非酒精性脂肪性肝病進展中肝組織細胞衰老相關基因P21、SIRT6 和NF-κB mRNA 表達

謝益文 徐素美 陳芝蕓 楊晴柔 何蓓暉

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）患病率與日俱增，已成為最常見的慢性肝病之一。其疾病譜范圍從單純性脂肪肝到脂肪性肝炎，并逐漸向肝硬化、肝癌等終末期肝病進展[1]。研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD 中聚集著肝細胞衰老現(xiàn)象[2-3]。課題組前期采用高脂誘導小鼠NAFLD 模型發(fā)現(xiàn)，隨高脂喂養(yǎng)時間的增加，模型動物血脂紊亂加重，血清肝酶逐步增高；肝組織病理顯示，在8 周時肝臟以肝細胞脂肪變?yōu)橹?，有輕度炎癥的表現(xiàn)；16 周時肝組織脂肪變加重，炎癥明顯，并有肝細胞氣球樣變的表現(xiàn)；至24 周時肝組織在脂肪變和炎癥基礎上出現(xiàn)纖維化的表現(xiàn)[4]。為進一步研究肝細胞衰老在NAFLD 進程中的作用，本研究動態(tài)觀察高脂誘導的NAFLD 模型小鼠8、16、24 周3 個時間點肝組織肝細胞衰老相關基因細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A（P21）、沉默信息細節(jié)因子6（SIRT6）、核轉錄因子κB（NF-κB）表達的變化，探討SIRT6/NF-κB 通路在阻遏NAFLD 模型小鼠肝細胞衰老的作用。

1 實驗材料

1.1 動 物 48 只健康雄性8 周齡C57BL/6 小鼠，SPF 級，體質量（190±10）g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物許可證號[SCXK（滬）2017-0005]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心屏障系統(tǒng)中，溫度（20±2）℃，相對濕度40%～60%，適應性飼養(yǎng)1 周后開始實驗。本實驗研究經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心實驗倫理審核通過（批準編號：10717）。

1.2 試 劑 高脂飼料（批號20170227）為南通特洛菲飼料科技有限公司提供；總RNA 提取試劑盒（批號AK1703）、反轉錄試劑盒（批號AK5301）、熒光定量PCR 試劑盒（批號AH80345A）為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.3 引 物 P21、SIRT6、NF-κB mRNA 引物由上海生工生物工程技術服務在限公司設計并合成。用β-actin 作為內(nèi)參。引物序列如下：SIRT6 上游引物：5'-CTCCAGCGTGGTTTTCCACA-3'，下游引物5'-GCCCATGCGTTCTAGCTGA-3'，擴增片段：184bp；P21上游引物：5'-CCTGGTGATGTCCGACCTG-3'，下游引物5'-CCATGAGCGCATCGCAATC-3'，擴增片段：103bp；NF-κB 上游引物：5'-ATGGCAGACGAT-GATCCCTAC-3'，下游引物：5'-CGGAATCGAAATCCCCTCTGTT-3'，擴增片段：117bp；β-actin 上游引物5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，下游引物5'-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3'，擴增片段：138bp。

2 實驗方法

2.1 分組及造模 48 只小鼠，適應性飼養(yǎng)1 周，用隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組，每組24 只，每日稱重，正常組小鼠每天予普通飼料喂養(yǎng)，模型組小鼠每天予高脂飼料（10%熟豬油、5%蛋黃粉、2%膽固醇、0.5%3 號膽鹽、普通飼料82.5%）喂養(yǎng)。正常組和模型組分別于喂養(yǎng)第8、16、24 周末各處理8 只小鼠。具體處理方法：小鼠處理前晚禁食不禁水，次日上午空腹麻醉下取肝組織，-80℃保存待用。

2.2 P21、SIRT6、NF-κB mRNA 表達水平的測定按照總RNA 提取試劑盒使用說明書提取上述肝組織總RNA，并計算RNA 純度和濃度。根據(jù)反轉錄試劑盒說明書將提取的總RNA 反轉錄為cDNA，最后以cDNA 為模板按熒光定量PCR 試劑盒說明書進行Realtime-PCR 擴增反應，以β-actin 為內(nèi)參，以相對表達量（2-△△CT）方法計算肝組織中P21、SIRT6、NF-κB mRNA 表達水平。

2.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0 軟件包進行分析統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（） 表示，計量資料采用單因素方差分析，計數(shù)資料采用非參數(shù)秩和檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

采用高脂飲食誘導NAFLD 模型小鼠，分別在第8、16、24 周觀察肝組織SIRT6、NF-κB、P21 mRNA表達，結果發(fā)現(xiàn)在造模第8 周時模型組SIRT6 mRNA 表達較正常組同期明顯增高（P＜0.05），16 周時較正常組同期有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而24 周時則較正常組同期明顯下降（P＜0.05）；模型組小鼠肝組織NF-κB mRNA 表達隨造模時間增加而稍有增強，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；造模第8 周，模型組P21 mRNA 表達與正常組同期差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），在造模第16 周和24 周則較正常組同期顯著增強（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 高脂誘導的NAFLD 小鼠肝組織衰老相關基因mRNA 表達（）

表1 高脂誘導的NAFLD 小鼠肝組織衰老相關基因mRNA 表達（）

注：正常組給予普通飼料喂養(yǎng)；模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)；P21 為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A；SIRT6 為沉默信息細節(jié)因子6；NF-κB 為核轉錄因子κB；β-actin 為β-肌動蛋白；與正常組同期比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

4 討論

NAFLD 聚集著肝細胞衰老現(xiàn)象，其肝細胞有端粒過早縮短、細胞核增大、P21 表達增加、細胞周期停滯等細胞衰老表現(xiàn)；正常肝臟中，肝細胞端粒長度不會發(fā)生改變，在慢性肝炎和肝硬化中，肝細胞出現(xiàn)端?？s短和衰老表現(xiàn)，而組織區(qū)域內(nèi)其他細胞，如肝淋巴細胞和肝星狀細胞（HSC）未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象[5]。本實驗結果顯示，采用高脂飲食誘導建立NAFLD 模型小鼠，分別在8、16、24 周觀察肝組織P21 mRNA 表達，結果發(fā)現(xiàn)P21 mRNA 在高脂16 周和24 周則較同期正常組顯著增強，提示肝細胞衰老發(fā)生聚集。

SIRT6 是近年來研究衰老的熱點[6]。NF-κB 是SIRT6 的下游調控分子，研究發(fā)現(xiàn)SIRT6 可與NFκB RELA 亞單位結合，促進NF-κB 靶基因啟動子H3K9 脫乙酰作用而發(fā)揮調控細胞增殖分化和抗細胞衰老的功能[7]。研究已證實SIRT6 可抑制NF-κB表達起到對人皮膚成纖維細胞、造血干細胞、心肌細胞的抗衰老作用[8-9]。

本實驗研究表明，在NAFLD 進展過程中，SIRT6 mRNA 在疾病早期（造模8 周）較正常組同期上調，而后期（造模24 周）則較正常組同期顯著下調，其疾病早期的上調，考慮NAFLD 小鼠為了抵抗氧化應激，代償性增高。隨著疾病的進展，SIRT6 基因的表達逐漸受到抑制，在后期顯著下降。NF-κB mRNA 在本實驗中隨著造模時間增加而稍有增強，但均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），我們推測NF-κB 基因，受多因素調控，在NAFLD 肝細胞的衰老中并不是主要激活路徑。

隨著NAFLD 進展，出現(xiàn)肝細胞衰老聚集現(xiàn)象，SIRT6 在疾病進展中出現(xiàn)特征性的先升高后降低趨勢，與NAFLD 疾病的發(fā)展機制相一致，由此我們推測，肝細胞衰老參與NAFLD 進程，SIRT6 基因在肝細胞衰老過程中起著重要作用。因此，通過干預SIRT6 基因，阻遏肝細胞衰老，可能成為NAFLD 治療的潛在靶點。