紅松根腐病病原的鑒定與檢測1)

張平 刁健 王立海

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

紅松(Pinuskoraiensis)是著名的經(jīng)濟樹種之一，木材具有紋理直、材質(zhì)輕等特點，2013年被列入《世界自然保護聯(lián)盟》(IUCN)瀕危物種紅色名錄ver3.1-低危[1]。除此之外，紅松還具有重要的生態(tài)價值，屬于所在森林系統(tǒng)中的頂級群落，為重要的支撐樹種[2-3]。由于生態(tài)惡化和溫暖潮濕的環(huán)境導(dǎo)致紅松病害頻繁發(fā)生，例如由奧氏蜜環(huán)菌(Armillariasolidipes)引起紅松干基腐朽病[4]。通過林業(yè)技術(shù)措施、改善不良生長環(huán)境，以及適時使用殺菌劑等方法可以控制大部分病害[5]。但是，如果對于新的病害無法正確鑒定病原菌則很難找到合適的防控方法[6]。2018年，在中國黑龍江省伊春市和黑河市紅松苗圃地相繼發(fā)生1種病害，該病害發(fā)病速度快，數(shù)天內(nèi)可造成大量的紅松幼苗死亡，目前還沒有較好的防治方法來阻止其傳播?；谧畛醯呐袛?，蜜環(huán)菌被認(rèn)定為是致病菌。但通過形態(tài)學(xué)觀察，該病原菌顯示大分生孢子和瓶梗狀產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)與尖孢鐮刀菌集合群(FOSC)特征相似[7-8]。對病害的管理和防治需要對致病菌進行可靠地鑒定與檢測。分子生物學(xué)技術(shù)，特別是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，為多種植物病原菌和許多土傳性病害的診斷和檢測提供了一個靈敏的方法[9]。一些基因區(qū)域，如內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和翻譯延長因子(TEF1-α)都可以用于識別和區(qū)分鐮刀屬真菌[10]。FOSC中的各個成員在世界廣泛分布，已知報道的有500多種，常造成園藝作物重大經(jīng)濟損失[11]。實際上，F(xiàn)OSC中的一些成員可以同時侵染多種植物，如茄鐮孢菌(Fusariumsolani)可以引起番茄(Lycopersiconesculentum)、西瓜(Citrulluslanatus)、大豆(Glycinemax)病害。有些鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的毒素，嚴(yán)重威脅人畜健康[12-13]。因此，本研究的目的是分離、鑒定和測定分離物對紅松盆栽苗的致病力，通過PCR技術(shù)區(qū)分紅松上的致病菌與其他真菌，并尋找病原菌的傳播來源。

1 材料與方法

材料：馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)參考Fall et al.[12]的制作方法，將200 g馬鈴薯洗凈去皮后切成小塊，加入蒸餾水1 000 mL，加熱煮沸，過濾，加入15 g瓊脂粉和20 g葡萄糖，溶解后分裝至500 mL容量瓶。主要試劑有真菌DNA提取試劑盒(Omega Bio-Tek公司D3690)、膠回收試劑盒(北京天根公司DP204)。

病樣采集及癥狀觀察：紅松病樣組織從伊春和黑河市的露天苗圃地采集，采集后立即裝入塑料袋，并在冰盒中保存。共收集17個樣本(伊春12個，黑河5個)。采集的紅松病樣具有典型發(fā)病癥狀，表面可見明顯的病斑，觀察并記錄病害癥狀，包括發(fā)病部位、病斑顏色、大小。

病原菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察：采用組織分離法[14]，用無菌解剖刀從病健交界處切取5～10 mm的病斑，用體積分?jǐn)?shù)0.05% NaClO表面消毒1 min，體積分?jǐn)?shù)70%酒精消毒3 min，最后用無菌蒸餾水清洗3次。無菌吸水紙進行干燥后收集病組織，一部分儲存在冰箱中(-20 ℃)用于DNA的提取，一部分用于病原菌的分離。對照試驗來源于未發(fā)病的健康組織，處理方式與病斑處理方式相同。參考劉瑞玲等[15]方法，將消毒后的紅松病組織放置在PDA平板中，平板置于26 ℃、黑暗培養(yǎng)5 d。挑取邊緣菌絲，通過傳代培養(yǎng)方式進行菌株純化，直到形成單一的菌落。最后，觀察并記錄PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征，分別在普通光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡下觀察菌絲、分生孢子、分生孢子梗等。

致病性測定：將所有分離物進行致病性測定，紅松種子表面用體積分?jǐn)?shù)0.05% NaClO消毒20 min，在經(jīng)過高壓濕熱滅菌(121 ℃，2 h)的土壤里播種，出苗后每盆保留1株苗。紅松在溫室25 ℃、70%的相對濕度和光周期(14L∶10D)的條件下培養(yǎng)5個月。每15 d澆1次水。隨后進行致病性測定，將從紅松病組織中分離得到的菌株，接種到PD培養(yǎng)液中，28 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)8 d，以達到最大產(chǎn)孢量。使用無菌水將孢子稀釋為2.5×108菌落·mL-1(OD600)，將孢子懸浮液注射到土壤中，每盆5 mL。以注射5 mL無菌水為空白對照。將紅松苗轉(zhuǎn)移至生長室，在25 ℃、80%的相對濕度和光周期(16L∶8D)的條件下生長，每天觀察并記錄發(fā)病情況。對真菌菌落和苗木根周腐爛壞死組織進行PCR分析，以確定病原菌的一致性。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)20株苗。

病原真菌分子生物學(xué)鑒定：用無菌刀片刮取在PDA培養(yǎng)5 d的真菌菌絲，用于DNA提取。所有植物組織和菌絲用液氮充分研磨后使用真菌DNA提取試劑盒提取。DNA質(zhì)量濃度用紫外分光光度計測量(Thermofisher A30221美國)，用無菌水將DNA稀釋最終質(zhì)量濃度為50 mg·L-1，用于進一步的PCR反應(yīng)。ITS基因引物為ITS1F，5′CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；ITS4R，5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR擴增參數(shù)為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。TEF-α基因引物為TEF1αF，5′ATGGGTAAGCARGACAAGAC-3′；TEF1αR，5′-GGARGTACCAGTSATCATCGCT-3′。PCR擴增參數(shù)為94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸1 min。擴增后產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序，測序序列在GenBank中進行Blast比對，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 危害及癥狀

通過在伊春和黑河市的紅松苗圃地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，紅松發(fā)病初期地下部分根部(圖1A)和種子(圖1B)表皮最先皺縮、出水、腐爛，表面可見白色菌絲體，芽不能正常出土，最終枯死。地上部分葉尖初期黃化，隨后逐漸褐變、干枯(圖1C)，葉片不脫落，不能正常展葉，潮濕天氣下，葉尖部位產(chǎn)生白色菌絲體(圖1D)，逐漸下移，最終導(dǎo)致植物枯萎死亡(圖1E)。若不加以防治，從首次觀察到病斑至15 d，紅松植株會死亡。

2.2 分離物培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征

從具有紅松根腐病典型癥狀的樣本中分離得到15株分離物，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征將這些分離物分為一類，選擇具有代表性的1株菌用于后續(xù)試驗，命名為TZ3。菌株TZ3在PDA培養(yǎng)基上初期為白色棉絮狀菌落，后期變成淺紅色，背面有紫紅色色素產(chǎn)生(圖2A和2B)。氣生菌絲上產(chǎn)孢，孢子著生于長筒形單瓶梗(圖2C)。厚垣孢子球形，單生，直徑6.5～12.5 μm(圖2D)。大型分生孢子鐮刀形，月牙形，稍彎或彎曲，兩端逐漸變尖，有隔膜，大小為(19.1～45.1)μm ×(2.5～6.4)μm(圖 2E)。

2.3 致病性

將菌株TZ3接種到健康植株后，對照植物正常展葉，根部淺褐色(圖3A)，而處理組植株發(fā)病癥狀與原發(fā)病植株相同。地下部芽和根部發(fā)生腐爛，布滿白色菌絲(圖3B和3C)。第2～3天所有接菌植株的根部均出現(xiàn)腐爛。7 d后，出現(xiàn)萎蔫，由根部向地上莖部擴展，表面可見少量的白色菌絲體(圖3D、E)。地上部葉片萎蔫，不能正常展葉(圖3F)，葉尖褪綠，但未見菌絲體(圖3G)。從腐爛組織周圍取樣分離出的真菌，接種后植株再次發(fā)病癥狀與本次發(fā)病癥狀相同，符合柯赫氏法則。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

使用真菌引物ITS1F/ITS4R對菌株TZ3 DNA擴增后可以得到525 bp大小的產(chǎn)物(圖4A)，進行克隆和測序后，得到的DNA序列提交到NCBI獲得登錄號MK791651，與GenBank進行比對后，第1組中525 bp的條帶序列與尖孢鐮刀菌(登錄號KT803066.1，DQ984712.1)在同一分之，支持率為99%(圖5A)。為了進一步驗證ITS測序結(jié)果的可靠性，利用真菌引物TEF1αF/TEF1αR進行第2次PCR擴增。菌株TZ3得到1條972 bp大小的條帶(登錄號MK818444)(圖4B)。第2組中972 bp的(圖4B)條帶序列與尖孢鐮刀菌(登錄號EU246584.1)在同一分支，支持率為98%(圖5B)。第2組的測序結(jié)果與真菌通用引物ITS1F/ITS4R的鑒定結(jié)果一致。綜合以上測序結(jié)果將菌株TZ3鑒定為尖孢鐮刀菌。

3 討論

鐮刀菌屬真菌能夠引起多種寄主產(chǎn)生病害，準(zhǔn)確識別病原對于病害的防治至關(guān)重要。傳統(tǒng)的形態(tài)特征觀察不能準(zhǔn)確區(qū)分FOSC中具體的種類[18-19]，并且該屬真菌的培養(yǎng)特性易受環(huán)境等因素影響[20]。在這種情況下，通過分子手段檢測和區(qū)分病原菌具有重要意義[21-23]。本研究最初通過通用引物ITS基因?qū)⒎蛛x物鑒定為鐮刀菌屬真菌，而無法鑒定到具體的種水平。后續(xù)通過設(shè)計TEF基因引物，2輪擴增比對后得出引起紅松根腐病的病原菌與尖孢鐮刀菌在同一系統(tǒng)進化分支。國內(nèi)外許多研究報道中，通過設(shè)計基因位點引物，例如TEF、IGS、EF1等，用于鐮刀菌屬真菌種水平的鑒定[24-26]。除此之外，可通過PCR技術(shù)對混合樣品中的目標(biāo)菌和類似真菌進行區(qū)分，用于尋找病害的傳播來源[27-29]。本研究中，在伊春市和黑河市發(fā)病紅松苗圃地土壤中能夠檢測到尖孢鐮刀菌的存在，這表明菌源來自苗圃地的土壤。

目前，國內(nèi)已知報道的紅松病害有5種，分別為紅松爛皮病(Cenangiumferruginosurn)、根朽病(Armillariellamellea)、流脂潰瘍病(Tympanisconfusa和Leucostomakunnc)和皰銹病(Cronartiumribicola)[30]。但對紅松根腐病的研究較少，還沒有關(guān)于尖孢鐮刀菌引起紅松根腐病的相關(guān)報道。本研究從伊春市和黑河市的病害樣本中分離出真菌TZ3，經(jīng)過形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)技術(shù)將該菌鑒定為尖孢鐮刀菌，致病性試驗中發(fā)現(xiàn)該菌可以導(dǎo)致紅松盆栽苗枯萎、死亡。經(jīng)過柯赫氏法則驗證，證實尖孢鐮刀菌是導(dǎo)致苗圃地紅松根部腐爛、枯萎和死亡的致病菌。此外，PCR技術(shù)是用于快速檢測紅松根腐病病原菌的一種有利的工具，在播種前對苗圃地土壤進行檢測是防止該病害擴散最合理有效的方法。本研究結(jié)果可為紅松根腐病的防治、抗病育種提供參考。