基于電化學(xué)生物傳感器的設(shè)計及在腫瘤遺傳物質(zhì)檢測中的研究進展

馬霄，謝寶鮮

1 杭州市第一人民醫(yī)院設(shè)備科 （浙江杭州 310006）；2 杭州市腫瘤醫(yī)院腫瘤外科 （浙江杭州 310002）

癌癥或稱惡性腫瘤，是目前人類最主要的死亡原因，并已成為嚴重威脅人類健康和生命的常見病、多發(fā)病[1]。一部分癌癥患者可以得到有效的控制或治愈，而早期診斷是提高癌癥患者治愈率最有效的手段[2]。腫瘤標志物是指在癌癥發(fā)生時由腫瘤細胞本身或人體自身應(yīng)對反應(yīng)而產(chǎn)生的一類物質(zhì)，存在于腫瘤組織、血液、體液和排泄物中, 包括遺傳物質(zhì)、酶和代謝物等多種成分[3]。遺傳物質(zhì)即核酸，是由核苷酸聚合成的生物大分子化合物, 也是生命的最基本組成物質(zhì)，按照化學(xué)成分組成的不同分為脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）和核糖核酸（ribonucleicacid, RNA）[4-5]。

電化學(xué)生物傳感器是近些年來備受關(guān)注的新型生物傳感器，具有較高的靈敏度、較好的選擇性等優(yōu)點，建立電化學(xué)生物傳感方法對腫瘤遺傳物質(zhì)標志物的檢測具有重要意義[6]。電化學(xué)生物傳感器檢測遺傳物質(zhì)，是以遺傳物質(zhì)為敏感元件或檢測對象，通過換能器將遺傳物質(zhì)特異性識別過程中產(chǎn)生的信號轉(zhuǎn)化為電信號，從而實現(xiàn)定性或定量檢測；此外，電化學(xué)生物傳感器在對腫瘤遺傳物質(zhì)樣本檢測的重復(fù)再生和循環(huán)雜交方面具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，已成為目前腫瘤患者早期臨床診治和藥物指導(dǎo)的強大工具[7]。本研究擬從電化學(xué)生物生物傳感器著手，總結(jié)近年來遺傳物質(zhì)探針的設(shè)計和實施思路, 從而為檢測腫瘤遺傳物質(zhì)標志物提供有意義的方法。

1 電化學(xué)生物傳感器在腫瘤遺傳物質(zhì)標志物構(gòu)建中的策略

電化學(xué)生物傳感器以電極為生物樣品識別元件和適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器，生物活性物質(zhì)（如遺傳物質(zhì)、細胞、組織、抗原抗體、酶和微生物等）固定在電極上，通過生物分子之間的特異性識別作用將待測物質(zhì)與其反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)化為可以識別的電信號，從而實現(xiàn)對待測物質(zhì)的定性或定量檢測。

探針的選擇及固定、信號放大材料的應(yīng)用和電化學(xué)修飾技術(shù)是提高腫瘤遺傳物質(zhì)標志物檢測靈敏度的關(guān)鍵（圖1）。

圖1 電化學(xué)生物傳感器的設(shè)計及在腫瘤遺傳物質(zhì)中的檢測流程圖

2 DNA 腫瘤標志物及其電化學(xué)檢測應(yīng)用

2.1 單核苷酸多態(tài)性

基因組序列差異有多種，如堿基插入、缺失、單核苷酸多態(tài)性（single nucleo-tide polymorphism，SNP）及微衛(wèi)星等，SNP 只是其中最普遍的一種，在臨床上有重大的意義。SNP 在基因組中分布廣泛，有研究表明，SNP 在人類基因組中每300堿基對就出現(xiàn)一次。大量存在的SNP 位點，使人們有機會發(fā)現(xiàn)各種疾病，包括腫瘤相關(guān)的基因組突變。如KRAS，BRAF，BRCA1和EGFR 這些基因在許多腫瘤類型中均具有較高的突變頻率，且與癌癥的進展有關(guān)，是重要的生物標志物。

Jagotamoy Das 等[8]首次在不需要酶放大的情況下成功檢測無細胞核酸（cell free nucleoacid，cfNA），并成功應(yīng)用到肺癌和黑色素瘤患者檢測中。Dr. Jagotamoy Das 等[9]利用組合探針（型號：CPs）直接檢測患者血清中有突變的基因。L.A.Gugoasa 等[10]利用鉑和二氧化鈦改性的石墨烯粉末修飾傳感器表面，用于檢測P53、KRAS 和CEA 結(jié)腸癌生物標志物，得到的測定限低，靈敏度高的生物傳感器用于結(jié)腸癌早期篩查。

BoSitu等[11]首先利用透射電鏡、電化學(xué)阻抗譜和循環(huán)伏安法對合成的復(fù)合納米修飾粒子進行了表征，再利用雙重擴增策略研制了一種用于結(jié)直腸癌細胞BRAF V600E突變檢測的電化學(xué)生物傳感器，該方法制備的傳感器具有靈敏度高、操作簡單、成本低、檢測方法容易驗證等優(yōu)點，為復(fù)雜腫瘤樣品中其他罕見突變的分析奠定了基礎(chǔ)。Xiangzhao Ai等[12]利用“納米-微”技術(shù)研制了一種簡單、靈敏、快速的基于量子點的多重遺傳物質(zhì)生物傳感器，實現(xiàn)了BRAF和BRCA的同時檢測。

AbhayVasudev 等[13]提出了一種電化學(xué)傳感器，將抗EGFR 抗體固定在二硫代雙琥珀酰亞胺基丙酸酯自組裝單層膜（self-assembled monolaye，SAM）修飾的金電極上，實現(xiàn)了EGFR 的無標記檢測。HodaIlkhani 等[14]將生物素化的抗人表皮生長因子受體固定在鏈霉親和素包裹的磁珠（ferrite bead，fb）上作為捕獲探針，并將多克隆抗人表皮生長因子受體抗體與檸檬酸鹽包裹的金納米粒子偶聯(lián)作為信號探針，在最佳條件下，EGFR 傳感器的動態(tài)濃度范圍為1～40 ng/ml，最低檢測限為50 pg/ml，相對標準偏差＜4.2%。

2.2 循環(huán)腫瘤細胞DNA

循環(huán)腫瘤基因（循環(huán)腫瘤DNA）是指腫瘤細胞體細胞DNA 經(jīng)脫落或當(dāng)細胞凋亡后釋放進入循環(huán)系統(tǒng)，是一種特征性的腫瘤生物標記。循環(huán)腫瘤細胞DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)是一種特征性的腫瘤生物標記物，來自腫瘤細胞的體細胞突變，不同于遺傳突變的是其存在于體內(nèi)每個細胞，可以被定性、定量和追蹤。通過ctDNA 檢測能夠檢出血液中的腫瘤蹤跡，所以ctDNA 已被證實為乳腺癌、黑色素瘤、大腸癌、肺癌等癌癥的生物遺傳物質(zhì)標志物。

SufenWang 等[15]采用循環(huán)伏安法研究了腫瘤抗生素與ctDNA 在溶液中的相互作用，通過不可逆電活性分子與ctDNA 結(jié)合的電化學(xué)方程，建立了蒽醌類化合物與腫瘤的相關(guān)聯(lián)系。

3 RNA 腫瘤標志物及其電化學(xué)檢測應(yīng)用

RNA 是由核糖核苷酸（一個核糖核苷酸分子由磷酸、核糖和堿基構(gòu)成）經(jīng)磷酯鍵縮合而成的長鏈狀分子，能動態(tài)反映細胞狀態(tài)，是監(jiān)測癌癥的重要腫瘤標志物。

3.1 信使RNA

信使RNA（mRNA）是以DNA 的一條鏈為模板，以堿基互補配對原則轉(zhuǎn)錄而形成的一條單鏈，主要功能是實現(xiàn)遺傳信息在蛋白質(zhì)上的表達。

R.M.Torrente-Rodríguez[16]報道了采用電化學(xué)磁生物傳感器同時測定未稀釋唾液標本中兩種與涎腺口腔癌相關(guān)的生物標志物IL-8及其信使RNA（IL-8 mRNA）的研究進展。細胞內(nèi)凋亡抑制蛋白Survivin mRNA 已成為早期準確診斷腫瘤的重要生物標志物，Jing Liu 等[17]根據(jù)DNA 末端二茂鐵與survivin mRNA 反應(yīng)后和電極表面電子轉(zhuǎn)移效率的變化，設(shè)計了一種可切換的survivin mRNA 電化學(xué)傳感器。

3.2 長鏈非編碼RNA

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）表觀遺傳學(xué)主要機制包括DNA 甲基化、組蛋白修飾及新近發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA，使研究基因表達發(fā)生了可遺傳的改變，對細胞的生長分化及腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。

Fei Liu 等[18]制備了基于單壁碳納米管包裹金-銠空心納米球的修飾策略，產(chǎn)生了催化放大信號，該生物傳感器明顯增強了lncRNA 的催化作用，并提供了超靈敏的檢測。Liu 等[19]研制了一種基于納米金多面體聚酰胺-胺樹枝狀大分子的肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（metastasis-associated lungadenocarcinoma transcript 1，MALAT1）檢測新策略，采用多壁碳納米管和納米金復(fù)合物作為捕獲探針固定化基質(zhì)，納米金聚酰胺胺樹枝狀大分子作為檢測探針的跟蹤標記，該方法具備較強的表面結(jié)合捕獲探針能力，該生物傳感器對MALAT1具有超靈敏的檢測作用及顯著的催化作用。其中MALAT1是一種存在于血清中的lncRNA，是檢測肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的重要生物標志物，結(jié)果表明該技術(shù)在臨床肝癌診斷中具有潛在的應(yīng)用價值。

3.3 微小RNA

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類內(nèi)生的、長度約20～24個核苷酸的小RNA，幾個miRNA 可調(diào)節(jié)同一個基因，且在細胞分化、生物發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮巨大作用，引起越來越多研究人員的關(guān)注。有研究表明，兩個miRNA 水平的下降和慢性淋巴細胞白血病之間的顯著相關(guān)提示miRNA 和癌癥之間可能存在潛在關(guān)系。

Mostafa Azimzadeh 等[20]提 出 了 一 種 用 于miR-155等離子體檢測的新型電化學(xué)納米生物傳感器，基于在玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）表面修飾的氧化石墨烯（GO）片上的巰基化探針功能化金納米棒（gold nanorods，GNRs）電化學(xué)信號與靶miRNA 濃度在2.0 fm～8.0 pm 呈線性關(guān)系，檢測限為0.6 fm，這種納米生物傳感器具有很高的特異性，能夠快速鑒別互補、非互補、單堿基錯配、三堿基錯配的miRNA。

4 展望

近年來，高通量測序技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用，越來越多的腫瘤遺傳物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，并在精準診療和用藥指導(dǎo)上發(fā)揮了不可替代的作用。電化學(xué)技術(shù)是一門交叉學(xué)科的綜合技術(shù)，在腫瘤檢測及臨床藥物等方面得到了廣泛應(yīng)用，新的電化學(xué)修飾方法和新材料的應(yīng)用也使電化學(xué)生物傳感器得到了快速發(fā)展，將電化學(xué)生物傳感技術(shù)應(yīng)用到腫瘤檢測方向一定會有更長足的發(fā)展。