中藥降脂復(fù)方中總蛋白提取優(yōu)化及抗氧化實驗研究

王婭玲 于佩琳 李佳懌

摘 ? ? ?要：近年來高血脂癥發(fā)病率一直處于上升趨勢，中藥治療高血脂癥獨特的功效引起人們廣泛的關(guān)注。為考察山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗室自制減肥降脂復(fù)方降血脂功效，設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化實驗測定復(fù)方中蛋白質(zhì)含量，研究超聲時間、pH、料液比三個因素對復(fù)方中蛋白質(zhì)得率測定的作用， 分別在50 min、10、1∶40 mg·mL-1時， 復(fù)方中蛋白質(zhì)得率最佳，并在此條件下測定對DPPH自由基的抑制情況。

關(guān) ?鍵 ?詞：自制新復(fù)方;蛋白質(zhì);蛋白質(zhì)含量測定;工藝優(yōu)化;高血脂癥

中圖分類號：TQ 041 ? ? ? 文獻標識碼： A ? ? ? 文章編號： 1671-0460（2020）04-0552-04

Abstract： At present， the incidence of hyperlipidemia has been on the rise， and the unique efficacy of traditional Chinese medicine in treating hyperlipidemia has aroused widespread concern. In order to investigate the lipid-lowering effect of the self-made weight-reducing and lipid-lowering compound prescription made by the laboratory of Shandong university of traditional Chinese medicine， response surface optimization experiment was designed to determine the protein content in the prescription. the effects of ultrasonic time， pH， and solid-liquid ratio on the determination of protein content in the compound prescription were investigated. the protein yield was the best when 50 min， 10， and 1∶40 mg·mL-1 respectively， and DPPH radical scavenging capacity was determined under this condition

Key words： Chinese medicine fat-lowering complex; total protein content; hyperlipidemia; process optimization

中藥降脂復(fù)方含有多種活性成分[1]，對機體有多種作用，可以彌補西藥的不足。中藥降脂復(fù)方均為植物藥，相較于化學(xué)合成藥物毒副作用更小。當(dāng)下基于植物成分的藥物治療已成為當(dāng)前關(guān)注熱點[2]。中藥降脂復(fù)方由靈芝、蘆薈、大黃、砂仁、炒芡實、桔梗等組成，能夠調(diào)節(jié)代謝紊亂、顯著降低細胞氧化速度 [3]，從而發(fā)揮降血脂的功效。

本實驗采用超聲提取法，蛋白質(zhì)在水中的溶解量增加，相較于傳統(tǒng)水提法，對蛋白質(zhì)提取更加充分，并采用優(yōu)化實驗確定復(fù)方中蛋白質(zhì)的最佳提取方案，在最佳方案下測定復(fù)方中蛋白質(zhì)對自由基的抑制效果，綜合評價該復(fù)方的降血脂能力，以期為推動中藥應(yīng)用更加廣泛化。

1 ?實驗用品

1.1 ?試劑

牛血清蛋白（上海伯奧生物科技公司）、酒石酸鉀鈉、DPPH、福林酚等均為分析純[4]。

1.2 ?器材

PHS-25型pH計; Mettler AE240電子天平[5] ; HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋; 紫外可見分光光度計等。

2 ?方法

2.1 ?實驗設(shè)計

2.1.1 ?標曲繪制

稱取0.02 g牛血清蛋白樣品，超聲混勻定容為100 mL，配置待測溶液。分別吸取溶液，移液槍移取現(xiàn)配的堿性銅溶液5 mL，震蕩，靜等10 min，避光加入福林酚試劑0.5 mL，反應(yīng)30 min[6]，測定吸光度，所得回歸方程為：

y=0.180 1x-0.006 3，R2=0.999 0

2.1.2 ?總蛋白含量測定

精確稱取1.0 g藥品，恒溫超聲水提50 min，充分溶解后，抽濾， 重復(fù)兩次實驗，加蒸餾水至100 mL， 精確量取6 mL， 再次定容為100 mL [7]。

2.1.3 ?單因素實驗

進行實驗以此確定響應(yīng)面實驗各因素作用的最大值[8]，前后各取一個因素，降低試驗誤差，減少試驗次數(shù)。

2.1.4 ?響應(yīng)面優(yōu)化實驗

綜合單因素實驗結(jié)果，每個因素取三個水平，采用超聲水提對復(fù)方中蛋白質(zhì)提取優(yōu)化[9]，以蛋白質(zhì)得率為指標，見表1。

2.2 ?體外抗氧化實驗

制備標準DPPH乙醇混合液，對照品為維生素C，避光操作，參照文獻操作檢測溶液的吸光度。

3 ?結(jié)果

3.1 ?優(yōu)化實驗

超聲時間、料液比、pH之間的二次項回歸方程為：

Y=36.34+0.075A-0.87B+3.41C+0.20AB+1.93AC-2.38BC+2.32A2-1.22B2-2.07C2

方差分析結(jié)果見表2。

方差評估P值<0.000 1，表明實驗數(shù)據(jù)誤差較小[10]，操作過程較為規(guī)范;由表3可知，R2=0.920 5， Radj2=0.818 3，二者差值較小，表明所建回歸方程的擬合程度較好，可用于響應(yīng)值預(yù)測。超聲時間、料液比的P值均大于0.1，表明這兩個因素對蛋白質(zhì)含量測定干擾作用較小[11]，pH值對復(fù)方中蛋白質(zhì)的測定影響較明顯。PAB、PAC均大于0.1，說明A與B、A與C之間的相互作用對蛋白質(zhì)含量測定的影響程度較小，因此實驗結(jié)果較為準確。根據(jù)F值可判斷這三個因素對實驗結(jié)果的影響程度[12]，因此三個因素的作用大小為pH>料液比>超聲時間，蛋白質(zhì)的提取受超聲時間的影響較小，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，超聲波不會破壞蛋白質(zhì)組成。

3.2 ?交互作用分析

響應(yīng)面圖用于反映因素與結(jié)果間的作用關(guān)系。曲線越平緩說明考察因素對實驗結(jié)果作用越不明顯;等高線緊密、彎曲弧度較大，證明考察因素之間的作用對蛋白質(zhì)提取干擾程度較小，數(shù)據(jù)間相互獨立性較強。響應(yīng)面曲線呈二次拋物線形，在所測范圍內(nèi)存在極值。見圖1，曲面斜率較小，隨著料液比濃度比例增大，蛋白質(zhì)含量檢測變化不大，結(jié)合ANOVA分析結(jié)果，料液比對蛋白質(zhì)含量檢測作用很小，pH對實驗結(jié)果影響較大，PBC=0.004 63<0.05說明二者之間存在交互作用，且交互作用對蛋白質(zhì)含量檢測干擾程度較大[13];由圖2可知，曲面較平緩，二者之間的交互作用極小，幾乎可以忽略，可能原因為蛋白質(zhì)雖受pH影響較大，但在超聲溶出階段受影響較小[14]，蛋白質(zhì)本身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，雙螺旋結(jié)構(gòu)不易被破壞。由圖3可知，結(jié)合方差分析結(jié)果，PA=0.991 7，PB=0.250 9， 均大于0.1，說明干擾程度較小，其交互作用對實驗結(jié)果的干擾幾乎可以忽略。

由圖2可知，雙曲面平緩，等高線稀疏，表明超聲時間和pH值對蛋白質(zhì)含量測定的影響不顯著，其交互作用干擾也較小，可能原因為超聲時間過長蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，其他成分的浸出使蛋白質(zhì)得率變小。

由圖3可知，當(dāng)料液比為1∶50 g·mL-1時，蛋白質(zhì)溶出量隨超聲時間的延長而增加，超聲50 min后得率開始降低，干擾蛋白質(zhì)的提取。

3.3 ?抗氧化實驗結(jié)果

中藥降脂復(fù)方能夠明顯抑制體內(nèi)的氧化反應(yīng)，見圖4，待測溶液中蛋白質(zhì)含量越多[15]， DPPH自由基的抑制能力越顯著，溶液濃度為0.45 mg.mL-1，曲線不再上升達到最大值[16]。對自由基的抑制能力可反應(yīng)藥物的抗氧化效果[17]，所測溶液的吸光度越大，DPPH自由基抑制率值越大。

4 ?結(jié)論

目前關(guān)于蛋白質(zhì)的研究眾多，通過體內(nèi)蛋白質(zhì)的變化判斷機體疾病的動態(tài)變化[18]。阮之平[19]等研究發(fā)現(xiàn)蟾蜍多肽具有抗腫瘤活性，能夠阻滯癌細胞擴散和分化;梅兵[20等]總結(jié)了鹿茸多肽能夠治療骨骼損傷、促進愈合、保護心肌;劉巧[21]通過地龍蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)其具有很好的抗凝血、消炎作用。因此，中藥中的蛋白質(zhì)作用仍有待研究。

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