抑制素免疫對崇明白山羊公羔羊生殖發(fā)育的影響

葛 雷，李 垚，戴建軍，姚惠娟，張樹山，2，張德福，2

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106；2 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海201106；3 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海201306；4 上海交通大學醫(yī)學院，上海200025)

葛雷，李垚，戴建軍，等.抑制素免疫對崇明白山羊公羔羊生殖發(fā)育的影響[J].上海農(nóng)業(yè)學報，2020，36(4)：71-76

抑制素(Inhibin，INH)是一種由動物性腺分泌的糖蛋白激素，主要來源于睪丸支持細胞和卵巢顆粒細胞，可特異性作用于垂體，對基礎的卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)分泌和促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)刺激的FSH 分泌有抑制作用，且呈劑量依賴關系[1-2]。 抑制素還可以通過自分泌和旁分泌途徑直接作用于性腺而影響其功能[1]。 抑制素的分泌對維持睪丸正常生理功能起著重要作用，可以調(diào)節(jié)精子的發(fā)育和成熟。 抑制素免疫作為一種新型可增強動物繁殖性能的方法，可以中和動物體內(nèi)內(nèi)源性抑制素，減弱內(nèi)源性抑制素對FSH 的抑制作用，從而達到促進FSH 分泌的效果。 抑制素免疫在促進雌性動物排卵及提高胚胎質(zhì)量、增加產(chǎn)仔數(shù)上等方面的研究已取得重大成果[3-5]。

抑制素免疫的相關研究主要集中在其促進雌性動物排卵等方面，而對雄性動物生殖方面的影響研究相對較少，且研究結果存在差異[5]。 本試驗采用抑制素主動免疫崇明白山羊雄性斷奶羔羊，研究其對公羔羊體重、睪丸發(fā)育及激素水平等方面的影響，以期為抑制素免疫在雄性動物生殖中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的選擇及分組

實驗動物來自上海市農(nóng)業(yè)科學院草食動物試驗站，選取12 頭健康、斷奶的雄性崇明白山羊羔羊進行試驗，平均體重(15.25 ±2.22)kg，平均年齡(113.0 ±2.5)d。 隨機分為對照組和免疫試驗組，每組6 頭。

1.2 免疫流程及樣品采集

重組抑制素油乳劑由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院施振旦教授饋贈。 免疫時，對免疫組羔羊頸部肌肉注射含重組抑制素的油乳劑疫苗，劑量為1 mL∕只，抑制素質(zhì)量濃度為1 mg∕mL，注射當天記為第0 天。 在第21 天、第42 天、第63 天共進行3 次加強免疫。 對照組注射不含重組抑制素的油乳劑，注射劑量、時間及部位與免疫組相同。

在第0 天、第21 天、第42 天、第63 天及第84 天測量動物的體重(Body weight，BW)及陰囊(Scrotum circumference，SC)周長。 在第0 天、第21 天、第28 天、第42 天、第56 天、第63 天、第70 天、第77 天及第84 天頸靜脈采血，血液靜置6 h 后1 500 ×g離心15 min，收集血清，-80 ℃保存待測。

第84 天，閹割試驗羊，睪丸用生理鹽水清洗，清除附帶組織后稱取睪丸質(zhì)量(Testes weight，TW)。 切取適當大小的睪丸組織放入mDF 固定液中用于石蠟切片制作，部分組織裝入冷凍管，投入液氮中用于組織RNA 提取。

1.3 抑制素抗體檢測

抑制素抗體濃度用山羊抑制素α 抗體(Inhibin-α)ELISA 檢測試劑盒檢測。 試劑盒為卡邁舒(上海)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 睪丸組織切片及分析

睪丸組織石蠟切片及HE(Hematoxylin-eosin staining)染色委托上海長海醫(yī)院進行。 拍照后選取免疫組和對照組睪丸切片中形態(tài)完整、形狀較規(guī)則的生精小管切面，用Image-Pro Express 6.0 測量其管腔面積相對大小。 挑選免疫組和對照組管腔面積相近的生精小管，用Image-Pro Express 6.0 測定單個生精細管切面中精子細胞、支持細胞、精原細胞及管腔周圍間質(zhì)細胞的數(shù)量。

1.5 激素水平檢測

FSH、黃體生成素(Luteinizing hormone，LH)、睪酮(Testosterone，T)的濃度分別用Goat FSH ELISA Kit、Goat LH ELISA Kit 和Goat T ELISA Kit 進行檢測。 試劑盒均為上海潤裕生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.6 生殖相關基因相對表達量檢測

1.6.1 總RNA 的提取

采用北京全式金生物技術有限公司生產(chǎn)的TransZol Up Plus RNA Kit 提取睪丸組織總RNA。 所提取的RNA 的OD260nm∕OD280nm為1.8—2.0。

1.6.2 cDNA 的制備

使用北京全式金生物技術有限公司生產(chǎn)的TransScript ⅡOne-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.6.3 熒光定量PCR(qRT-PCR)

按照北京全式金生物技術有限公司生產(chǎn)的TransStart Top Green qPCR SuperMix 說明書進行試驗，以1 μL cDNA、F∕R 引物各0.4 μL、2 ×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL、ddH2O 8.2 μL 構建20 μL反應體系，在Roche Light Cycler96 儀器上檢測。 以GAPDH為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt計算免疫組內(nèi)基因相對于對照組表達水平，比較兩組間的差異。 qRT-PCR 的引物序列及相應退火溫度(Tm)見表1。

表1 qRT-PCR 引物序列及退火溫度(Tm)Table 1 Primer sequences and annealing temperature(Tm)of qRT-PCR

1.7 統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以“均值±標準差”的形式表示，組間差異用方差分析法，P＜0.05或P＜0.01 表示差異顯著或極顯著。

2 結果與分析

2.1 抑制素抗體水平

如圖1 所示，從第21 天開始，免疫組動物血清抗體濃度顯著或極顯著高于對照組。 整個試驗期間，免疫組抑制素抗體水平均顯著高于對照組。

2.2 抑制素免疫對體重、陰囊周長及睪丸質(zhì)量的影響

從表2 可以看出，從第21 天開始，免疫組動物的體重增長速度較對照組變緩，但兩組之間并無顯著差異。第42 天起，免疫組動物陰囊周長增長速度較之前變緩，并且在第63 天開始低于對照組，但兩組之間無顯著差異。

表2 免疫組和對照組動物體重及陰囊周長變化Table 2 Changes of BW and SC in immunized group and control group

由表3 可以看出，在試驗第84 天，免疫組動物陰囊周長、睪丸質(zhì)量及體重與對照組之間無顯著差異，動物睪丸質(zhì)量和體重比值也無顯著差異。

表3 第84 天陰囊周長、睪丸質(zhì)量、動物體重及睪丸質(zhì)量/體重的比值Table 3 SC,TW,BW and TW/BW ratio of Chongming white goat on the 84th day

2.3 睪丸組織切片

如圖2 所示，免疫組和對照組白山羊睪丸組織形態(tài)學上并沒有顯著的差異，生精小管內(nèi)壁光滑，管腔內(nèi)均可見精子細胞。 比較免疫組和對照組的睪丸生精小管的管腔切面面積，發(fā)現(xiàn)兩者沒有顯著差異，管腔切面內(nèi)精子細胞、支持細胞、精原細胞及管腔周圍的間質(zhì)細胞計數(shù)也沒有顯著差異(表4)。

表4 單個生精小管管腔切面相對面積及其內(nèi)精子細胞、支持細胞、精原細胞和周圍間質(zhì)細胞的數(shù)量Table 4 The relative lumen area of single seminiferous tubule and the number of spermatocytes,sertoli cells,spermatogonia and peripheral stromal cells in a single seminiferous tubule

2.4 抑制素主動免疫對崇明白山羊公羔羊體內(nèi)激素分泌的影響

如圖3 所示，免疫后，免疫組FSH 及T 激素水平有上升趨勢，在二免后7 d，即第28 天達到峰值，并顯著高于對照組。 在三免(第42 天)后，即第42—56 天，免疫組FSH 及T 激素水平也有上升趨勢，但與對照組之間沒有顯著差異。 之后，兩組FSH 和T 水平呈波動變化，無顯著差異。

抑制素主動免疫崇明白山羊?qū)ζ銵H 的分泌并無顯著影響。 二免、三免后免疫組LH 激素水平有小幅上升趨勢，但與對照組無顯著差異。

2.5 抑制素主動免疫對崇明白山羊公羔羊生殖相關基因表達的影響

如圖4 所示，免疫組試驗羊睪丸組織染色體聯(lián)會相關基因Dmrtc2 基因表達量極顯著高于對照組(3.04 vs 1.00)；性腺發(fā)育相關基因SOX30 表達量顯著高于對照組(1.48 vs 1.00)；雄激素受體基因AR表達量顯著低于對照組(0.59 vs 1.00)。 而免疫組和對照組之間FSHR(FSH 受體基因)、LHR(LH 受體基因)、GPx4(精子發(fā)生相關基因)以及DDX4(減數(shù)分裂相關基因)表達量兩組之間沒有顯著差異(1.03 vs 1.00；1.02 vs 1.00；0.83 vs 1.00；0.81 vs 1.00)。

3 討論與結論

抑制素是一種主要來源于雄性動物睪丸支持細胞和雌性動物卵巢顆粒細胞的糖蛋白激素，其主要生理作用是與激活素共同調(diào)控FSH 的合成與分泌[6]。 在雄性動物體內(nèi)，抑制素主要來源于睪丸，而睪丸以外的副性腺等部位也能分泌低濃度抑制素，并可能通過自分泌或旁分泌的形式發(fā)揮作用，與睪酮共同抑制FSH 的分泌，對精子發(fā)生等方面進行調(diào)控，從而影響公畜繁殖力[7-9]。

抑制素對FSH 具有反饋性抑制作用，抑制素免疫可以降低動物內(nèi)源性抑制素水平，從而解除抑制素對FSH 的抑制作用，達到提高FSH 水平的效果，從而增加雌性動物卵泡數(shù)量，提高排卵率[10-12]。 試驗發(fā)現(xiàn)，抑制素免疫可以顯著提高崇明白山羊體內(nèi)抑制素抗體水平。 抑制素免疫對雄性動物的相關研究結果并不一致，有研究表明抑制素免疫有利于提高牛及山羊的精子數(shù)量、精子密度及活力，降低精子畸形率，從而提高繁殖力[13]；但Voge 等[14-15]在6 月齡公羔羊上的研究發(fā)現(xiàn)，抑制素免疫對羔羊體重、陰囊周長及睪丸質(zhì)量均沒有顯著影響，對血清FSH、LH 和T 水平也沒有顯著影響，本試驗結果與其基本一致。 本試驗發(fā)現(xiàn)，二免后免疫組血清FSH 及T 水平較對照組出現(xiàn)短暫顯著上升現(xiàn)象，而其余時間點FSH 及T 水平兩組之間并沒有顯著差異，可能是由于抑制素免疫降低內(nèi)源性抑制素水平，從而提高了FSH 水平；T 升高的原因可能是由于在內(nèi)源性抑制素水平降低后，T 需要增強其對FSH 的抑制作用；抑制素疫苗注射或免疫后，重復免疫可造成動物對疫苗的敏感性降低，無法起到降低內(nèi)源性抑制素水平的效果，故免疫后期FSH 水平并沒有顯著上升。

Dmrtc2 基因又名Dmrt7 基因，作為Dmrt 基因家族中重要的一員，其只在哺乳動物性腺中存在并表達，在減數(shù)分裂粗線期和雙線期之間雄性特有的性染色體聯(lián)會過渡中扮演關鍵角色[16-18]，故Dmrtc2 基因在精子發(fā)生過程中起著重要作用。SOX30 基因是SOX核轉(zhuǎn)錄因子基因超家族成員，在整個動物界普遍存在，其主要在睪丸生殖細胞和支持細胞中表達，可能參與了性腺發(fā)育、精原細胞分化和精子形成過程[19]。本試驗顯示，免疫組睪丸內(nèi)Dmrtc2 基因和SOX30 基因表達水平分別極顯著和顯著高于對照組，說明抑制素對公羔羊性腺及精子的發(fā)生、發(fā)育有促進作用。 雄激素受體(AR)作為雄激素發(fā)揮生理作用的重要載體，其基因水平限制雄激素的生理功能，從而影響動物性生理的發(fā)育[20]。 然而本試驗顯示，免疫組AR基因的表達水平顯著低于對照組，表明抑制素免疫對公羔羊發(fā)育起一定抑制作用，相關原因仍需進一步研究闡明。 FSH 和LH 需要分別通過各自受體基因FSHR和LHR方能發(fā)揮其生理功能[21]，本試驗發(fā)現(xiàn)免疫組和對照組間FSHR和LHR基因表達水平并無顯著差異，說明抑制素免疫并不通過影響FSH 和LH 的分泌來影響公羔羊生殖發(fā)育。GPx4 基因是GPxs家族的成員，其在睪丸中高度表達并在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[22]。DDX4 基因是DEAD-box基因家族的重要成員，在哺乳動物中僅在生殖細胞系中特異性表達，表達產(chǎn)物是精子發(fā)生的必需蛋白，與精子發(fā)生減數(shù)分裂密切相關[23]。 本試驗發(fā)現(xiàn)抑制素免疫不會影響GPx4 和DDX4 基因的表達水平。

此外，對睪丸組織石蠟切片的觀察發(fā)現(xiàn)，免疫組和對照組睪丸組織在結構上并沒有明顯差異，生精小管管腔面積、管腔內(nèi)各種細胞的數(shù)量均沒有顯著差異。 抑制素免疫對公羔羊生殖系統(tǒng)的影響是相當復雜的，很可能是促進與抑制的共同作用，具體機制還有待進一步研究。

綜上，抑制素免疫雖可以顯著提高崇明白山羊雄性斷奶羔羊血清抑制素抗體水平、睪丸Dmrtc2 和SOX30 基因的表達水平，降低睪丸AR基因的表達水平，并在二免后短暫提高血清FSH 及T 激素水平，但并不影響體重、陰囊周長、睪丸大小及組織結構、睪丸FSHR、LHR、GPx4 及DDX4 基因的表達水平。