正交法優(yōu)化參苓白術(shù)散總黃酮的提取工藝

王悅　王婭玲　鄒婧　陶然　高世杰

摘????? 要：目的 為深入研究參苓白術(shù)散現(xiàn)代臨床功效，以確保藥效的發(fā)揮，本試驗(yàn)進(jìn)行參苓白術(shù)散總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定，正交試驗(yàn)篩選最佳提取方案。方法 設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，以乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、用量和提取時(shí)間為優(yōu)化條件，測(cè)定參苓白術(shù)散中黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果 參苓白術(shù)散總黃酮的最優(yōu)試驗(yàn)提取工藝：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%，提取時(shí)間 2 h，乙醇用量 25 mL。

關(guān)? 鍵? 詞：參苓白術(shù)散;總黃酮;乙醇提取;正交試驗(yàn)法

中圖分類(lèi)號(hào)：R284?????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A?????? 文章編號(hào)： 1671-0460（2020）06-1039-04

Orthogonal Method was used to Optimize the Extraction Process of Total Flavonoids From Shenling Baizhu Powder

WANG Yue， WANG Ya-ling， ZOU Jing， TAO Ran， GAO Shi-jie

（School of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）

Abstract： Objective To study the modern clinical efficacy of Shenling Baizhu Powder in depth to ensure the effectiveness of the drug. This experiment was used to determine the total flavonoid content of Shenling Baizhu Powder， and the process was optimized by orthogonal method to screen the best extraction scheme. Methods A single-factor experiment was designed to determine the content of flavonoids in the Shenling Baizhu Powder and to optimize the extraction process， with ethanol concentration， ethanol dosage and extraction time. Results The best extraction process for total flavonoids in Shenling Baizhu Powder is： 50% ethanol concentration， 25 mL of ethanol， extraction time of 2 h.

Key words： Shenling Baizhu Powder; Total flavonoids; Ethanol extraction; Orthogonal experimental method

參苓白術(shù)散為古籍醫(yī)方，臨床應(yīng)用歷史悠久。全方由蓮子肉、桔梗、白扁豆、人參、甘草等組成^[1]，能夠益脾和胃、生清降濁、安胎固神，多用于治療脾胃虛弱、舌苔白膩、胸脘痞塞等常見(jiàn)疾病^[2]。本方藥性溫和，具有很好的健脾作用，人參、茯苓、白術(shù)共用為君輔以山藥、白扁豆等增強(qiáng)利水滲濕的作用。

該方配伍靈活，功效顯著。茯苓具有安神定驚、調(diào)和脾胃的功效^[3]，在治療脾虛、痰飲、濕熱、帶下等方面功效顯著，“十藥九茯苓”便是說(shuō)茯苓在復(fù)方配伍中十分常見(jiàn)^[4];人參為貴重中藥，藥性溫和，能夠補(bǔ)益元?dú)?sup>[5]、延緩衰老、安神定驚^[6]，具有安神固元、延年益壽的作用;白術(shù)能夠利水滲濕、止汗安胎^[7]，能夠調(diào)節(jié)脾胃運(yùn)動(dòng)、增強(qiáng)免疫、降脂等，三者共用為君以增強(qiáng)參苓白術(shù)散的功效。

與中藥抗腫瘤、抗菌等方面的研究相比，中藥抗氧化方面的研究仍較為薄弱^[8]，因此該試驗(yàn)采用正交法優(yōu)化參苓白術(shù)散中總黃酮的提取條件，通過(guò)常溫下測(cè)定的吸光度計(jì)算總黃酮含量，可為參苓白術(shù)散總黃酮體外抗氧化活性及其機(jī)制的研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1? 試驗(yàn)

1.1? 材料

1.1.1? 藥材

參苓白術(shù)散粉末（市售，經(jīng)鑒定）。

1.1.2? 試劑

蘆丁對(duì)照品，三氯化鋁，乙醇等均為分析純。

1.1.3? 儀器

高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）;可見(jiàn)分光光度計(jì);遠(yuǎn)外紅輻射干燥箱;循環(huán)式真空泵;電子天平^[9]。

2? 試驗(yàn)過(guò)程

2.1? 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 0.02 g，加入乙醇密封超聲助溶，移液槍依次取對(duì)照品溶液加到試管中，各自加30%乙醇稀釋至 5 mL，依次加入 0.3 mL 5%的亞硝酸鈉，震蕩;再加0.6 mL 10%三氯化鋁;然后加2 mL 4%氫氧化鈉，用30%乙醇稀釋?zhuān)瑩u勻，靜置15 min，于 510 nm處測(cè)其吸光度^[10]。

2.2? 參苓白術(shù)散待測(cè)液

精密稱(chēng)量參苓白術(shù)散約 1.00 g，向其中加入定量乙醇，采用乙醇回流的方法回流2 h，離心，傾出上清液，定容備用。

2.3? 質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

將上述制備好的溶液備用，參照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方式，測(cè)定參苓白術(shù)散中總黃酮的吸光度，于常溫下進(jìn)行，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算參苓白術(shù)散中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.4? 單因素試驗(yàn)

本試驗(yàn)以參苓白術(shù)散復(fù)方為試驗(yàn)材料，以最終黃酮得率為指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)乙醇的用量、質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間三個(gè)變量進(jìn)行試驗(yàn)。

2.5? 正交試驗(yàn)

采取乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乙醇用量、提取時(shí)間 3 個(gè)因素，在每個(gè)因素中挑選 3 個(gè)水平，開(kāi)展正交試驗(yàn)，以參苓白術(shù)散中總黃酮提取量為考核標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)表1 。

3? 結(jié)果分析

3.1? 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

如圖1所示， 繪制吸光度-蘆丁溶液的表達(dá)式，得回歸方程：Y = 8.705x- 0.01，R²= 0.999 2。

3.2? 單因素試驗(yàn)

3.2.1? 乙醇濃度

由圖 2 可知，黃酮的提取受乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響較為明顯，在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%～60%梯度內(nèi)呈開(kāi)始上升然后下降的變化，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 50%時(shí)得到的黃酮最多，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的逐漸升高抑制了黃酮的提取，可能原因?yàn)楦哔|(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇在常溫下極易揮發(fā)，濃度越高揮發(fā)效果越強(qiáng)，主要成分乙醇揮發(fā)在空氣中。

3.2.2? 乙醇用量

由圖 3 可知，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定過(guò)程中乙醇的最大用量為 30 mL，在試驗(yàn)用量范圍內(nèi)，總黃酮得率一直呈上升趨勢(shì)，受試驗(yàn)條件和實(shí)際應(yīng)用中節(jié)省材料考慮，選擇乙醇用量為 30 mL。

3.2.3? 提取時(shí)間

根據(jù)圖 4 ，當(dāng)提取時(shí)間變長(zhǎng)時(shí)，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)表現(xiàn)出先逐漸升高，黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2.5 h 時(shí)最大，提取最充分，而后降低。回流時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致其有效成分的破壞，并且其他物質(zhì)的溶出易導(dǎo)致提取的黃酮摻雜。

3.3? 正交試驗(yàn)結(jié)果

此試驗(yàn)查核了乙醇的用量、質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間共三個(gè)變量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的作用，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，記L₉（3⁴），見(jiàn)表 2。方差結(jié)果分析見(jiàn)表3。

由表2 、表3可以看出，三個(gè)因素之間，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)參苓白術(shù)散中黃酮的提取影響最大，其次，乙醇用量的作用較次之，對(duì)提取時(shí)間來(lái)說(shuō)，它的極差最小，作用最不顯著，對(duì)最后的結(jié)果影響最低。另外，對(duì)比乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)各水平為K₁>K₂>K₃，表示這三個(gè)水平中，用 50%乙醇較好;乙醇用量各水平比較是K₃>K₂>K₁，所以選擇 25 mL 乙醇用量較優(yōu);在時(shí)間方面，其每水平之間比較為K₂>K₁>K₃，能夠看出2 h 為最佳提取時(shí)間。綜上，最佳提取工藝組合為：A₁ B₃ C₂。

3.4? 結(jié)果

據(jù)以上正交試驗(yàn)結(jié)果，按優(yōu)選出的試驗(yàn)條件進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，以黃酮提取量為指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表 4。

4? 討論

現(xiàn)代臨床試驗(yàn)證明參苓白術(shù)散具有調(diào)節(jié)人體免疫功能、減少感染、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)的作用。李姿

慧^[11]等結(jié)合大鼠試驗(yàn)表明參苓白術(shù)散在治療潰瘍性結(jié)腸炎方面作用顯著，療效突出，能夠減少瀉下，緩解大便溏薄癥狀^[12];李烜運(yùn)用參苓白術(shù)散治療中晚期胃癌能夠有效減少腫瘤惡化，減少病灶轉(zhuǎn)移，減輕患者痛苦;雷遠(yuǎn)忠^[13]對(duì)參苓白術(shù)散配方進(jìn)行加減調(diào)和，發(fā)現(xiàn)對(duì)于脾虛型哮喘具有較好的治療效果，氣喘現(xiàn)象減少，呼吸更加順暢，發(fā)作頻率也逐漸減少。

現(xiàn)今，已知的提取黃酮類(lèi)化合物的方法以酶輔助提取法^[14]、溶劑提取法^[15]、超聲輔助提取法^[16]、超臨界CO₂萃取法^[17]、微波輔助提取法^[18]為主，除此之外，還有多種方法需要我們?nèi)ヌ剿?。本試?yàn)采用有機(jī)溶劑提取法，以乙醇促進(jìn)黃酮溶出。采用乙醇回流提取能夠使參苓白術(shù)散中乙醇溶解更充分。通過(guò)將乙醇作為溶劑，對(duì)其不同濃度、用量以及提取時(shí)間考察，把參苓白術(shù)散總黃酮作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，最終確定組方中總黃酮的最優(yōu)提取方案：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%，乙醇用量為 25 mL，提取時(shí)間為2 h，為今后中藥組方的抗氧化方面的研究奠定良好的基礎(chǔ)。

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