為95℃變性10 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min，40個循環(huán)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用 SPSS 20.0 和 EXCEL 2007 軟件進行數(shù)據(jù)處理。采用Origin Pro 8.1軟件進行作圖。對Illumina Miseq測序得到的原始細菌和真菌序列進行成對讀長（Paired-end reads，PE reads）拼接、質(zhì)控過濾和去除單序列、嵌合體；使用 UPARSE 軟件對優(yōu)化后的序列在 97% 的相似度水平下進行聚類得到分類操作單元（OTU），采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并比對細菌（Silva）和真菌（UNITE）的分類學數(shù)據(jù)庫對OTU 進行分類學注釋，統(tǒng)計各樣本的群落組成。利用MOTHUR（ version v.1.30.1）軟件進行微生物阿爾法（Alpha）多樣性指數(shù)的計算，包括Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)、辛普森指數(shù)（Simpson）和覆蓋度Good’s coverage指數(shù)。利用Qiime軟件計算beta多樣性距離矩陣，R語言進行主坐標分析（PCoA）分析和作圖。利用Qiime軟件進行Mantel test分析。利用R（V2.15.3）pheatmap工具包計算皮爾森（Pearson）相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)合菌劑對香蕉枯萎病防病效果和病原菌數(shù)量的影響

復(fù)合菌劑對香蕉枯萎病病情指數(shù)和防病效果的影響如圖1所示。由圖1a）可知，CK處理病情指數(shù)在各個時期均最高。在接種病原菌后15 d，CK處理最先發(fā)病，其次是NFP處理。隨著香蕉的生長，各處理病情指數(shù)均上升。接種35 d后，CK處理病情指數(shù)迅速上升，至接種后55 d，CK處理病情指數(shù)高達65%，而NFP和NFPT處理病情指數(shù)增長緩慢且顯著低于CK處理，較CK分別低28%和31%。

將CK 的防病效果指定為0 時，NFP和NFPT處理的防病效果分別為43%和48%（圖1b））。

注：圖中CK表示不施用生防菌劑，NFP表示施用由非致病性尖孢鐮刀菌和淡紫擬青霉菌按1︰1比例復(fù)配而成的復(fù)合生防真菌制劑，NFPT表示施用由非致病性尖孢鐮刀菌、淡紫擬青霉菌和木霉菌按9︰9︰4的比例復(fù)配而成復(fù)合生防真菌制劑。下同。Note：CK stands for no application of biocontrol agent；NFP for application of a complex anti-fungal agent prepared by combining non-pathogenic Fusarium oxysporum sp. and Purpureocillium sp. in 1︰1 ratio；and NFPT for application of a complex anti-fungal agents prepared by combining non-pathogenic Fusarium oxysporum sp.，Purpureocillium sp. and Trichoderma sp. in 9︰9︰4 ratio. The same below.

由各處理病原菌qPCR分析結(jié)果可知（圖2），復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）病原菌數(shù)量顯著低于CK處理（<0.05），其中復(fù)合菌劑NFP處理病原菌數(shù)量最低，較CK降低了10.15%。以上結(jié)果表明，復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）香蕉枯萎病病情指數(shù)和病原菌數(shù)量均顯著低于CK處理，對香蕉枯萎病的防效顯著。

圖2 復(fù)合菌劑對病原菌尖孢鐮刀菌（Foc）數(shù)量的影響

2.2 復(fù)合菌劑對土壤微生物多樣性的影響

在去除短的、低質(zhì)量的序列、單序列和嵌合體后，9個樣本共獲得244 105條高質(zhì)量16S rRNA序列和556 075條高質(zhì)量ITS序列用于后續(xù)的群落分析。將每個樣本的測序量按最小樣本序列數(shù)（細菌為20 041條序列、真菌為41 942條序列）抽平至相同的測序深度后按照97%的相似性進行聚類，分別得到1 771個細菌分類操作單元（OTUs）和836個真菌分類操作單元（OTUs）。細菌和真菌的平均樣本覆蓋度（Average Good’s coverage）分別為98.5%和99.8%，并且細菌和真菌的稀釋曲線漸趨平緩，這兩者共同說明了對樣本土壤微生物群落的測序數(shù)據(jù)達到飽和，能夠覆蓋樣本中的絕大部分物種。

阿爾法多樣性分析可用來研究環(huán)境中微生物的多樣性，通過單樣本的阿爾法多樣性分析反映微生物群落的豐富度和多樣性。Sobs和Chao1指數(shù)可用來反映群落的豐富度，指數(shù)越大，表明物種總數(shù)越大。辛普森指數(shù)可用來反映群落的多樣性，辛普森值越大，說明群落多樣性越低。由表1可以看出，與CK相比，NFPT處理對土壤細菌豐度無顯著性的影響，對真菌豐度提高有促進作用。復(fù)合菌劑NFP和NFPT處理后土壤真菌辛普森指數(shù)顯著低于CK處理，說明施用復(fù)合菌劑可顯著提高土壤中真菌群落多樣性。

主坐標分析（PCoA分析，Principal co-ordinates analysis）是一種非約束性的數(shù)據(jù)降維分析方法，可用PCoA分析來研究樣本群落組成的相似性或差異性?；贐ray-curtis距離算法的主坐標分析結(jié)果表明，不同處理間土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異明顯（圖3）。對細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)而言，不同處理間差異明顯（置換多元方差分析PERMANOVA：細菌，2=0.256，=0.001；真菌，2=0.318，=0.006）。前兩個主成分約分別解釋細菌和真菌群落總變異的47.47%和59.97%。此外，第一主成分（PC1）是最重要的，且CK處理和復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）細菌和真菌群落組成在第一主成分軸上（PC1）有顯著差異，Bray-curtis距離矩陣在第一主成分軸上（PC1）對細菌和真菌群落組成差異的解釋度分別為29.45%和43.14%。

表1 不同處理土壤微生物群落的豐富度和多樣性指數(shù)

注：表中數(shù)值均為均值±標準誤，同列數(shù)值后小寫字母不同表示處理間差異顯著。Note：The values in the table were of mean±deviation. Different letters in the same column mean significant differences at the<0.05 probability level according to ANOVA.

圖3 各處理基于Bray-Curtis距離的土壤微生物群落（a）細菌，b）真菌）相似性分析

各處理土壤細菌在門和屬分類水平上相對豐度情況如圖4a）和圖4b）所示。由圖4a）可知，各處理土壤細菌豐度前10優(yōu)勢菌門從高至低分別為變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、綠彎菌門Chloroflexi、酸桿菌門Acidobacteria、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、硝化螺旋菌門Nitrospirae、擬桿菌門Bacteroidetes、厚壁菌門Firmicutes、藍細菌門Cyanobacteria、Parcubacteria，大約占各處理土壤細菌總序列數(shù)的98%以上。由圖4a）可以看出，與CK 處理相比，施用復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）對土壤細菌放線菌門Actinobacteria、酸桿菌門Acidobacteria、浮霉狀菌門Planctomycetes豐度的提高有促進作用。CK處理有較高的變形菌門Proteobacteria、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、厚壁菌門Firmicutes相對豐度。由圖4b）可以看出，各處理土壤細菌前5優(yōu)勢屬分別為、大理石雕菌屬、鏈霉菌屬、類諾卡氏菌屬、土微菌屬。與CK處理相比，施用復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）有利于土壤細菌大理石雕菌屬、類諾卡氏菌屬和德沃斯氏菌屬相對豐度的提高。CK處理有較高的鏈霉菌屬和土微菌屬相對豐度。

各處理土壤真菌在門和屬分類水平上相對豐度情況如圖4c）和圖4d）所示。由圖4c）可以看出，各處理90%以上的土壤真菌序列屬于子囊菌門Ascomycota、接合菌門Zygomycota、擔子菌門Basidiomycota。與CK 處理相比，施用復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）有利于增加土壤真菌接合菌門Zygomycota、unclassified_k__Fungi、擔子菌門Basidiomycota相對豐度，CK處理有較高的子囊菌門Ascomycota相對豐度。由圖4d）可以看出，各處理土壤真菌前5優(yōu)勢屬分別為、鐮孢菌屬、、屬、曲霉屬。與CK處理相比，施用復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）鐮刀菌屬、屬相對豐度明顯升高，、、曲霉屬、屬、毛殼菌屬相對豐度明顯下降。

圖4 各處理土壤微生物（a）細菌門，b）細菌屬，c）真菌門，d）真菌屬）相對豐度

由圖5a）可知，復(fù)合真菌制劑NFP處理擬青霉屬相對豐度在3個處理中最高，但各處理間差異不顯著；復(fù)合真菌制劑NFPT處理木霉屬相對豐度較CK處理高（圖5b）），但差異未達顯著水平。此外，由圖5c）可以看出，施用復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）鐮刀菌屬相對豐度高于CK處理，但差異也未達到顯著水平。

圖5 各處理中擬青霉屬Paecilomyces（a））、木霉屬Trichoderma（b））和鐮刀菌屬Fusarium（c））相對豐度

2.3 土壤微生物多樣性與香蕉枯萎病的相關(guān)性

由Mantel Test分析可知，土壤細菌和真菌群落組成與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著相關(guān)（細菌，=0.509，=0.001；真菌，=0.370，=0.035）。由表2可知，公認的與植物抑病相關(guān)的細菌門類相對豐度，如擬桿菌門Bacteroidetes和放線菌門Actinobacteria與香蕉枯萎病病情指數(shù)呈負相關(guān)，但相關(guān)性不顯著。包含多種叢枝菌根的球囊菌門Glomeromycota相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)也無顯著相關(guān)性。但是變形菌門Proteobacteria、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、厚壁菌門Firmicutes和子囊菌門Ascomycota相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著正相關(guān)，酸桿菌門Acidobacteria相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著負相關(guān)。

表2 土壤細菌和真菌門相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)的皮爾森相關(guān)系數(shù)

注：*表示相關(guān)性在5%水平差異顯著；**表示相關(guān)性在1%水平差異顯著。下同。Note：* indicates significant correlation at the 5% level；** significant correlation at the 1% level. The same below. ①Phyla，②Relative abundance，③Correlation coefficient.

由表3可知，細菌、鞘氨醇單胞菌屬、芽孢桿菌屬相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著正相關(guān)。真菌、曲霉菌屬、、、毛殼菌屬相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著正相關(guān)。盡管公認的有益菌屬如類芽孢桿菌屬、木霉屬相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)相關(guān)性不顯著，一些潛在的生防屬如、大理石雕菌屬、類諾卡氏菌屬、、_、、屬、野野村式菌屬、屬相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著負相關(guān)。有趣的是，鐮刀菌屬相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)呈現(xiàn)負相關(guān)，但相關(guān)性不顯著。由圖5c）可以看出，復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）鐮刀菌屬相對豐度高于CK處理，但差異未達到顯著水平；進一步的qPCR結(jié)果（圖2）顯示復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）病原菌尖孢鐮刀菌數(shù)量顯著低于CK處理。

表3 土壤細菌和真菌屬相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)的皮爾森相關(guān)系數(shù)

①Relative abundance，②Correlation coefficient

3 討 論

3.1 復(fù)合菌劑防治香蕉枯萎病的效果

香蕉枯萎病是香蕉生產(chǎn)過程中毀滅性的土傳病害，已引起世界各香蕉生產(chǎn)國的廣泛關(guān)注，生物防治是香蕉土傳枯萎病防治的理想途徑[10]。本研究試圖探究復(fù)合菌劑抑制香蕉枯萎病的可能機制。研究結(jié)果表明，復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著低于CK處理（圖1），對香蕉枯萎病有較高的防效，且病原菌qPCR結(jié)果顯示，復(fù)合菌劑NFP和NFPT處理病原菌數(shù)量顯著低于CK處理（圖2），這與Larkin和Fravel等[14]報道的多種拮抗菌混合施用能更好地防治番茄枯萎病的結(jié)果一致。

3.2 復(fù)合菌劑對根區(qū)土壤微生物多樣性的影響

土壤微生物群落多樣性是反映土壤健康的重要指標，土壤微生物群落是土壤生態(tài)系統(tǒng)持續(xù)發(fā)揮作用的重要媒介，優(yōu)化的土壤微生物結(jié)構(gòu)對防治土傳病害有積極的促進作用[20]。本研究通過Illumina MiSeq平臺進行細菌16S rRNA和真菌ITS測序，分析了土壤細菌和真菌群落多樣性。采用絕對定量PCR（qPCR）分析了病原菌的數(shù)量。研究結(jié)果表明，復(fù)合菌劑NFP和NFPT處理對土壤細菌和真菌群落豐富度的增加有促進作用，且顯著增加了真菌群落的多樣性（表1），且有研究[21-22]表明更高的土壤微生物群落豐富度和多樣性在提高土壤抗病性的過程中有重要的作用。本試驗中施用復(fù)合菌劑NFP和NFPT后，土壤微生物群落發(fā)生了顯著的變化，基于Bray-curtis距離矩陣的PCoA分析結(jié)果表明，復(fù)合菌劑NFP和NFPT擁有結(jié)構(gòu)上與CK處理明顯不同的細菌和真菌群落（圖3），且Mantel Test分析結(jié)果表明土壤細菌和真菌群落組成與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著相關(guān)（細菌，=0.509，=0.001；真菌，=0.370，=0.035；表2和表3），說明土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異可能是調(diào)控香蕉枯萎病發(fā)生的主要因子之一[23]。綜上所述，在土壤中施入兩種復(fù)合菌劑刺激了除功能菌外的某些相似的土壤微生物，這些被刺激增長的土壤微生物可能會進一步影響土壤中微生物的相互作用且可能具有潛在的拮抗性，從而幫助減少植物病害[24]。

施用復(fù)合菌劑是塑造土壤微生物群落組成的主要因素。就細菌屬水平上微生物組成的變化而言，施用復(fù)合菌劑處理明顯提高了放線菌門的大理石雕菌屬、類諾卡氏菌屬、野野村式菌屬和酸桿菌門的、、屬相對豐度（圖4），且這些屬相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著負相關(guān)（表3），表明這些屬可能對香蕉枯萎病的抑制有重要作用。已有研究表明大理石雕菌屬、類諾卡氏菌屬、野野村式菌屬能促進大豆、苜蓿等作物生物量的提高[25]，提高作物抵抗病害的能力。本研究結(jié)果中酸桿菌門Acidobacteria相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)呈顯著負相關(guān)（表2），這與Sanguin等[26]研究的抗病土壤有更高的酸桿菌門Acidobacteria豐度結(jié)果一致。本研究中酸桿菌門的、和屬相對豐度與抗病性呈顯著負相關(guān)（表3），但是它們的抗病機制尚不清楚。已有研究表明，芽孢桿菌屬能抑制某些作物的土傳病害[27]，但是在本研究中，相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)正相關(guān)（表3），這可能是因為土壤酶活性、土壤物理化學性質(zhì)等土壤性質(zhì)的改變會影響微生物群落，從而影響作物與有益微生物間的相互關(guān)系[28]。施用復(fù)合菌劑也改變了真菌群落結(jié)構(gòu)組成。本研究中，子囊菌門Ascomycota和結(jié)合菌門Zygomycota在所有樣本中相對豐度最高（圖4c））。此外，使用復(fù)合菌劑降低了子囊菌門Ascomycota相對豐度，且子囊菌門相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著正相關(guān)（表3）。已有研究表明子囊菌門中包含一些致病菌[29]，且香蕉根際子囊菌門相對豐度的降低與抑制香蕉枯萎病關(guān)系密切[30]。在真菌屬水平上，施用復(fù)合菌劑顯著提高了屬相對豐度，且屬相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著負相關(guān)（=–0.769）（表3）。是子囊菌門一個新提出的屬[31]，尚無其與枯萎病關(guān)系的相關(guān)報道。本研究中施用復(fù)合菌劑降低了毛殼菌屬和曲霉菌屬相對豐度，且毛殼菌屬和曲霉菌屬相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)顯著正相關(guān)（表3）。據(jù)報道，毛殼菌屬與棉花黃萎病發(fā)生程度呈正相關(guān)[32]。且研究表明西瓜連作后，以曲霉菌屬等為主的真菌數(shù)量大幅增加，導(dǎo)致連作西瓜易發(fā)病[33]。

3.3 復(fù)合菌劑防治香蕉枯萎病的可能機制

本文的研究結(jié)果表明，復(fù)合菌劑（NFP和NFPT）中的功能菌（non-pathogenicsp.，sp.和sp.）在土壤中生存能力有限，對香蕉枯萎病病原菌直接的抑制作用很小，其抗病的機理可能為：引入土壤中的功能菌可能是作為關(guān)鍵群落成員，刺激了土著有益微生物中其他潛在的拮抗物種，增加了土壤微生物多樣性，改變了土壤細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)，這種生物防治相互作用的復(fù)雜關(guān)系說明疾病抑制通常是一個復(fù)雜的現(xiàn)象，復(fù)雜的微生物群落可能對抑病有決定性作用[34]。研究表明，在抗病性土壤中，因為非致病性尖孢鐮刀菌和致病性尖孢鐮刀菌的相互作用導(dǎo)致了土壤的抗病性；非致病性尖孢鐮刀菌和致病性尖孢鐮刀菌區(qū)別在于，非致病性尖孢鐮刀菌從根部侵入后并不會繼續(xù)侵入維管系統(tǒng)導(dǎo)致植物發(fā)病[8]。在接種病原菌前接種的非致病性尖孢鐮刀菌（non-pathogenicsp.）可能會和病原菌搶占根表有限的侵染位點[35]；同時施入土壤中的木霉菌（sp）因其強大的繁殖和養(yǎng)分吸收能力可能會使其與病原菌爭奪有限的養(yǎng)分和空間[16]，制約了病原菌的生長與繁殖；施入土壤中的生防真菌淡紫擬青霉菌（sp.）對植物寄生的根結(jié)線蟲有一定的生防效果，減少了根結(jié)線蟲對植物根系的損傷[36]，從而減少了病原菌的侵染。這些機制相互作用，相互協(xié)同，對提高復(fù)合菌劑的生防效果可能有積極的促進作用。

本文中另一個想探討的問題是接入土壤中的功能菌（non-pathogenicsp.，sp.和sp.）是否會對香蕉枯萎病病原菌產(chǎn)生直接的抑制作用？盡管復(fù)合真菌制劑NFPT處理木霉屬相對豐度較CK處理高（圖5b）），但是木霉屬相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)未達到顯著的負相關(guān)（表3）。此外，復(fù)合真菌制劑NFP處理擬青霉屬相對豐度在3個處理中最高（圖5a）），但是屬相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)也未達到顯著的負相關(guān)（表3）。本研究中復(fù)合菌劑處理（NFP和NFPT）鐮刀菌屬相對豐度高于CK處理，但差異未達到顯著水平（圖5c）），鐮刀菌屬相對豐度與香蕉枯萎病病情指數(shù)呈負相關(guān)（未達到顯著水平），且病原菌尖孢鐮刀菌的qPCR 分析結(jié)果表明復(fù)合真菌菌劑處理（NFP和NFPT）病原菌尖孢鐮刀菌數(shù)量顯著低于CK處理（圖2），但是由于Illumina MiSeq平臺測序長度的限制，測序結(jié)果不能在物種級別上進行詳細的分類特征描述，因此難以區(qū)分致病性尖孢鐮刀菌和非致病性尖孢鐮刀菌。綜上所述，本研究結(jié)果表明，引入土壤中的微生物（非致病性尖孢鐮刀菌Non-pathogenicsp.、木霉菌sp.和淡紫擬青霉菌sp.）在盆栽土壤中生存能力有限，并且它們的豐度對豐度和防治香蕉枯萎病的直接影響很小，并不對病原菌產(chǎn)生直接的拮抗作用。

本試驗通過兩季的盆栽試驗，利用對細菌16S rRNA基因和真菌ITS區(qū)域的高通量測序，研究了復(fù)合真菌制劑對香蕉枯萎病的防治效果及其機理。但是由于16S rRNA和ITS 測序僅能開展在菌屬層面的分析，因此，后續(xù)試驗將通過宏基因組和轉(zhuǎn)錄組等分子生物學手段進一步探索影響香蕉枯萎病發(fā)生的關(guān)鍵菌種及其功能基因，為防治香蕉枯萎病提供理論依據(jù)。本研究所得結(jié)果基于盆栽試驗，需要進一步在田間試驗中驗證，然后再應(yīng)用于生產(chǎn)。

4 結(jié) 論

基于盆栽研究結(jié)果表明，施用復(fù)合真菌制劑顯著降低了香蕉枯萎病的病情指數(shù)，能有效防治香蕉枯萎??；施用復(fù)合真菌制劑提高了細菌和真菌豐富度和多樣性，改變了細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)；加入土壤中的生防真菌菌株在發(fā)揮其拮抗作用的同時刺激了土壤自身潛在的有益微生物種群，與之協(xié)同作用，提高了復(fù)合真菌制劑對香蕉枯萎病的防治效果。

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Effects of Complex Anti-Fungal Agents Biocontrolling Fusarium Wilt on Banana and Its Microbiological Mechanism

GUI Sha, LIU Fang, ZHANG Lidan, FAN Xiaolin?

(College of Natural Resource and Environment Science, South China Agricultural University, R & D Center of Environment Friendly Fertilizer Science and Technology of Guangdong Provincial University, Guangzhou 510642, China )

【】Worldwidely, banana production is severely hindered by banana Fusarium wilt, a devastating soil-borne disease caused byf. sp.(Foc). With no widely adopted effective methods available to control or prevent the disease, it causes serious economic losses every year. In this study, complex biocontrol fungal agents were introduced and effects of their application preventing banana Fusarium wilt and potential mechanisms were explored, in an attempt to provide certain references for controlling disease on the large field scale. 【】 A pot experiment, lasting for 2 seasons were conducted and designed to have three groups of pots, namely, CK (no controlling agent applied), NFP (NFP for application of a complex anti-fungal agent prepared by combining non-pathogenicsp. andsp. in 1︰1 ratio), and NFPT (application of a complex anti-fungal agents prepared by combining non-pathogenicsp.,sp. andsp. in 9︰9︰4 ratio) for comparison between the pots for effects of the applications controlling banana Fusarium wilt and effects on soil microbial diversity. The Illumina Miseq high-throughput sequencing platform was used to analyze bacterial 16SrRNA gene and fungal ITS regions, the real-time fluorescence quantification PCR (RT-qPCR) was to determine number of pathogens in the soil. 【】Applications of the complex fungal agents (NFP and NFPT) have good effects of controlling banana Fusarium wilt disease, with control efficiency being 43% and 48%, respectively, and improve richness and diversity of bacteria and fungi. Principal coordinate analysis (PCoA) based on Bray-curtis distance matrix shows that significant differences in composition of the bacterial and fungal communities exist between the pots applied with the complex fungal agents and the pots in CK. The first principal component (PC1) explains 29.45% and 43.14% of the variability in the bacterial and fungal communities, respectively, and differs sharply between the treatment pots and the CK pots in composition of the overall bacterial and fungal communities. The microbes (non-pathogenicsp.,sp. andsp.) introduced into the soil are found quite limited in survivability in this study, and their abundance has only a marginal direct effect on the number ofand disease severity of the Fusarium wilt disease. However, they suppress the disease by altering composition of the soil microbiome. In particular, application of the complex fungal agents (NFP and NFPT) increases relative abundances of the beneficial indigenous microbial groups, such as,,, n,and_4. Their relative abundances are good indicators of the disease suppression effect and may play a keystone role in the process of the complex fungal agents suppressing banana Fusarium wilt disease. 【】 In a word, application of the complex fungal agents (NFP and NFPT) significantly reduces the banana Fusarium wilt disease severity index. All the findings presented above show that relative abundance of the introduced non-pathogenicsp.,sp. andsp. has only a marginal effect on. In contrast, the changes in abundance and community structures of the bacteria and fungi after application of the agents are the key factors suppressing the disease. Application of the agents stimulates the potential beneficial indigenous microbial groups that are significantly and negatively related to banana Fusarium wilt disease severity index. Thus, the effect of the complex fungal agents suppressing the disease seemed to be a joint one of the actual antagonism of the introduced microbes with the pathogens and their promoting growth of beneficial indigenous microbial groups.

Complex biocontrol fungal agents; Banana Fusarium wilt; Illumina Miseq High-throughput sequencing; Soil microbial diversity

S432.4+5

A

10.11766/trxb201904180111

桂莎，劉芳，張立丹，樊小林. 復(fù)合菌劑防控香蕉枯萎病的效果及其微生物學機制[J]. 土壤學報，2020，57（4）：995–1007.

GUI Sha，LIU Fang，ZHANG Lidan，F(xiàn)AN Xiaolin. Effects of Complex Anti-Fungal Agents Biocontrolling Fusarium Wilt on Banana and Its Microbiological Mechanism[J]. Acta Pedologica Sinica，2020，57（4）：995–1007.

* 國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFD0201100），廣東省省級重大科研項目（2016KZDXM029）和國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-31-06）資助 Supported by the National Key Research and Development Program of China（No. 2018YFD0201100），the Major Scientific Research Projects of Guangdong Province in China（No.2016KZDXM029） and the Special Project for the Construction of China Agriculture Research System（No. CARS-31-06）

，E-mail：crfxiaolinfan@126.com

桂 莎（1990—），女，湖南永州人，博士研究生，主要從事植物營養(yǎng)和肥料學研究。E-mail：932005243@qq.com

2019–04–18；

2019–07–23；

2019–09–24

（責任編輯：陳榮府）